GMP質(zhì)量體系微生物限度檢查法

PAGE8PAGE1目的：建立微生物限度檢查法的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，規(guī)范微生物限度檢查法的操作。范圍：適用于微生物限度檢查法。職責(zé)：檢驗室主任、檢驗員。規(guī)程：細菌、霉菌(酵母菌)計數(shù):1簡述細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)是檢測規(guī)定單位內(nèi)的非滅菌制劑污染的活菌數(shù)量，是判定藥品受到微生物污染程度的重要指標(biāo)，也是對生產(chǎn)企業(yè)的藥品、原料、輔料、設(shè)備器具、工藝流程、生產(chǎn)環(huán)境和操作者的衛(wèi)生學(xué)評價的綜合依據(jù)之一。細菌、霉菌、酵母菌計數(shù)均采用平板菌落計數(shù)法，這是活菌計數(shù)方法之一，也是目前國際上許多國家常用的一種方法。該方法以在瓊脂平板上，每個細菌(營養(yǎng)瓊脂)、霉菌(玫瑰紅鈉瓊脂)、酵母菌(玫瑰紅鈉瓊脂或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂)形成一個獨立可見的菌落為計數(shù)依據(jù)。測定結(jié)果只反映在規(guī)定條件下所生長的細菌(一群在營養(yǎng)瓊脂發(fā)育的嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數(shù)。不包括對營養(yǎng)、氧氣、溫度、PH和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。一個細菌、霉菌和酵母菌菌落均可由一個或多個菌細胞形成，因此從試品中所測的菌落數(shù)實際為菌落形成單位數(shù)(colonyformingunitg,CFU)，而不應(yīng)理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數(shù)。在進行本法測定時，必須嚴格按本法所規(guī)定的條件操作，以免產(chǎn)生實驗誤差。2設(shè)備、儀器及用具2.1設(shè)備2.1.1無菌室2.1.1.1結(jié)構(gòu)和要求，無菌室應(yīng)采光良好，避免潮濕，遠離廁所及污染區(qū)(面積不超過10m2，高度不超過2.4m)由緩沖間(2個)，操作間組成，操作間與緩沖間之間應(yīng)有樣品傳遞箱，出入操作間和緩沖間的門不應(yīng)直對。無菌室內(nèi)應(yīng)六面光滑平整，能耐受清洗消毒。墻與地面及墻壁，天花板連接處應(yīng)呈弧形，無縫隙，不留死角，操作間內(nèi)不應(yīng)安裝下水道。無菌室內(nèi)的照明燈嵌裝在天花板內(nèi)，室內(nèi)光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于300勒克斯。緩沖間和操作間均應(yīng)設(shè)置紫外線殺菌燈(2～2.5W/m2(1m距離)。不符合要求的紫外殺菌燈應(yīng)及時更換。2.1.1.2溫度、濕度無菌室內(nèi)溫度和相對濕度直接影響紫外殺菌燈殺菌效果，故溫度應(yīng)控制在18～26℃，相對濕度40～60%。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持環(huán)境形成正壓，不低于4.9Pa。2.1.1.3操作間：操作間應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應(yīng)低于10000級，局部凈化度為100級，或放置同等級凈化工作臺。并準(zhǔn)備藥物天平、乙醇燈、火柴、乙醇棉、大小橡皮乳頭等.2.1.1.4緩沖間緩沖間內(nèi)應(yīng)有洗手盆，無菌衣、帽、口罩、拖鞋等。緩沖間內(nèi)不應(yīng)放置培養(yǎng)箱和其他雜物。2.1.1.5潔凈級別及檢查方法通常采用塵粒數(shù)及浮游菌數(shù)或沉降數(shù)測定法。潔凈級別塵粒數(shù)/m3活微生數(shù)(個)/m3≥0.5 ≥5100級 ≤3，500≤0≤510000級≤350，00≤2000 ≤100100000級≤3，500，000≤20，000 ≤500GB/T16294－1996)潔凈級別個/(∮90mm.0.5h)100級 ≤110000級 ≤3100000級 ≤102.1.1.5.1浮游菌數(shù)測試方法(參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T16293－1996)2.1.1.5.2沉降菌數(shù)測定(Ⅱ法)無菌室操作臺消毒控處理后,先啟動層流凈化裝置30min，將備妥的營養(yǎng)瓊脂平板3個(經(jīng)30～35℃預(yù)培養(yǎng)48h，證明無菌落生長)。以無菌方式（或經(jīng)傳遞箱）移入操作間，置凈化臺左、中、右各1個，開蓋，暴露30min后將蓋蓋上，在30～35℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)48h，取出檢查。3個平板生長的平均菌落數(shù)不超過1個。無菌操作臺或凈化工作臺要定期檢測其潔凈度，應(yīng)達到100級。凈化工作臺中的高效及中效過濾器應(yīng)根據(jù)檢測情況。必要時予以更換處理。2.1.1.6消毒處理，無菌室應(yīng)在每次操作前、后均用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角，開動層流凈化裝置，同時用紫外殺菌燈照射30min。2.1.2其他設(shè)備凈化工作臺，恒溫培養(yǎng)箱(30～35℃)、生化培養(yǎng)箱(25～28℃)、微波爐(或其他適宜加熱裝置)、康氏振蕩器、勻漿儀(3000～8000r/min)，恒溫水浴，電熱干燥箱(250～300℃)、電冰箱、空調(diào)、高壓蒸汽滅菌器(使用時要進行滅菌效果檢查并應(yīng)定期請有關(guān)部門檢定)。2.2儀器及器皿2.2.1菌落計數(shù)器，顯微鏡(1500X)，電子天平或藥物天平(咸量0.1g)，pH系列比色計。2.2.2玻璃器皿錐形瓶(250～300ml，內(nèi)裝玻璃珠若干)、研缽(陶瓷制，直徑10～12cm)，培養(yǎng)皿(9cm)，量筒(100ml)，試管(18×180mm)及塞，吸管(1ml分度0.01，10ml分度0.1)，注射器(20或30ml)，注射針頭，載玻片，蓋玻片，玻璃消毒缸(帶蓋)。玻璃器皿用前應(yīng)洗滌干凈，無殘留抗菌物質(zhì)。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花，置吸管桶內(nèi)或牛皮紙袋中，錐形瓶，量筒，試管均應(yīng)加棉塞或硅膠塞，若用振蕩器制備混懸液時，尚需用玻璃紙包裹瓶塞，以免振蕩時供試液污染瓶塞，再用牛皮紙包扎。玻璃器皿，均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min，烘干備用。2.3用具2.3.1大、小橡皮乳頭(放于干凈帶蓋的容器中，并應(yīng)定期用70%～75%乙醇溶液浸泡)。2.3.2無菌衣、帽、口罩、手套(洗凈后配套，用牛皮紙包嚴)滅菌，備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。2.3.3接種環(huán)(白銥金或鎳鉻合金，環(huán)徑4～5mm，長度6～10cm，乙醇燈，乙醇棉球或碘伏棉球，滅菌剪刀或滅菌手術(shù)刀和滅菌鑷子，滅菌鋼錐，滅菌稱樣紙，不銹鋼藥匙，試管架，火柴，記號筆，白瓷盤，洗手蓋(12cm)，實驗記錄紙等。3試液3.1消毒液3.1.10.1%苯扎溴銨溶液(供洗手，擦拭操作臺面用)。3.1.25%石碳酸溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內(nèi)，供消毒帶菌吸管用)。亦可選用其他適宜消毒液。3.1.375%乙醇溶液3.1.4碘酊或碘伏溶液3.2稀釋劑和試劑3.2.10.9%無菌氯化鈉溶液(附錄3.1)3.2.2無菌聚山梨酯-803.2.3無菌聚山梨酯-80氯化鈉溶液(附錄3.2)3.2.4無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)(附錄3.3)3.2.5無菌0.1%氯化三苯四氮唑液(TTC)(附錄2.15)4培養(yǎng)基4.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(附錄5.2)4.2玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(附錄5.3)4.3酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養(yǎng)基(附錄5.4)培養(yǎng)基制備應(yīng)注意采用干燥培養(yǎng)基，按說明配制，應(yīng)對滅菌后的培養(yǎng)基pH值進行校驗。若為自配培養(yǎng)基，原料應(yīng)挑選取，瓊脂凝固力應(yīng)測定，以確定配制時瓊脂用量。試劑規(guī)格應(yīng)為化學(xué)純以上。配制的培養(yǎng)基不應(yīng)有沉淀，如有沉淀，應(yīng)于溶化后趁熱過濾，滅菌后使用。培養(yǎng)基的分裝量不得超過容器的2/3，以免滅菌時溢出。包裝時，塞子必須塞緊，以免松動或脫落造成染菌。培養(yǎng)基配制后應(yīng)在2h內(nèi)滅菌，避免細菌繁殖。滅菌后的培養(yǎng)基在冷暗處保存?zhèn)溆?，放置時間不能過長，以免水分散失及染菌。已熔化的培養(yǎng)基應(yīng)一次用完，開啟后不宜再用。勿用電爐直接熔化瓊脂培養(yǎng)基，以免營養(yǎng)成份過度受熱而破壞，應(yīng)用水浴或微波爐加熱。5從試品抽樣，保存及檢驗量：5.1抽樣5.1.1一般采用隨機抽樣方法，抽樣量應(yīng)為檢驗用量(2個以上最小包裝單位)的3倍量(以備復(fù)試)。5.1.2抽樣時，凡發(fā)現(xiàn)有異?；蚩梢傻臉悠罚瑧?yīng)先取有疑問的樣品，但機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。5.1.3凡能從藥品、瓶口(外蓋內(nèi)側(cè)及瓶口周圍)外觀看出長螨、發(fā)霉、蟲蛀及變質(zhì)的藥品,可直接判為不合格品，無需再抽樣檢驗。5.2保存5.2.1供試品在檢驗之前，應(yīng)保存在陰涼干燥處，勿冷藏或冷凍，以防供試品內(nèi)污染菌因保存條件不妥引起致死，損傷或繁殖。5.2.2供試品在檢驗之前，應(yīng)保持原包裝狀態(tài)，嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品。5.3檢驗量5.3.1所有劑型的檢驗量均需取2個以上包裝單位(中藥蜜丸,膜劑需取自4丸,4片以上)。5.3.2固體及半固體(粘稠性供試品)制劑檢驗量為10g。5.3.3液體制劑檢驗量為10ml。5.3.4膜劑除另有規(guī)定外，中藥膜劑檢驗量為30～50cm2，化學(xué)藥及生化藥膜劑檢驗量為10cm2。5.3.5特殊貴重或微量包裝的藥品，檢驗量可酌減，除另有規(guī)定外，口服固體制劑不低于3g，液體制劑采用原液者不得少于6ml，采用供試液者不得少于3ml，外用藥品不得少于5g。6操作方法6.1試驗前準(zhǔn)備6.1.1將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯，試管、吸管(1ml,10ml)、量筒，稀釋劑等移至無菌室內(nèi)。每次試驗所用物品必須事先計劃，準(zhǔn)備足夠用量，避免操作中出入操作間，編號后全部外包裝(牛皮紙)去掉。6.1.2開啟無菌室外紫外殺菌燈和空氣過濾裝置，并使其工作不低于30mm。6.1.3操作人員用肥皂洗手，關(guān)閉紫外殺菌燈，進入緩沖間，換工作鞋，再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手，穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。6.1.4操作前先用乙醇棉球擦手，再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍，待干后用滅菌的手術(shù)鑷或前將供試品啟封。6.2供試液的制備6.2.1液體供試品取供試品10ml，置滅菌錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，搖勻，作為1：10從試液。含王漿或蜂蜜的液體制劑和滴眼劑直接用從試品作為供試液。6.2.2固體，半固體或粘稠供試品，稱取從試品10g，置于勻漿杯或適當(dāng)滅菌溶器中，加入100ml10.9%無菌氯化鈉溶液，用勻漿儀(3000～5000r/2～4min)，振蕩器或乳缽研磨等方法分散混勻。胃溶膠囊加稀釋劑后置45℃±℃水浴中振遙，腸溶膠囊加無菌磷酸鹽緩沖液后先打碎再置45℃±℃左右的0.9%無菌氯化鈉溶液85ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為從度液(1：20)。油劑取供試品10ml，加入無菌聚山梨酯-805～8ml，搖勻，再加入稀釋劑至100ml。栓劑稱以供試品10g，置滅菌錐形瓶中，加適量稀釋劑置45℃水浴保溫10min，使溶，加入無菌聚山梨酯-805～8ml，振搖使之乳化，再加稀釋劑(稀釋劑和聚山梨酯-80總量為100ml)，搖勻。6.2.4氣霧劑將供試品置冰箱(4～8℃)1h，取出用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品開啟部位周圍，然后以無菌鋼錐仔細鉆孔并插入容器中，勿移出鋼錐，以轉(zhuǎn)動方式使容器內(nèi)拋射劑全部拋出，以無菌注射器吸出全部藥液，按標(biāo)示量補加稀釋劑至足量(若含非水溶性成份，加適量無菌聚山梨酯-80液)此液即為供試品原液。6.2.5膜劑，中藥膜劑一般取30～50cm2，將藥膜剪成碎片，置滅菌錐形瓶中，加入稀釋劑100ml，于45℃±℃水浴中保溫，振搖使溶。西藥膜劑，一般取樣為10cm2，制備供試液方法同上。6.2.6搽劑，取供試品10g，置滅菌錐開瓶中，加入稀釋劑100ml，振搖30s，以滅菌紗布過濾(如為袋泡茶，可直接取2袋，以稱樣結(jié)果按1：10加稀釋劑，浸泡30min)。以上從供試品如吸水膨脹，或粘度過高，可增加稀釋劑，制成1：20～1：100供試液。6.3從試液的釋稀(10倍遞增稀釋法)6.3.1取2～3支滅菌試管，分別加入9ml滅菌稀釋劑(此時操作一般為:左手執(zhí)試管并將塞打開，傾斜，右手執(zhí)10ml吸管吸量，注意:勿在乙醇燈焰峰正上方操作，以免燈焰將供試液中菌細胞殺滅)。加完稀釋劑后，試管塞應(yīng)立即塞上。6.3.2另取1支1ml滅菌吸管，吸1：10均勻供試液1ml，加入裝有9ml滅菌稀釋劑的試管中混勻，即為1：100供試液，以此類推，根據(jù)供試品污染程度，可稀釋至1：102、1：103、1：104等適宜稀釋級(至少共3級)。每遞增1稀釋級，必須另換一支吸管。在作10倍遞增稀釋時，吸管插入第1級稀釋液內(nèi)不低于液面2.5cm，反復(fù)吸吹約10次，吸液時，應(yīng)先吸至高于吸管上部刻度少許，然后提起吸管，巾于試管內(nèi)壁高速液量至刻度，再沿第2級笱釋管的內(nèi)壁靠近液面(勿接觸液面)緩慢地吹出全部供試液(吸管內(nèi)應(yīng)無粘附或殘留液體)。然后將吸管放入消毒液缸內(nèi)。6.4注平皿，在進行10倍遞增稀釋的同時，以該稀釋級吸管，吸取各級稀釋液各1ml至每個滅菌平皿中(從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸管)，每一稀釋級注2～3個平皿(此時,一般為左手執(zhí)平皿，將蓋半開，右手執(zhí)吸管)，注平皿時，將1ml供試液慢慢全部注入平皿中，管內(nèi)無殘留液體，防止反流到吸管尖端部，同時作陰性對照(待各級稀釋液注皿完畢后，用1支1ml吸管取稀釋劑各1ml，分別注入4個平皿中。其中2個作細菌陰性對照；另2個作霉菌、酵母菌數(shù)陰性對照，如另用YPD瓊脂測定酵母菌數(shù)時，則再增加2個平皿作酵母菌陰性對照)。6.5傾注培養(yǎng)基，將預(yù)先配制好的培養(yǎng)基(細菌計數(shù)用營養(yǎng)瓊脂，霉菌，酵母菌計數(shù)一般用玫瑰紅鈉瓊脂，含蜂蜜，蜂王漿液體制劑另加用YPD瓊脂)溶化，冷至約45℃，傾注上述各個平皿約15ml，以順時針或反時針方向快速旋轉(zhuǎn)平皿混勻，注意，混勻時切勿將培養(yǎng)基濺到皿邊及皿蓋上，置操作臺上待凝。6.6培養(yǎng)細菌計數(shù)平板倒置于30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，霉菌、酵母菌計數(shù)平板于25～28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。6.7菌落計數(shù)6.7.1一般將平板置菌落計數(shù)器上或從平板的背面直接以肉眼點計，以透射光襯以暗色背景，仔細觀察，勿漏計細小的瓊脂層內(nèi)和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落與霉菌菌落和酵母菌菌落以及它們與供試品顆粒、培養(yǎng)基沉淀物、氣泡等的鑒別，必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察或挑取可疑物涂片鏡檢。6.7.2供試品如為微生物制劑，應(yīng)將有效微生物菌數(shù)排除，不可點計在細菌，霉菌和酵母菌數(shù)內(nèi)，排除的方法需按該制劑微生物品種而定，并須觀察菌落特征及染色形態(tài)。6.7.3供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料，培養(yǎng)基注皿后亦可能產(chǎn)生沉淀物，經(jīng)過培養(yǎng)后有時形成數(shù)量很多且難與菌落用肉眼鑒別的有形物。為有利于菌落計數(shù)，可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿(1～2個平皿)，注皿后不經(jīng)培養(yǎng)而放置于冰箱(勿結(jié)凍)中，在計數(shù)菌落時作為對照?；蛴?.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)后可將細菌菌落與其他有形物區(qū)別開來。有些軟膏等非水溶性供試品，經(jīng)營養(yǎng)瓊脂注皿后呈乳白色，培養(yǎng)后生長的菌落不易辨認和點計，為防止這種情況，也可用0.001%TTC營養(yǎng)瓊脂注皿，經(jīng)培養(yǎng)的生長的菌落為紅色，襯于白色背景上易于點計。6.7.4若平板上有2個或2個以上菌落重疊，肉眼可鑒別時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)；若平板生長有鏈狀菌落，菌落間無明顯界線，一條鏈作為一個菌落計，但若鏈上出現(xiàn)性狀與縫狀菌落不同的可辨菌落時，仍應(yīng)分別計數(shù)，若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落，一般不宜作為計數(shù)