在大腸桿菌內(nèi)引入甲羥戊酸途徑高效合成抗瘧藥青蒿素前體-紫穗槐-4,11-二烯課件

在大腸桿菌內(nèi)引入甲羥戊酸途徑高效合成抗瘧藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11-二烯合成生物學(xué)：一門生物學(xué)與工程學(xué)交叉的前沿學(xué)科,以生命科學(xué)理論為指導(dǎo),以工程學(xué)原理進(jìn)行遺傳設(shè)計(jì)、基因組改造(重組染色體)和（或）合成以及人造細(xì)胞合成。其中,基因組改造(重組染色體)和（或）合成是關(guān)鍵。2010年5月20日,以克雷格·文特爾為首的美國科學(xué)家,在Science上公布了人類歷史上創(chuàng)造出首個(gè)“人造單細(xì)胞生物”的消息，以這項(xiàng)成果為代表的合成生物學(xué)(syntheticbiology,Synbio)也就受到了前所未有的關(guān)注。合成生物學(xué)如何創(chuàng)造生命用A、G、C、T為代表的化學(xué)物質(zhì)人工合成DNA(脫氧核糖核酸)片段,由DNA片段合成基因,再由基因組合成生物模塊,然后裝配成“人造基因組”,最終在實(shí)驗(yàn)室里創(chuàng)造出全新生物體。合成生物學(xué)與大腸桿菌

合成生物學(xué)中的底盤生物是合成生物學(xué)的“硬件”基礎(chǔ)。大腸桿菌(Escherichiacoli)作為最簡單的模式生物，由于其背景清晰、生長快速、易于操作，在基礎(chǔ)生物研究以及生物技術(shù)應(yīng)用方面有著其他模式生物無可比擬的優(yōu)越性。大腸桿菌已經(jīng)成為能源、化合物、材料及藥物生產(chǎn)的重要平臺(tái)，合成生物學(xué)的發(fā)展促進(jìn)了大腸桿菌代謝途徑的重建，通過精確設(shè)計(jì)基因環(huán)路、重構(gòu)代謝途徑為大腸桿菌提供了新的代謝和生理功能，使其能夠高產(chǎn)天然甚至非天然產(chǎn)物。在過去的十年里，基于大腸桿菌的系統(tǒng)生物學(xué)得到了迅猛發(fā)展。青蒿分布地域狹窄,青蒿素含量低(0.01%~0.5%).化學(xué)合成青蒿素產(chǎn)率不理想,成本高.隨著全球瘧疾發(fā)病率(3.8億人/年)和死亡率(4600萬人/年)逐年升高,青蒿素類抗瘧藥需求量迅猛增長,導(dǎo)致青蒿素原料藥供不應(yīng)求,市場價(jià)格飆升.近10年來,為了從根本上解決青蒿素的供需矛盾,國內(nèi)外爭相開展了青蒿素合成生物學(xué)及代謝工程研究,一方面嘗試在微生物體內(nèi)重建青蒿素生物合成途徑,另一方面對青蒿中原有的青蒿素生物合成途徑進(jìn)行遺傳改良大腸桿菌與青蒿素前體大腸桿菌內(nèi)存在以脫氧木酮糖磷酸(Deoxyxylulose-5-phosphate，DXP)途徑為基礎(chǔ)的類異戊二烯代謝途徑，能合成少量的輔酶Q等。故大腸桿菌非常適合作為生物合成類異戊二烯化合物的宿主菌。本研究在大腸桿菌中引入人工合成的紫穗槐-4,11-合酶基因并構(gòu)建原核的糞腸球菌Enterococcusfaecalis來源的MVA途徑，獲得了抗瘧藥青蒿素前體——紫穗槐-4,11-二烯的高表達(dá)。這種微生物半合成青蒿素的方法——先通過改造微生物合成途徑獲得青蒿素的前體紫穗槐-4,11-二烯或青蒿酸等，再采用相對簡單的化學(xué)催化步驟可將這些前體轉(zhuǎn)化成青蒿素，可以大規(guī)模制備青蒿素，解決資源短缺問題?；舅悸罚菏紫仍诖竽c桿菌EscherichiacoliDHGT7中引入人工合成的紫穗槐-4,11-二烯合酶基因，利用大腸桿菌內(nèi)源的法尼基焦磷酸，成功獲得了紫穗槐-4,11-二烯。為提高前體供給，引入糞腸球菌的甲羥戊酸途徑，紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量提高了13.3倍，達(dá)到151mg/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)限制酶，分別是紫穗槐-4,11-二烯合酶、HMG-COA還原酶和甲羥戊酸激酶；通過調(diào)節(jié)這些酶的水平，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量提高了7.2倍，在搖瓶中達(dá)到235mg/L。1.載體構(gòu)建、目的基因表達(dá)采用常用分子克隆技術(shù)，如PCR擴(kuò)增、酶切、連接和轉(zhuǎn)化等構(gòu)建質(zhì)粒表達(dá)載體。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌E.coliDHGT7，接入含相應(yīng)抗生素(Kn、Cm均為25μg/mL)的液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600=0.3~0.4，加入0.2％L-阿拉伯糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4~5h。取菌體全蛋白作SDS分析,以pET28a為對照。結(jié)果在約56kDa處有可見的紫穗槐-4,11-二烯合酶(ADS)的條帶。GC-MS法測定AD含量新轉(zhuǎn)化的菌株pET28-ADS/DHGT7進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，采用GC-MS法測定紫穗槐-4,11-二烯的含量。通過GC檢測，分別在8.42min和8.83min出現(xiàn)內(nèi)標(biāo)物石竹烯(IS)和紫穗槐-4,11-二烯(AD)的保留峰。根據(jù)內(nèi)標(biāo)石竹烯的濃度對樣品AD含量進(jìn)行定量，結(jié)果搖瓶培養(yǎng)48h的紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量僅為11.3mg石竹烯當(dāng)量/L。我們推測大腸桿菌內(nèi)源的FPP水平太低，限制了紫穗槐-4,11-二烯的產(chǎn)量，因此提高胞內(nèi)FPP水平是提高紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量的關(guān)鍵。由于大腸桿菌僅存在DXP途徑，為避免對內(nèi)源途徑的影響，后面引入了異源的MVA途徑來提高前體供給。3.構(gòu)建異源MVA途徑以低拷貝質(zhì)粒pACYCDuet-1的骨架為基礎(chǔ)，PCR擴(kuò)增質(zhì)粒pET3b的多克隆位點(diǎn)(MCS)，并通過PCR引物引入NotⅠ和ApaⅠ限制性酶切位點(diǎn)，將PCR擴(kuò)增的MCS序列連接到pACYCDuet-1的SphⅠ和EcoRⅠ之間，構(gòu)建了具有特殊MCS的質(zhì)粒載體pAOC3ANL，用于多基因合成途徑的構(gòu)建。將糞腸球菌來源的mvaE、mvaS、MD和ispA與ADS分別構(gòu)建在質(zhì)粒載體pAOC3ANL和pET28a上，得到表達(dá)載體pAOC3-ES-MD和pET28-ispA-ADS，共轉(zhuǎn)化E.coliDHGT7，搖瓶培養(yǎng)48h，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量達(dá)到151mg/L，是利用內(nèi)源FPP的13.3倍。4.優(yōu)化紫穗槐-4,11-二烯合成途徑將整個(gè)紫穗槐-4,11-二烯合成途徑的基因構(gòu)建到單個(gè)質(zhì)粒載體pAOC3ANL上，得到表達(dá)載體pAOC3-ES-MD-ispA-ADS(圖4），轉(zhuǎn)化E.coliDHGT7，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量為32.5mg/L，僅為使用2個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)時(shí)的1/5，菌體的生長也受到嚴(yán)重抑制(圖5A)。推斷這是因?yàn)楫?dāng)使用2個(gè)質(zhì)粒共表達(dá)時(shí)ADS是構(gòu)建在高拷貝的pET28a上，而以單個(gè)質(zhì)粒表達(dá)時(shí)ADS是構(gòu)建在低拷貝的pAOC3ANL上，間接地降低了ADS的拷貝數(shù)，使得胞內(nèi)FPP累積，引起內(nèi)源FPP合成途徑的反饋調(diào)控作用，從而抑制菌體生長。HMG-CoA還原酶是類異戊二烯化合物生物合成過程中的關(guān)鍵酶，其活性不足會(huì)導(dǎo)致HMG-CoA在胞內(nèi)累積產(chǎn)生毒性。因此，我們提高HMG-CoA還原酶水平，構(gòu)建了表達(dá)載體pET28-E-ADS，pAOC3ES-MD-ispA-ADS共轉(zhuǎn)化E.coliDHGT7，結(jié)果菌體生長抑制得到進(jìn)一步緩解，紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量也再次提高。另外，提高胞內(nèi)甲羥戊酸激酶(MK)的水平可以極大地提高紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量。因此我們構(gòu)建了表達(dá)載體pET28-E-MK-ADS，與pAOC3-ES-MD-ispA-ADS共轉(zhuǎn)化E.coliDHGT7，結(jié)果紫穗槐-4,11-二烯產(chǎn)量達(dá)到235mg/L，是優(yōu)化前的7.2倍，菌體生長抑制基本消除。

展望

近10年來,青蒿素合成生物學(xué)進(jìn)展速度驚人,通過微