實驗一 蛋白質(zhì)的定量測定

實驗一蛋白質(zhì)的定量測定

——Folin-酚試劑法(Lowry法)實驗室規(guī)則一、學(xué)生必須服從老師的指導(dǎo)，按照實驗?zāi)康?、要求和方法做好充分?zhǔn)備，進行實驗。二、保持實驗室內(nèi)安靜、整潔，有秩序地進行工作。三、按照操作規(guī)程(規(guī)則)進行實驗，正確地據(jù)實將實驗數(shù)據(jù)等情況填寫在規(guī)定的記錄本上。四、節(jié)約實驗材料和水電，按規(guī)定的數(shù)量取用原料和試劑。五、愛護儀器設(shè)備，實驗完畢時，負責(zé)清洗干凈，并按規(guī)定要求存放原處；儀器設(shè)備如有損壞，應(yīng)立即報告老師，同時向管理人員說明情況，按規(guī)定辦好報損或賠償手續(xù)。六、實驗室內(nèi)嚴(yán)禁吸煙，不準(zhǔn)帶入食品，不準(zhǔn)會客。七、不遵守實驗室規(guī)則的應(yīng)給予批評教育；對于嚴(yán)重違反操作規(guī)程并造成重大損失者，除賠償損失外，并視情節(jié)輕重給予必要的紀(jì)律處分，直至追究法律責(zé)任。實驗報告的書寫實驗報告是對實驗結(jié)果的科學(xué)總結(jié)。書寫實驗報告是培養(yǎng)和提高文字表達能力及概括綜合分析問題能力的重要訓(xùn)練方法。每次實驗后要求寫好實驗報告。實驗報告的書寫要求結(jié)構(gòu)完整、條理分明、文字簡煉、書寫工整、措詞推理符合科學(xué)性、邏輯性。具體格式如下：1．實驗名稱姓名學(xué)號班級2．目的要求3.原理4.主要試劑和儀器5．操作方法：6．實驗結(jié)果：是實驗報告的重要部分，一般要列出經(jīng)過歸納整理的結(jié)果，并將實驗數(shù)據(jù)列表說明，若為圖形資料，應(yīng)做好標(biāo)記及剪貼。7．討論：要針對實驗中所觀察到的現(xiàn)象與結(jié)果而言，注意不要離開實驗的實際去空談理論或照抄書本。要判斷結(jié)果是否為預(yù)期的，屬于非預(yù)期的，要認真分析原因。1學(xué)習(xí)Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。2制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定未知樣品中蛋白質(zhì)含量。一目的要求

二原理

、1.凱氏微量定氮法2.紫外分光光度法3.雙縮脲法4.Folin—酚試劑法(Lowry法)微量凱氏定氮法

含氮有機物與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫二元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則變成氨，氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。此過程通常稱為“消化”。強堿使硫酸銨分解游離出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此過量酸液中和的程度，計算樣品的含氮量。本法適用范圍0.2-1.0mg氮，相對誤差應(yīng)小于2%。紫外分光光度法蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。紫外吸收法在蛋白質(zhì)含量20-100μg/ml內(nèi)服從比爾定律。雙縮脲法

在堿性條件下,具有兩個以上肽鍵的物質(zhì)能與雙縮脲試劑的銅離子（Cu2+）作用，形成紫色絡(luò)合物（該物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式見圖），顏色深淺與肽鍵的多少即蛋白質(zhì)含量成正比。

由于蛋白質(zhì)分子中含有很多與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的肽鍵，因此也能與銅離子在堿性溶液中發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。通常可用此法來定性鑒定蛋白質(zhì)的存在。也可根據(jù)反應(yīng)生成顏色的深淺，在540nm波長處進行比色，定量測定蛋白質(zhì)的濃度。允許測定范圍為1～10mg蛋白質(zhì)。除-CO-NH-有此反應(yīng)外，（-CONH2-）、（-CH2-）、（-NH2-）、（-CS-CS-NH2）等基團亦有此反應(yīng)。2023/2/7BiochemistryExperiments12Folin—酚法(Lowry法)Step1堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅鹽溶液作用生成銅－蛋白質(zhì)絡(luò)合物堿性條件下蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基使磷鎢酸—磷鉬酸還原成蘭色復(fù)合物顯色反應(yīng)，蘭色。A500，540，660，700，750在一定條件下，蘭色強度與蛋白質(zhì)的量成正比例。Step2優(yōu)缺點優(yōu)點缺點操作簡便靈敏度高費時間較長，要精確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線不是嚴(yán)格的直線形式，專一性較差，干擾物質(zhì)較多可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5μg/ml，通常測定范圍是25~250μg/ml試驗結(jié)果的干擾因素干擾物質(zhì)蔗糖Tris緩沖液硫酸胺酚類尿素檸檬酸胍硫酸鈉三氯乙酸乙醇丙酮EDTAEGTATritonX-100dithiothreitol為了消除干擾因素的影響，用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)進行實驗，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1器材[1]試管及試管架[2]移液管(5、1、0.5ml)、移液槍（0.2ml,用于樣品蛋白質(zhì)）[3]722型分光光度計[4]電熱恒溫水浴三試劑與器材2試劑[1]標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：500μg／ml的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液。[2]Fo1in—酚試劑甲[3]Fo1in—酚試劑乙[4]血清：稀釋100倍。

Folin-甲由下述四種溶液配制(1)4％碳酸鈉溶液；(2)0.2N氫氧化鈉溶液；(3)1％硫酸銅(CuS04·5H20)溶液；(4)2％酒石酸鉀鈉溶液。在使用前，將(1)與(2)等體積混合配成碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，將(3)與(4)等體積混合配成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后，將這兩種溶液按50:1的比例混合，即為Fo1in—酚試劑甲。該試劑只能用一天，過期失效。

Folin-乙在2000ml的磨口廻流裝置內(nèi)加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H20)100g，鉬酸鈉(Na2MoO4·2H20)25g，蒸餾水700ml，85％磷酸50ml和濃鹽酸100ml，充分混合后，以小火廻流10h。再加入硫酸鋰(LiSO4)150g，蒸餾水50ml及數(shù)滴液體溴。然后，開口繼續(xù)沸騰15min，以驅(qū)除過量的溴。冷卻后定容到1000ml，過濾，濾液呈綠色。反應(yīng)物(ml)0（空白對照管）12345蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(500μg/ml)00.20.30.40.60.8蒸餾水ml1.00.80.70.60.40.2Folin-酚甲ml5.05.05.05.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.50.50.50.5A(640nm)蛋白質(zhì)濃度(μg/ml)030456090120混勻后30度水浴鍋中放置10min取6支試管

加Folin乙后立即搖勻，室溫下放置30分鐘后以0號試管為空白對照，在640nm處比色

四操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A640為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度=標(biāo)準(zhǔn)液(mL)×標(biāo)準(zhǔn)液濃度（500μg/ml）/1.0

取2支試管，各加入一定量的血清稀釋液(已經(jīng)稀釋100倍，其蛋白質(zhì)含量在酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍之內(nèi))，本實驗取0.2ml血清稀釋液，再加入0.8ml蒸餾水使樣品體積達到lml。其他操作與“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作”相同。

2.血清蛋白質(zhì)濃度的測定反應(yīng)物(ml)0（空白對照管）12血清稀釋液(已經(jīng)稀釋100倍)00.20.2蒸餾水ml1.00.80.8Folin-酚甲ml5.05.05.0Folin-酚乙ml0.50.50.5A(640nm)蛋白質(zhì)濃度(mg/L)0混勻后30度水浴鍋中放置10min取3支試管

加Folin乙后立即搖勻，30分鐘后以0號試管為空白對照，在640nm處比色3、數(shù)據(jù)處理1、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以A500為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用EXCEL繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、計算特測蛋白濃度：用待測蛋白質(zhì)的A500從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其對應(yīng)的蛋白含量，據(jù)實驗中所加入的待測蛋白質(zhì)的體積計算其濃度。10010100/(g)-6640＊＊＝血清稀釋倍數(shù)數(shù)測定時用稀釋血清的含量