原位雜交操作流程

冰凍切片的（DIG-labeledRNAprobe）原位雜交操作程序一、

切片制備用新鮮組織制作6μm厚冰凍切片，37℃干燥1～4小時，進行下一步操作。二、

預(yù)雜交前處理預(yù)固定：4%PFA（inDEPC-PBSPh7.4）RT30～60min4%PFA：多聚甲醛20g1×PBS450ml

加熱（60℃、20min）溶解冷卻后調(diào)pH至7.41×PBS→500mlPBSRT5min×210×PBS：500mlNaCl40gKCl1gKH2PO41gNa2HPO47.7gDEPC水450ml

調(diào)Ph至7.5DEPC水加至500mlPBS(含0.3%v/vTritonX-100)RT15min臨用前配制

10%TritonX-10015ml1×PBS→500mlPBSRT5min×2第1頁/共24頁第一頁，共25頁。消化：2μg/mlProteinaseKinTEbuffer37℃10minTE：

pH8.0Tris-HCl1M5mlpH8.0EDTA0.5M1mlDEPC水→500ml0.2%GlycininPBSRT5min×2

(50xDenhart’s;

Ficoll400聚蔗糖1g后固定：4%PFAinPBSRT15minPVP聚乙烯基吡咯烷酮1g

BSA牛血清白蛋白1g

DEPC水100ml）

PBSRT3min×2

0.1

M三乙醇胺（TEA）/0.25%乙酸酐RT5min×2

0.1M三乙醇胺：三乙醇胺2.64mlDEPC水200ml

用前加入乙酸酐500μlPBSRT5min×2第2頁/共24頁第二頁，共25頁。三、

預(yù)雜交預(yù)雜交

50℃2h預(yù)雜交液：50%去離子甲酰胺

5×SSC5×Denhardt’s0.02%SDS0.1mg/mltRNA四、

雜交雜交

50℃12h以上第3頁/共24頁第三頁，共25頁。

五、

雜交后處理2×SSC脫去蓋膜（片）50℃2×SSC清洗37℃10min×220μg/mlRNaseAinRnsaebuffer37℃30minRnsaebuffer;2MTris5ml0.25MEDTA4ml3MnaCl167mlpH8.0DW→1000mlRnasebuffer37℃30min

2×SSC50℃15min×2

1×SSC（含0.02%SDS）37℃15min×25%SDS2ml

1×SSC500ml0.1×SSC37℃15min×2

第4頁/共24頁第四頁，共25頁。BufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ:2MTris-HClPh7.625ml3MNaCl25mlD.W.→500ml封閉；0.5%抗體阻斷液inBufferⅠ（含0.2%Tween20）

37℃20min抗體阻斷液:

(1:500抗地高辛抗體in阻斷液37℃2h)阻斷劑1gTween-200.4ml

BufferⅠ37℃10min×2BufferⅠ200ml

BufferⅡ37℃10min×2第5頁/共24頁第五頁，共25頁。

顯色；BufferⅡ:2MTris10ml（1:50NBT/BCIPStockSolutioninBufferⅡ2~24h）3MNaCl6.67ml

MgCl22.033g（濕合、避光）

D.W.180ml

濃HCl調(diào)pH至9.5D.W.→200ml終止反應(yīng)：

BufferⅢRT5min×2

流水沖洗

5-10min

1%甲基綠復(fù)染3-10min，

水洗，晾干，封固第6頁/共24頁第六頁，共25頁。DNA探針檢測石蠟

切片中DNA第7頁/共24頁第七頁，共25頁。組織標(biāo)本肝穿刺組織，常規(guī)石蠟包埋，4m連續(xù)石蠟切片，貼在涂有切片粘合劑的干凈載玻片上，58℃烤18h。第8頁/共24頁第八頁，共25頁。試劑1．20×SSC2．HBVcDNA-Dig探針5g3．4％多聚甲醛4．0.1mol/LPBS，pH7.45．0.2mmol/LHCl和0.1mol/L甘氨酸PBSpH7.46．0.4％TritorX-100PBSpH7.47．蛋白酶

20g/ml8．0.25％乙酸酐，用0.1mol/L三乙醇胺配制9．預(yù)雜交緩沖液和雜交緩沖液10.AKP標(biāo)記抗DigFab段二抗，可1:500稀釋11.TSM、TSM2（配制參閱附錄4）12.NBT和BCIP顯色液或用AKP顯色Kit

第9頁/共24頁第九頁，共25頁。操作流程雜交前處理預(yù)雜交雜交雜交后漂洗雜交后檢測結(jié)果判斷第10頁/共24頁第十頁，共25頁。雜交前處理1.石蠟切片常規(guī)脫蠟至水2.0.02MpH7.4PBS洗3×3min3.0.2MHCI20min室溫（除去蛋白）4.2×SSC（內(nèi)含5MEDTA）50℃洗30min5.蛋白酶

2g/ml37℃20min6.0.1M甘氨酸PBS洗10min室溫，中止酶反應(yīng)7.4％多聚甲醛，20min室溫8.PBS洗3×3min9.75％，85％，95％和無水乙醇各2min第11頁/共24頁第十一頁，共25頁。預(yù)雜交和雜交

加預(yù)雜交液20l/每片，42℃2h。

加雜交液10～20ul/每片（內(nèi)含HBV-cDNADig標(biāo)記探針4g/ml），加蓋硅化玻片，將切片置于95℃10min，使探針和靶病毒DNA雙鏈打開（變性），然后迅速置于冰上5min，再將切片置于盛有2×SSC濕合內(nèi)，42℃雜交過夜(12～16h)。第12頁/共24頁第十二頁，共25頁。雜交后漂洗1.將切片置于2×SSC液內(nèi)振動移去蓋片2.2×SSC洗2×10min，55℃3.0.5×SSC2×5min，50℃4.PBS洗3×3min5.10％醋酸20min室溫，阻斷內(nèi)源性堿性磷酸酶6.PBS洗3×3min第13頁/共24頁第十三頁，共25頁。信號放大和顯示1.1:500稀釋AKP標(biāo)記抗Dig二抗，37℃4h，或4℃過夜2.PBS洗3×3min3.TSM1洗2×5min4.TSM2洗2×5min5.顯色液在1mlTSM2中加入4.5lNBT，3.5l，BCIP

混合后，顯色30min～12h，中間不斷觀察6.TSM2洗，PBS洗3×3min，核固紅或甲基綠襯染7.蒸鎦水洗，系列乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片第14頁/共24頁第十四頁，共25頁。結(jié)果判斷

第15頁/共24頁第十五頁，共25頁。ISH流程探針合成組織細胞標(biāo)本的準(zhǔn)備ISH試劑的配制操作流程第16頁/共24頁第十六頁，共25頁。探針1、根據(jù)文獻報道合成PCR引物一對。

2、PCR擴增：用高保真DNA聚合酶進行PCR擴增。第17頁/共24頁第十七頁，共25頁。3、將PCR擴增產(chǎn)物亞克隆入pGEM2Z質(zhì)粒（EcoRI和ACCI酶切位點），在大腸桿菌中擴增，純化。原理：PGEM3質(zhì)粒購于promega公司，含有位于pUc19MCS側(cè)面的SP6和T7RNA聚合酶啟動子，在將所需序列插入MCS后，一個簡單的基于lacZα-肽滅活的顏色選擇方案將促進重組體的篩選。在體外，將SP6或T7RNA聚合酶加入到含有標(biāo)記物的三磷酸核苷前體的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)中，可允許從任何一方向產(chǎn)生多拷貝DNA插入序列的標(biāo)記RNA探針。第18頁/共24頁第十八頁，共25頁。4、

利用Roche生產(chǎn)的體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNAkit（Cat.No999644）操作流程參閱《原位檢測技術(shù)》p132-133。第19頁/共24頁第十九頁，共25頁。

組織細胞標(biāo)本的準(zhǔn)備

ISH試劑的配制（所有試劑和用具均用DEPC水處理）第20頁/共24頁第二十頁，共25頁。操作流程11、活細胞經(jīng)4％多聚甲醛固定20min，室溫，PBS