基因操作原理03課件

第三章

分子克隆載體

Molecularcloningvectors將外源DNA或基因攜帶入宿主細(xì)胞（hostcell）的工具稱為載體載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1．在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）2．必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時不影響其復(fù)制3．有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選

其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備利用重組DNA技術(shù)分離目的基因，稱之為基因克隆克隆動詞：指從單一祖先產(chǎn)生同一的DNA分子群體或細(xì)胞群體的過程名詞：指從一個共同祖先無性繁殖下來的一群遺傳上同一的DNA分子、細(xì)胞或個體所組成的特殊的生命群體。一

、質(zhì)粒的基本特性第一節(jié)

質(zhì)粒載體Plasmidvectors1．概念①染色體外的遺傳因子，能進(jìn)行自我復(fù)制（但依賴于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)）②大多數(shù)為雙鏈，閉環(huán)DNA分子，少數(shù)為線性③大小1kb～200kb,也有更大質(zhì)粒的表型:抗生素的抗性、產(chǎn)生抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物產(chǎn)生毒素（如大腸桿菌素，腸毒素），限制酶與修飾酶、固氮、殺蟲等復(fù)制子有不同的組成方式（滾環(huán)、、以及G+/G-）在Ecoli中，使用的大多數(shù)載體都帶有一個來源于pMB1質(zhì)?；駽olE1質(zhì)粒的復(fù)制子其復(fù)制方式如下：RNAIIori-550600400RopRNAIRNaseH2．質(zhì)粒的復(fù)制①復(fù)制起始區(qū):通常一個質(zhì)粒含有一個與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)合成RNAII即前引物，形成雜交體RNaseH切割RNAII使之成熟，形成三葉草結(jié)構(gòu)RNAI可控制RNAII形成二級結(jié)構(gòu)Rop增強(qiáng)RNAI的作用②拷貝數(shù)嚴(yán)謹(jǐn)型：拷貝數(shù)有限，大約1～幾個構(gòu)馳型：拷貝數(shù)轉(zhuǎn)多，幾十至幾百削弱RNAI和RNAII之間相互作用的突變，將含增加帶有pMB1或(ColE1)復(fù)制子的拷貝數(shù)，(突變位置位于rop基因或編碼RNAI和RNAII的復(fù)制起點(diǎn)內(nèi))pMB1質(zhì)粒的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半衰期較長的酶（DNA聚合酶I，DNA聚合酶III），依賴于DNA的RNA聚合酶，以及宿主基因dnaB,dnaC,dnaD和danZ的產(chǎn)物,因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進(jìn)行，復(fù)制依然能夠我行我素當(dāng)存在抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素時，帶有pMB1(或ColE1)復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個細(xì)胞中可積聚2-3千個質(zhì)粒。3．質(zhì)粒的不相容性

兩個質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性在第二個質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及DNA限制系統(tǒng)時，不相容的質(zhì)粒一般為利用同一復(fù)制系統(tǒng)，質(zhì)粒分配到子細(xì)胞時會發(fā)生競爭，隨機(jī)挑選，微小差異，最終放大。不相容群：指那些具有不相容性的質(zhì)粒組成的一個群體，一般具有相同的復(fù)制子ColE1/pMB1現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)30多個不相容群，ColE1/pMB1pSC101,p15A4．轉(zhuǎn)移性在自然條件下，很多質(zhì)粒可以通過稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)要素：移動基因mob，轉(zhuǎn)移基因tra，轉(zhuǎn)移起始位點(diǎn)如：F’質(zhì)粒pBR322有起始位點(diǎn)bom的nic位點(diǎn)，可在第三個質(zhì)粒（如ColK）編碼的轉(zhuǎn)移蛋白作用下，通過接合性質(zhì)粒來進(jìn)行轉(zhuǎn)移。但大多數(shù)載體無nic/bom位點(diǎn)（pUC）青霉素是一類化合物的總稱，其分子結(jié)構(gòu)由側(cè)鏈R-CO-和主核6-氨基青霉烷酸（6-APA）兩部分組成。在6-APA中有一個孢和的噻噬環(huán)（A）和一個-內(nèi)酰胺環(huán)，6-APA由L-半脫氨酸和纈氨酸縮合成的二肽(2)四環(huán)素抗性基因

tetrtetracycline與核糖體30S亞基的一種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而抑制核糖體的轉(zhuǎn)位tetr基因編碼一個由399aa組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進(jìn)入細(xì)胞。(3)氯霉素抗性基因

chloramphenicol,CmrorCatCm與核糖體50S亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成目前使用的Cmr來源于轉(zhuǎn)導(dǎo)性P1噬菌體(也攜帶Tn9)cat基因編碼一個四聚體細(xì)胞質(zhì)蛋白(每個亞基23kDa)，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，在乙酰輔酶A存在的條件下，催化氯霉素羥乙酰氧基衍生物的形成，該產(chǎn)物不能與核糖體結(jié)合該酶的表達(dá)對分解代射的產(chǎn)物敏感，若細(xì)菌利用除葡萄糖以外的碳源生長時，其表達(dá)量可增加到原來的5-10倍，在cAMP/分解代射的產(chǎn)物基因激活蛋白存在下，依賴于DNA的RNA聚合酶在體外與cat基因啟動子結(jié)合的能力明顯增強(qiáng)。(4)卡那霉素和新霉素抗性基因

kanamycin/neomycin可與核糖體成分相結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成的脫氧鏈霉胺氮基糖苷這兩種抗生素可被氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH(3’)-II）所滅活，該酶為25kDa，似乎位于外周質(zhì)腔，這些抗生素的磷酸化干擾了它們向細(xì)胞內(nèi)的主動轉(zhuǎn)移。2.篩選標(biāo)記(1)-互補(bǔ)

complementationLacZ’基因的互補(bǔ)-galactosidase1024aaLacZLacZ△M15LacZ’140個aa編碼缺失第11-41位氨基酸140個aa+MCSIPTG:異丙基--D-硫代半乳糖苷

誘導(dǎo)物X-gal:5-溴-4氯-3吲哚--D-半乳糖苷

底物(生色劑)-半乳糖苷酶分解x-gal形成藍(lán)色產(chǎn)物MCS:MultiplecloningsitesLacZ△M15LacZ’IPTG/x-galLacZ△M15LacZ’藍(lán)色LacZ△M15LacZ’DNAIPTG/x-gal白色-互補(bǔ)lacZ基因上缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的-半乳糖苷酶陰性的突變體之間實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)LacZ△M15放在F質(zhì)粒上,隨宿主傳代LacZ’放在載體上,作為篩選標(biāo)記(2)插入失活相應(yīng)的受體菌TG1,XL1-Blue,JM101等

(lac-proAB)F’[proAB+lacIqlacZM15]lacI:LacZ阻抑物的編碼基因（lacIq突變使阻抑物產(chǎn)量增加）三、質(zhì)粒載體的種類①pBR322之前pSC101,ColE1等,大且酶切位點(diǎn)少轉(zhuǎn)化效率與大小成反比

>15kb轉(zhuǎn)化效率成為限制因素質(zhì)粒越大，越難于用限制酶切因素進(jìn)行鑒定質(zhì)粒越大，拷貝數(shù)就越低1．克隆載體用于擴(kuò)增or保存DNA片段，最簡單的載體①pBR3224361bp，

許多質(zhì)粒載體由此發(fā)展而來，GenBankV01119,J01749(4361bp)含有30多個單一位點(diǎn)，且Ampr和tetr可通過插入失活進(jìn)行篩選ApAp+TcApApAp+TcApApAp+TcAp②pUC18/192686bp18:L0875219:X02514來自pBR322其中LacZ’(MSC)來自M13mp18/19MSC(10個位點(diǎn)),-互補(bǔ)cloning:expression:利用lacZpromotersequencing:UniversalandReserveprimer

引物位置/引物序列

MultiplecloningsitesForwardUniversalprimerReverseprimer③pUC118/119118:UO76493162bp//119:UO76503162bp

帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止以及包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列，當(dāng)含這些質(zhì)粒的細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA的其中一條鏈，并包裝子代噬菌體顆粒用途:分離ssDNA測序，誘變，探針噬菌粒④體外轉(zhuǎn)錄pGEM-3Z/4Z3Z：X653044Z：X653052.74kb⑤

綜合性載體pTZ18/19/U/RpTZ18UL37352(2860bp)1994pTZ18RL08956(2871bp)1993pTZ19RY14835(2862bp)1997L08957(2870bp)1994pTZ19UY14836(2862bp)1997L37382(2863bp)1994pGEM-3Zf3197bppGEM-3Zf(-)X65307pGEM-3Zf(+)X65306BluescriptM13

(2958bp)SK(-)X52324/SK(+)X52325KS(-)X52326/KS(+)X52331(2961bp)IISK(+)X52328/IISK(-)X52330IIKS(+)X52327/IIKS(-)X52329e.gpBluescriptIIKS(+)載體應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1．在宿主細(xì)胞內(nèi)必須能夠自主復(fù)制（具備復(fù)制原點(diǎn)）2．必須具備合適的酶切位點(diǎn)，供外源DNA片段插入，同時不影響其復(fù)制3．有一定的選擇標(biāo)記，用于篩選4．其它：有一定的拷貝數(shù)，便于制備附加因素:MSC,LacZ’(-互補(bǔ)),ssDNAphageorigin,Promoters2.表達(dá)載體p35s-GFP(U28417,4518bp)等第二節(jié)

phagevectors1.最早使用的克隆載體并對其遺傳學(xué)和生理學(xué)作了深入研究2.為利用該載體必須熟知其分子生物學(xué)，了解載體的設(shè)計和組建的原則一、噬菌體的分子生物學(xué)48502bpGenBankJ02459orM172335’strandoverhangsthe3’strandby12basesGGGCGGCGACCT/HindIII(7個切點(diǎn))23.1(kb)2.32.0564(bp)125

48502bp（一）發(fā)育調(diào)節(jié)1.吸附

37℃正常，室溫?zé)o噬斑2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期裂解溶原噬菌體生活史簡圖GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGADNAPhageparticlelysisDNAreplicationLatecontrolPhageparticlelysisDNAreplicationLatecontrolPhageparticlelysisDNAreplicationIntegration/excisionreconbinationLatecontrolPhageparticlelysisDNAreplicationControlregionIntegration/excisionreconbinationLatecontrol2．早期轉(zhuǎn)錄—立即早期、延遲早期N：正調(diào)節(jié)子使PL和RR繼續(xù)轉(zhuǎn)錄(中和σ-因子的活性)Cro：抑制PL和PR，使積累的Q蛋白引導(dǎo)晚期轉(zhuǎn)錄cII：引導(dǎo)cI表達(dá)（PE）cIII：引導(dǎo)int表達(dá)（PI）cI：全面抑制并阻斷表達(dá)(與QR和OL結(jié)合)Cro/cII的優(yōu)勢，引入不同途徑

宿主/基因產(chǎn)物的錯綜復(fù)雜的平衡正常情況下：Cro/cII各自起作用的機(jī)會大致相當(dāng)，并受外部條件的影響在延遲早期結(jié)束時，下一步生長所需的蛋白才會表達(dá)出來，不可逆地朝裂解循環(huán)或溶原循環(huán)方向發(fā)展WildtypeE.coli

，向溶原和裂解的轉(zhuǎn)變由感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection)

細(xì)胞的營養(yǎng)狀態(tài)決定的感染復(fù)數(shù)越高，營養(yǎng)狀態(tài)越差溶原化(lysogenization)的頻率就越高溶原現(xiàn)象的生化媒介可能是

3’-5’cAMP,細(xì)胞內(nèi)的濃度會隨營養(yǎng)條件的變化而改變當(dāng)細(xì)胞富營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長是，cAMP的濃度較低，有利于裂解生長在缺乏cAMP的突變細(xì)胞中，更有利于裂解生長由于不知道哪個噬菌體的啟動子受cAMP的調(diào)節(jié)，因此溶原和裂解的選擇部分受到細(xì)菌基因或調(diào)節(jié)cAMP的基因3．進(jìn)入裂解周期通過復(fù)制，大約合成50個噬菌體基因組單體，然后進(jìn)入滾環(huán)復(fù)制。通過復(fù)制，產(chǎn)生基因組DNA的多聯(lián)體(concatemer)，最后被切割并被包裝到噬菌體顆粒中recB/recC/recD產(chǎn)物,外切核酸酶V

抑制DNA復(fù)制向滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)變gam可與外切核酸酶V結(jié)合,使之失活Nul和

A蛋白與cosL/cosR結(jié)合在FI蛋白下DNA被纏入前頭中A基因產(chǎn)物的ter功能在cosR/cosL切割

S,R,Rz基因產(chǎn)物,為裂解必須Sam7該突變可防止或延遲裂解噬菌體的包裝4．溶原化

只有cI,及rexArexBrexC表達(dá)cI：236aacI，cII，cIII發(fā)生突變不能溶原化cIts857：對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變45℃失活誘導(dǎo)因素：如DNA損傷劑（UV）則RecA降解cI

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成正常

切離

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成不正常切離

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成

轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體的形成ddgal（二）的可取代區(qū)1.區(qū)域溶源化的正確切離→正常不正確切離→不正常gal替換orbio替換J基因與Cro基因之間的丟失

不影響裂解生長（約1/3）2.大小60%區(qū)域?yàn)楸仨?/p>

20kb(A→J)8-10kb78～105%包裝范圍37.831～50.927可插入9-23kb二、噬菌體的選擇標(biāo)記1.大小2.LacZ基因

在填充片段中帶有-半乳糖苷酶基因片段3.cI失活見gt104．Spi篩選Spi+：

不能感染

E.coli(P2)Spi-：(red-gam-)能感染E.coli(P2)

形成小噬斑h(yuǎn)ostrecA+chi位點(diǎn)·包裝時若gam-，需recA產(chǎn)物的作用才可形成噬斑(但為小噬斑),所以對宿主菌有要求(recA+)但recA+可引起其它重組：載體改為red-/gam+可在recA-受體菌中增殖。Charon32-35,40·red-gam-時，若外源插入片段含chi位點(diǎn)(8bp),則形成清亮噬斑，否則形成小噬斑，由于chi位點(diǎn)的未知性，因此重組體可形成大小不等的噬斑為避免此問題則在載體中加入chi位點(diǎn),如2001,DASH,F1X,EMBL系列三、代表性噬菌體載體插入型載體insertionvectors置換型載體replacementvectors噬菌體載體主要用于構(gòu)建基因文庫，特別是cDNA文庫。（一）插入型載體1．gt10載體43340bp插入大小設(shè)計為6kb，理論7.6kbatt及其左側(cè)缺失(b527)，以及N基因至cII基因之間的突變只在相當(dāng)于cI基因內(nèi)有一個

EcoRI位點(diǎn)。用于克隆小的(～6kb)cDNA而設(shè)計，外源DNA量有限時較好，克隆效率高宿主菌：C600(BNN93)增殖載體supEhsdR(rk-)C600hflA(BNN102)篩選重組體cI-在hflA(高頻溶源化)中形成噬斑cI+在hflA中形成溶源，產(chǎn)生混濁噬斑，cI+的生長受到宿主的抑制50～100倍2．gt11

插入型插入大?。?～7.2kb在最左側(cè)替代區(qū)置換一段lac5基因，其編碼區(qū)終止密碼子之前有一個EcoRI位點(diǎn)（53bp上游）篩選：在lac-宿主菌中，非重組噬菌斑為蘭色(IPTG)

用途：構(gòu)建cDNA文庫，基因組文庫，表達(dá)融合蛋白表達(dá)：表達(dá)融合蛋白，外源DNA片段有可能與lacZ的閱讀框相吻合，可用免疫學(xué)方法篩選Sam100:supF突變,防止細(xì)菌裂解cI：溫敏突變用來控制噬菌體的復(fù)制和融合蛋白的表達(dá)宿主：Y1090(hsdR)lon蛋白酶陰性supFlac-,可用于抗體或核酸探針篩選增殖載體，supF抑制Sam100Y1089(hsdR)具有高頻溶源特性lon蛋白酶陰性，表達(dá)外源蛋白3.GEM-2/4GEM-2:43.80kb(0～7.1kb)GEM-4:46.2kb(0～4.7kb)同gt10,在cI位點(diǎn)有差異,由EcoRI改位多克隆位點(diǎn)SpeIXbaISacIEcoRISpeISP6T7SpeIXbaISacIEcoRISpeISP6AmpRT7pGEM-14:ZAPII與gt11相似,插入pBluescriptM13質(zhì)粒41kb,0-10kb

InfectedbyhelperphageI--TregionwillbepackagedasafilamentousphagepBluescriptplasmidsarerecoveredbyinfectinganF'strain(AmpR)單個噬菌體或擴(kuò)增的文庫與絲狀常助噬菌體共感染E.coli在細(xì)胞內(nèi)，幫助噬菌體中的蛋白(基因II蛋白)識別f1噬菌體正鏈合成起始(I)和終止(T)信號，并在相應(yīng)位置處切割，在helpphage的作用下，切割下來的片段會環(huán)化，被包裝、分泌至細(xì)胞外；再感染F菌株，在AmpR下可獲得相應(yīng)重組質(zhì)粒。Helpphage：M13，ExAssisthelpphage5.Excell45.5kb在E.coliNP66中于attL和attR之間發(fā)生同源重組，產(chǎn)生質(zhì)粒pExCell(4190bp)外源DNA插入的大小6kb用于cDNA克隆coscosAttLAttRpExCellExCell載體釋放出質(zhì)粒的原理圖了解ZAP11和ExCell目的在于了解有關(guān)的構(gòu)建原理進(jìn)一步領(lǐng)會如何利用生物的基本特征來構(gòu)建載體，即對生物的或DNA的某一特征加以利用，為以后的工作提供一種思維方法（二）置換型載體coscosRLCentralstuffer雜合片段:含DNA和其它DNA外源，來自E.coli或動物VectorLarmstufferRarminsertCharon4A19.5kbEcoRI/14.7kb11kb7～20kblac5XbaI/作插入型0～6kbEXEElac5VectorLarmstufferRarminsertCharon3219.5kbEcoRI/12.5kb11.98-19kb小鼠DNA內(nèi)有4個EcoRI位點(diǎn)20kbHindIII置換13.35～18kb27kbSacI插入16.8kb0～10kbEEEEEEH3SacH3EMBL3/4L20kbR9kb9-23kbSpi篩選promega19.9kb8.8kb7-20kbMolCloningSalIBamHIEcoRIEcoRIBamHISalI14kbCharon40

stuffercontaining235bprepeats約80copy(lac操縱基因+腺病毒DNA)內(nèi)含XmaIII/XmaIII/NaeI左右各16個位點(diǎn)(MCS)用于切開stuffer

insert:9.2～24.2kbMCSMCS(XmaIII/XmaIII/NaeI)80DASH9-22kbchi+利于染色體步查XbaSalEBHSacXhoXbaT3T7結(jié)構(gòu)同EMBL3GEM-119-23kbchi+(同EMBL/3/4臂)四、克隆原理及步驟

結(jié)合包裝過程1．通過裂解過程增殖載體

回收、純化載體2．酶切、載體與外源DNA3．連接4．包裝

5．感染/鋪平板6．篩選包裝感染鋪平板篩選陽性克隆基因文庫(Lambda)9-23kbSau3A1BamHI連接N=ln(1-p)/ln(1-f)P:文庫中出現(xiàn)陽性克隆的期望值F:插入片段占總DNA的比值哺乳動物3x10917kb99%N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105

載體與外源片段的連接去磷酸化回收載體臂部分補(bǔ)平酶切方式（雙酶切，重復(fù)片段）一、粘粒的結(jié)構(gòu)特征1．粘粒實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，帶有將DNA包裝到噬菌體顆粒中所需的DNA序列(cos序列)2．組成：質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（colE1）,抗性標(biāo)記amprcos位點(diǎn)，能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化,增殖3．大?。阂话?kb左右，可克隆38～47kb片段

包括（38～52kb）第三節(jié)

粘粒載體cosmidN=ln(1-p)/ln(1-f)P:文庫中出現(xiàn)陽性克隆的期望值F:插入片段占總DNA的比值哺乳動物3x10917kb99%N=ln(1-0.99)/ln(1-(1.7x104/3x109)=8.1x105

二、克隆原理及步驟1．分離外源DNA片段35～45kb2．外源DNA與兩個粘粒相連，且cos方向相同3．體外包裝

在的A蛋白的ter功能作用下切割cos位點(diǎn)并將其中的DNA包裝到成熟的噬菌體顆粒中去4．感染E.coli：線狀的重組DNA被注入細(xì)胞并通過cos位點(diǎn)的環(huán)化，而形成粘粒載體，象質(zhì)粒一樣復(fù)制三、用途1．在構(gòu)建基因文庫中，減少文庫中重組體的數(shù)目2．在單個重組體中克隆和增殖完整的（較大的）真核基因

雞前2膠原、鼠三氫葉酸還原酶（DHFR）至少40kb

載體最大24kb，質(zhì)粒載體雖可攜帶大片段，但轉(zhuǎn)化率低。3．克隆與分析組成某一基因家族的真核DNA區(qū)段如哺乳動物珠蛋白基因遍布于至少70kb的DNA片段中甚至有數(shù)十萬個bp（幾百kb）在“步查”過程中，粘粒具有優(yōu)勢，是文庫的兩倍，粘?？煽寺?5kb染色體步查：chromosomewalking采用一段分離自某一重組體一端的非重復(fù)DNA片段作為探針以鑒定含有相鄰序列的重組克隆。Sau3A1四、粘?？寺≥d體1．pJB8簡單粘粒組成:amporicos4個位點(diǎn)5.4kb可容納33-46.5kb外源DNA片段對載體進(jìn)行去磷酸化理，否則易形成多聯(lián)載體定向克隆包裝感染鋪平板篩選陽性克隆基因文庫(E.coli)33-46kbSau3A1連接BamHI酶切CIP去磷酸mcsCOS2c2RB6.8kb含兩個cos位點(diǎn)amprkamroriColE14個E位點(diǎn)35～45kb35～45kb(MobI/經(jīng)CIP處理)一般高濃度ATP存在下（5mmol/L）抑制平端連接，但對粘端沒有影響包裝

感染

篩選3．pCOS1EMBL用于篩選體內(nèi)重組的重組粘粒文庫①構(gòu)建文庫②在recA-中增殖（體內(nèi)包裝）③用顆粒感染recA+E.coli（pUC18∷探針）④發(fā)生重組⑤再次包裝⑥再次感染，但recA-E.coli(ampr,kamr)Ori/R6KOri/ColE1Ampprobe4．卡隆粒9載體系列為克隆33kb以下片段而設(shè)計SalIcosMCSamporipBR重復(fù)單元SalI9個位點(diǎn)AvaI(2047bp)nAvaI在recA-穩(wěn)定,可用于增殖

1-23個串聯(lián)重復(fù)pBR322中2kb片段（含tet’）MCS:9個酶切位點(diǎn)在recA+E.coli中可發(fā)生重排用于克隆33kb-2kb，如克隆經(jīng)Southern雜交確定的特定基因組DNA片段.*：重復(fù)單元中含SalI位點(diǎn)，載體中也有一個SalI，當(dāng)用SalI消化時可將絕大多數(shù)重復(fù)片段去掉前提：外源DNA不含SalI,由于SalI識別GTCGAC，但哺乳動物DNACG序列較少，100kb才能有一個SalI位點(diǎn)MluI:ACGCGT哺乳動物中平均500kb一次PvuI:CGATCG300kb一次用于制作限制性酶切圖譜

如

先MluI消化,再用不切割重復(fù)片段的酶部分切割5．pWE15五、文庫的擴(kuò)增和貯存1.濾膜影印

25%甘油TB平板,-70C2.混菌保存

混合單菌落,15%甘油,-70C3.體內(nèi)包裝

重組缺陷超感染,重新包裝重組cosmid,收集裂解混合物,在含少量氯仿SM(0.3%)溶液中,4C可貯存幾年,或含7%二甲基亞砜(DMSO)-70C長期保存生長平衡問題六、常見問題自我連接、多個外源插入等問題已解決但仍不足以作為常規(guī)克隆，不如phage1．基因組DNA質(zhì)量，開始超過200kb2．酶解受到抑制，須梯度離心3．無外源DNA，單個cos→5%空，雙cos低得多charomid高→20%4．重組質(zhì)粒拷貝數(shù)差異大5．盡管文庫似乎全面，但也許不能獲得目的克隆，限制酶位點(diǎn)的非隨機(jī)分布，污染限制酶，重組缺失,擴(kuò)增時目的克隆可能被淘汰。第四節(jié)

單鏈絲狀噬菌體載體包括M13,f1,fdM13為6.4kb(6407base),ssDNA組織形式相同，顆粒大小，形狀相近,DNA同源高，98%差異位于第三密碼子,互補(bǔ)活躍，彼此間易重組視為等同一、M13的生物學(xué)1．結(jié)構(gòu)6407bp90%編碼蛋白11個編碼基因間隔區(qū)小大間隔區(qū)位于VIII/III

和

II/IV，其間有表

達(dá)調(diào)控元件6-7nmx880nmIG：intergenicregion,orIR

非編碼區(qū)，但不是非必需區(qū)，508bp含：對包裝及DNA在病毒顆粒中的定向

進(jìn)行調(diào)控的順式作用信號，正鏈與負(fù)鏈DNA合成起始和終止位點(diǎn)，以及不依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止信號IG：非編碼區(qū)，但不是非必需區(qū)，508bp含：對包裝及DNA在病毒顆粒中的定向

進(jìn)行調(diào)控的順式作用信號，正鏈與負(fù)鏈DNA合成起始和終止位點(diǎn)，以及不依賴于因子的轉(zhuǎn)錄終止信號GeneVIII：顆粒主要結(jié)構(gòu)蛋白，2700個形態(tài)亞基，管狀排列GeneIII：次要蛋白，位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐基因組DNA為正鏈，按II→IV方向合成2．增殖①吸附/入侵/F菌株的性纖毛DNA及基因III產(chǎn)物進(jìn)入菌體②形成RFDNAssDNA在胞內(nèi)酶作用下變成dsDNA,即RFDNAreplicativeform復(fù)制型DNA③轉(zhuǎn)錄/復(fù)制從任一個啟動子轉(zhuǎn)錄，終止于終止子，靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄頻繁④滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)生基因組ssDNA基因II產(chǎn)物在正鏈上產(chǎn)生切口→滾環(huán)復(fù)制→完成一周由基因II產(chǎn)物切割→環(huán)化→形成單位長度的基因組DNA感染的頭15-20分鐘：(+)ssDNA→RFDNA→連續(xù)滾環(huán)復(fù)制⑤分泌/包裝當(dāng)RFDNA達(dá)到100-200個/cell時，基因V產(chǎn)物（單鏈結(jié)合蛋白）與（+）ssDNA結(jié)合，阻止其變成RFDNA,并抑制GeneIIRNA的翻譯geneV/(+)ssDNA復(fù)合物移至胞膜，基因V產(chǎn)物脫落，

(+)ssDNA溢出時被衣殼蛋白所包被由于病毒基因組并不需要插進(jìn)一個預(yù)先形成的結(jié)構(gòu)之中，對被包裝的ssDNA的大小并無嚴(yán)格限制，相反，其長度卻隨DNA的量而變化，曾發(fā)現(xiàn)含多個基因組的顆粒，也曾克隆過長6倍的外源片段宿主不裂解，生長可繼續(xù)，但速率小1/2～3/4每個細(xì)胞產(chǎn)生數(shù)百個顆粒>1012pfu/mlplaqueformingunit二、M13噬菌體載體1．插入?yún)^(qū)域由于絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源DNA，II/IV和VIII/III之間，前者使用較多，但外源DNA插入后，會嚴(yán)重影響噬菌體基因組的復(fù)制由于獲得了一些突變體，使之部分補(bǔ)償這種被滅活的負(fù)責(zé)復(fù)制調(diào)控的順式作用要素的功能2．M13mp載體系列插入一段lacDNA片段，即帶有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調(diào)控序列及其N端頭146個aa編碼信息，宿主F’因子攜帶缺失第11-41位氨基酸的lacZ’-互補(bǔ)：缺失lacz操縱基因近鄰區(qū)段的突變體與-半乳糖苷酸陰性但操縱基因近鄰區(qū)完整的突變體之間的互補(bǔ)作用。早期為M13mp1，其后導(dǎo)入多克隆位點(diǎn),不影響-互補(bǔ)，形成系列載體。差異在多克隆位點(diǎn)上(其數(shù)值為最佳估計值)3.．宿主菌laczM15(lac-proAB),lacIq,proAB,hsdR17/hsdR4,失去I類限制作用，但保留修飾recA1(重組缺陷):保持質(zhì)粒單體不形成多分子環(huán)M13載體不會重組丟失片段supE(抑制基因,為谷氨酰胺UAG)traD36抑制F’轉(zhuǎn)移已不再要求,但沿用至今JM101:supE(lac-proAB)F’[traD36proAB+lacIqlacZM15]JM105JM101/hsdR4JM107JM101/hsdR17JM109JM101/hsdR17recA1TG1JM101/hsd5(不修飾不限制)XL1-BluesupElac-hsdR17recA1F’[proFAB+lacIqlacZM15Tn10(tetr)]保證F’存在的方法4．用途有時不穩(wěn)定，不作為常規(guī)克隆載體和增殖，主要用于制備單鏈DNA①用于雙脫氧鏈終止法測序②寡核苷酸定點(diǎn)誘變③ssDNA探針5．經(jīng)常遇到的問題①外源DNA區(qū)段的部分缺失大→缺失多，避免連續(xù)生長可最大減少重組從-70℃原種（感染宿主）→鋪平板→挑取單斑中央細(xì)菌→小規(guī)模培養(yǎng)小規(guī)模培養(yǎng)已足夠獲得ssDNAorRFDNA,不宜再作種子②單方向插入可改用噬菌粒三、噬菌粒phagemid帶有絲狀噬菌體復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒DNA合成的起始，終止，形態(tài)發(fā)生含phagemid的細(xì)菌被M13(或f1)感染后，基因II蛋白作用于間隔區(qū)，啟動滾環(huán)復(fù)制→ssDNA→包裝pUC118/119pBluescriptpGEM-3Zf(±)pTZ18U/R19U/RHelpphage

dsDNA穩(wěn)定，高產(chǎn),具有質(zhì)粒的特征免卻亞克隆至M13

得到10kbssDNA缺點(diǎn)：ssDNA產(chǎn)量低,重復(fù)性差

M13mp→1012pfu5～10g/mlphagemid1/100～1/10影響產(chǎn)量的因素攜帶的IG的確切序列（干擾helper復(fù)制）在plasmid中的位置（干擾helper復(fù)制）helperphage的性質(zhì)外源DNA大小pUC118/119M13KO71-5x1011pfu四、M13KO7（8.7kb）M13的衍生株突變的geneII(間隔區(qū)的插入對復(fù)制影響不大)質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)（p15A）Kanr(Tn903)IG突變M13KO7感染E.coli質(zhì)粒復(fù)制,產(chǎn)生phage蛋白突變的geneII蛋白可作用于M13KO7的突變IG產(chǎn)生ssDNA,產(chǎn)生phageM13KO7感染E.coli(pUC118)質(zhì)粒復(fù)制,產(chǎn)生phage蛋白突變的geneII蛋白優(yōu)先作用于pUC118的IG產(chǎn)生pUC118的ssDNA,產(chǎn)生phage(pUC118)M13KO7→E.coli(pUC118)→ssDNA變成RFDNA→按質(zhì)粒方式復(fù)制并產(chǎn)生所有蛋白（phagemid不干擾M13KO7的早期復(fù)制）→geneII產(chǎn)物優(yōu)先結(jié)合于phagemid上的復(fù)制起點(diǎn)→優(yōu)先合成phagemid(+)ssDNA(強(qiáng)50倍)第五節(jié)

人工染色體載體一、酵母人工染色體載體yeastartificialchromosome酵母的生物學(xué)特征Saccharomycescerevisiae釀灑酵母扁圓形和卵形3m代時90min16條染色體300-2000kb14×106bp14Mb具真核mRNA的加工活性TELori/AmpTrp1ARS1CEN4BamHIBamHISmaIHis3TELori/AmpTrp1ARS1CEN4Sup4URA3TELBamHISmaIURA3TELSmaI原生質(zhì)體和電轉(zhuǎn)化URA3/trpade2-1赭石突變株紅色菌落插入失活BamHI缺點(diǎn):基因組DNA與YAC臂體外連接過程中

產(chǎn)生嵌合體

通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入同一個酵母原生質(zhì)體的

不同YAC克隆的有絲分裂重組也會產(chǎn)生

嵌合體

染色體DNA操作困難

Traregion21genesorioriparA,parBF質(zhì)粒:Cavalli-Sforza(1950)和Hayes（1952），

大腸桿菌接合交配期染色體標(biāo)記的單向轉(zhuǎn)移。

約100kb,

編碼60多種參與復(fù)制、分

配和接合過程的蛋白質(zhì)。

可以整合到宿主染色體中，在大腸桿菌

染色體中有30多個位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)整合。

二、BAC載體

bacterialartificialchromosome

自然發(fā)生的F因子能攜帶1/4的大腸桿

菌染色體而不顯張力或不穩(wěn)定。

拷貝數(shù)低:1

有助于減少DNA分子間重組

保證文庫轉(zhuǎn)化子生長平衡

減小對受體菌的毒副作用為什么會想到把F質(zhì)粒改造成載體？7507bpU5113OriS,repE介導(dǎo)單向復(fù)制parA,parB維持低拷貝cosN來自phage,可被

phage的terminase

特異切割LoxP,類似phage的cosN

來自P1phage,其Cre

蛋白特異性切割該

位點(diǎn)

pBeloBAC11克隆的片段大小10-215kb,平均100kb,少量大于300kb電轉(zhuǎn)化:106/ugDNA,10-100倍高于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化可用于傳統(tǒng)的菌落雜交重組DNA為

ccc質(zhì)粒,而不是線性可用PFGE檢測DNA大小低頻co-cloning實(shí)例嗜堿菌“12-1”

（Bacillussp.）文庫法克隆嗜堿性相關(guān)的基因或基因簇載體：pBeloBAC11受體菌：E.coliDH10B陽性克隆子篩選標(biāo)準(zhǔn)：耐堿1.外源片段的制備

PFGE

pulsefieldgelelectrophoresis150kb總DNAHindIII不完全酶切大，均，純electroelute2.載體的制備HindIII完全酶切，CIAP去磷酸化3.連接載體與外源之比約10：1

避免嵌合克隆的形成常規(guī)連接：外源：載體=3：14.轉(zhuǎn)化

（電轉(zhuǎn)化electroporation）感受態(tài)細(xì)胞的制備：離子轉(zhuǎn)化：12.5kv/cm25uF200Ω

轉(zhuǎn)化子的挑取：LB+Cmx-gal+IPTG5.轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證N=ln(1-p)/ln(1-f)P:文庫中出現(xiàn)陽性克隆的期望值F:插入片段占總DNA的比值

細(xì)菌基因組：2~5Mb

插入片段平均大?。?50kbN=ln(1-0.99)/ln(1-1.5x105/5x106)=150若：N=576p=99.99999%v=（150x103x576）/（5x106)=17.226.文庫的計算PNAS

MichelleR.Rondon

DepartmentofPlantPathology,

UniversityofWisconsin-Madison

WeconstructedaBAClibraryin

Escherichia

coli

fromgenomicDNAoftheGram-positivebacteriumBacillus

cereus.Thislibraryprovides5.75-foldcoverageoftheB.cereus

genome,withanaverageinsertsizeof98

kb.Todeterminethe

extentofheterologousexpressionofB.cereus

genesinthelibrary,

wescreeneditforexpressionofseveralB.cereus

activities

intheE.colihost.7.陽性克隆子篩選堿三、P1載體和PAC載體基于P1噬菌體構(gòu)建

P1噬菌體：P1噬菌體是與λ噬菌體同年(1951)被發(fā)現(xiàn)的。從感染性P1顆粒提取的DNA大小約110kb，為雙鏈、線狀、末端冗余且環(huán)狀變化（34bploxP）的DNA。

溶原：R復(fù)制子RepApar

裂解：162bppaccIPACPAC系由pAd10sacBⅡ

衍化而來，除去了腺病毒的填充片段，插入了基于pUC質(zhì)粒的序列。提高載體的產(chǎn)量，電穿孔轉(zhuǎn)化代替體外包裝。載體左側(cè)：從pBR322衍生來的colE1復(fù)制子

最小的P1包裝位點(diǎn)11kb的腺病毒填充片段載體右側(cè)：Tn903來源的卡那霉素基因P1質(zhì)粒復(fù)制子和分配系統(tǒng)

由lac啟動子驅(qū)動的裂解型P1復(fù)制子

sacB第六節(jié)

表達(dá)載體一、大腸桿菌表達(dá)載體（一）表達(dá)融合蛋白的表達(dá)載體什么是融合蛋白一般為載體系列ATGATGATGATGATG可能移碼，

可能提前終止1.表達(dá)LacZ融合蛋白的載體①pUR278/288/289pUR/290/291/2925.2kbBam/Sal/Xba/H3/ClaIB/S/Pst/H3/ClaIEamproriplaclacZBCEMSC②pEX1/2/35.8kbamprori多個翻譯fdphage終止信號MSClacZlacICroPRPstSalBSmaElacZ的氨基端被噬菌體的Cro和

lacI基因的某些序列替代PR受

cIts857控制，宿主

M5219含缺陷原噬菌體，編碼cIts857和N蛋白cIts857強(qiáng)烈抑制基因轉(zhuǎn)錄N基因可使RNApolymerase跨過基因內(nèi)部潛在終止位點(diǎn)一般采用42-45℃滅活cIts857阻物，此處采用40℃以減少熱激蛋白的誘導(dǎo)并使細(xì)菌能繼續(xù)生長溫度轉(zhuǎn)換不僅可誘導(dǎo)PL/PR啟動子，也可誘導(dǎo)熱激基因，而后者有些可編碼蛋白酶·采用40℃而不是42～45℃·采用cI+溶原菌,并用絲裂霉素C和萘啶酮醇誘導(dǎo)③其它

pUC,2.表達(dá)GST融合蛋白的載體pGEX系列

～4900bppharmaciaBiotechGSTglutathioneS-transferasefromSchistosomajaponicum谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（26kDa）,日本血吸蟲在E.coli易表達(dá)、在融合蛋白狀態(tài)下保持酶學(xué)活性可親和分離、比色/免疫檢測其他:poly(His)6,ProteinAamprorilacIPtacMSCstopcodencleavageGSTsite蛋白酶切割Thrombin,凝血酶,來自bovineplasma牛血漿FactorXa來自bovineplasmaPreScissionProtease基因工程產(chǎn)物,人的humanrhinovirms3C(鼻病毒）4.9kbThrombinLeu-Val-Pro-Arg-↓Gly-Ser-Pro-GluBamHIFactorXaIle-Glu-Gly-Arg↓特異性切割四肽PreScissionProleaseLeu-Glu-Val-Leu-Phe-Glu-↓Gly-Pro與GlutathioneSepharose4B高度親和2.pET-5VectorpET-5a(4134bp)amproriPT7RBS

BamHIEcoRIATGPT7GGAGGTATACATATGGCT….GGATCCGAATTC….NdeI….CGGGATCCGAATTC….….CGGATCCGAATTC….pET-5bpET-5cT7promoter:BL21(DE3)orJM109(DE3)表達(dá)載體pET-36b(+)的質(zhì)粒圖譜ThepET36b(+)vectorisdesignedforexpressionofCBDcenAfusionproteins.Avarietyofdoningsitesandstrategiesareavailable.WhendonedwiththeLICmethod,resultingCBDcenATagfusionproteinscanbecleavedpreciselyatthevector-encodedjunctionusingenterokinase.NotethatthesequenceisnumberedbythepBR322convention,sotheT7expressionregionisreversedonthevectormap.表達(dá)載體pET-36b(+)的組成元件

淋巴毒素（Lymphotoxin，簡稱LT），又名腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，簡稱TNF-），是機(jī)體在應(yīng)急情況下，由激活的淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子。123123

Fig1.5aFig1.5bFig1.5SDSandWesternblotoftheexpressionofCBD-LTΔ27inE.coli1.Proteinmolecularweightmarker2.Totalbacterialprotein,30℃induced3.Totalbacterialprotein,30℃induced重組菌株表達(dá)產(chǎn)物的SDS及Western印跡分析1234Fig2.1SDSanalysisofsolubleCBD-LTΔ27afterinduction1.Proteinmolecularweightmarker2.Totalbacterialprotein,uninduced3.Totalbacterialprotein,30℃induced4.Solublefraction,30℃induced

搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)可溶性融合蛋白的SDS分析12345678Fig2.2SDSanalysisofCBIND100Resinpurifiedsolublefusionprotein1.Proteinmolecularweightmarker5.Supernatantafterwashbufferwashing2.Solublebacterialprotein,30℃induced6.Supernatantoffirsteluting3.SupernatantafterCBDresinbinding7.Supernatantofsecondeluting4Supernatantafterbindbufferwashing8.SupernatantofthirdelutingCBIND100Resin純化可溶表達(dá)的融合蛋白