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微生物感染的診斷與防治1第一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日微生物學(xué)診斷Microbiologicaldiognosis病原學(xué)診斷血清學(xué)診斷直接依據(jù)間接依據(jù)第一節(jié)微生物感染的診斷2第二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(一)細(xì)菌學(xué)診斷標(biāo)本的采集和送檢四原則區(qū)別取材盡快送檢無(wú)菌操作妥善處理3第三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日無(wú)菌采集
嚴(yán)格無(wú)菌操作,避免標(biāo)本被污染。標(biāo)本收集于無(wú)菌容器中,容器須先經(jīng)高壓滅菌、煮沸、干熱等物理方法滅菌,或用一次性無(wú)菌容器,而不能用消毒劑處理。4第四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日取樣部位
不同疾病、不同時(shí)期取不同部位標(biāo)本如流腦病人取CSF、血液或出血瘀斑;傷寒病人在病程1~2周內(nèi)取血液,2~3周時(shí)取糞便。盡可能取病變明顯部位的材料取局部病變標(biāo)本,不可使用消毒劑,必要時(shí)以無(wú)菌生理鹽水沖洗,拭干后取材。5第五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日早期采集
采集時(shí)間最好是病程早期、急性期或癥狀典型時(shí),且必須在抗菌藥物使用前,否則這份標(biāo)本在分離培養(yǎng)時(shí)要加入藥物拮抗劑。6第六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
一般標(biāo)本采集后最好在2h內(nèi)送檢,大多細(xì)菌可4℃冷藏運(yùn)送、特殊(如腦膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌)需保溫立即送檢。糞便標(biāo)本中雜菌多,常置于甘油緩沖鹽水保存液中。盡快送檢、冷藏運(yùn)送
7第七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(二)病原菌的檢驗(yàn)程序檢查致病菌
1、形態(tài)學(xué)檢查
examinationinmorphology直接鏡檢:形態(tài)和染色性上有特征的致病菌,直接涂片鏡檢后有助于初步診斷。如:痰中查抗酸性桿菌,膿液中找G+葡萄串狀球菌,霍亂弧菌等。8第八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日葡萄球菌霍亂弧菌9第九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日AB結(jié)核分枝桿菌A.結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)的鏡下形態(tài)(抗酸染色)B.結(jié)核分枝桿菌痰標(biāo)本直接涂片(抗酸染色)10第十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日2、分離培養(yǎng)(isolationandcultivation):
所有標(biāo)本均應(yīng)作分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)后進(jìn)一步鑒定,根據(jù)不同要求選用不同培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)比直接涂片鏡檢陽(yáng)性率高,但需時(shí)較久;大多細(xì)菌16~24h,結(jié)核桿菌需4~8w。
分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。11第十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日分離培養(yǎng)
isolationandcultivation
分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn),是最可靠的傳統(tǒng)診斷技術(shù)。(圖為普通孵箱)12第十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
厭氧箱厭氧袋13第十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
各種細(xì)菌所具有的酶不完全相同,對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解能力亦不一致,因而其代謝產(chǎn)物有別,藉此可對(duì)不同致病菌進(jìn)行鑒別(如腸道桿菌)。3、生化試驗(yàn)糖發(fā)酵試驗(yàn)14第十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日4、血清學(xué)試驗(yàn):
含特異抗體的免疫血清+未知純種細(xì)菌進(jìn)行血清學(xué)實(shí)驗(yàn),可確定致病菌的種和型。常見(jiàn)有玻片凝集試驗(yàn)。玻片凝集試驗(yàn)15第十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日5、動(dòng)物試驗(yàn):主要用于分離、鑒定致病菌,測(cè)定菌株產(chǎn)毒性等。常用動(dòng)物:小鼠、豚鼠、家兔接種途徑:皮內(nèi)、皮下、腹腔、肌肉、靜脈、腦內(nèi)等。16第十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日6、藥物敏感試驗(yàn)
測(cè)定標(biāo)本中致病菌對(duì)藥物的敏感程度;對(duì)指導(dǎo)臨床用藥及控制感染有重要意義。常用紙碟法和試管稀釋法。17第十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日檢測(cè)致病菌的成分病原菌的抗原病原菌的核酸:免疫熒光ELISA對(duì)流免疫電泳…PCR雜交:Southern,檢測(cè)DNANorthern,檢測(cè)RNA
原位雜交斑點(diǎn)雜交18第十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日19第十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日分子生物學(xué)技術(shù)
molecularbiologicaltechniques
核酸雜交
nucleotidehybridization
原位雜交
insituhybridization
斑點(diǎn)雜交
dotblot
Southernblot
Northernblot
PCR技術(shù):多聚酶鏈反應(yīng)
(polymerasechainreaction,PCR)20第二十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(三)血清學(xué)診斷
采用已知的細(xì)菌或其特異性抗原,檢測(cè)患者血清或其他體液中有無(wú)相應(yīng)特異性抗體及其效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化,可作為某些傳染病的輔助診斷。21第二十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日在血清學(xué)診斷中,最好采取患者急性期和恢復(fù)期雙份血清標(biāo)本。結(jié)果:以抗體效價(jià)明顯高于正常人水平或患者恢復(fù)期抗體效價(jià)比急性期升高≥4倍方有意義。常用有凝集實(shí)驗(yàn)、沉淀實(shí)驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)、中和試驗(yàn)、ELISA等。22第二十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
肥達(dá)試驗(yàn)
玻片凝集實(shí)驗(yàn)23第二十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日細(xì)菌學(xué)診斷基本方法24第二十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日二、病毒學(xué)診斷25第二十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日病毒診斷包括哪些步驟和方法?檢測(cè)內(nèi)容查抗原查特異性抗體
病毒顆粒病毒抗原病毒核酸病毒酶類(lèi):如逆轉(zhuǎn)錄酶
電鏡直接觀(guān)察光鏡檢查包含體分離培養(yǎng)26第二十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
1、采集時(shí)間:用于分離病毒或檢測(cè)病毒及其核酸的標(biāo)本,應(yīng)采集病人急性期標(biāo)本。血清學(xué)檢查的標(biāo)本最好取雙份。
2、標(biāo)本種類(lèi):根據(jù)不同病毒感染采集不同部位標(biāo)本(如鼻咽拭子、腦脊液、血液、糞便或皰疹液)。
(一)標(biāo)本的采集原則27第二十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3、標(biāo)本運(yùn)送:應(yīng)立即送檢,運(yùn)送標(biāo)本中注意冷藏。保存于含抗生素的運(yùn)送液中。不能立即送檢時(shí)應(yīng)存放于-70℃低溫冰箱或液氮內(nèi)保存。4、標(biāo)本處理:有雜菌標(biāo)本應(yīng)用高濃度抗生素處理(4℃)并離心。28第二十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日細(xì)胞培養(yǎng)(cell
culture)動(dòng)物接種(animalinoculation)
雞胚接種(egginoculation)(二)病毒的分離與鑒定29第二十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日1、動(dòng)物接種最原始的病毒培養(yǎng)方法。根據(jù)病毒種類(lèi)不同,選擇敏感動(dòng)物及適宜接種部位。如:狂犬病病毒小鼠腦內(nèi)柯薩奇病毒乳鼠腹腔或腦內(nèi)乙型腦炎病毒小鼠腦內(nèi)優(yōu)點(diǎn):結(jié)果易觀(guān)察,可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn):有飼養(yǎng)條件要求,費(fèi)用高,動(dòng)物體內(nèi)常
帶有潛伏病毒30第三十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日2、雞胚培養(yǎng)絨毛尿囊膜/尿囊腔/羊膜腔/卵黃囊31第三十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日痘苗V、HSVIFV、腮腺炎VIFV嗜神經(jīng)V32第三十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日優(yōu)點(diǎn):易管理,不帶微
生物,成本較低缺點(diǎn):操作程序復(fù)雜33第三十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
流感病毒分離培養(yǎng)的最好方法是雞胚接種。接種羊膜腔(初次分離),尿囊腔(傳代);然后取羊水或尿囊液做血凝和血凝抑制試驗(yàn)鑒定。血凝試驗(yàn):羊水/尿囊液+雞RBC紅細(xì)胞凝集表明有病毒存在和增殖34第三十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
血凝實(shí)驗(yàn)35第三十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3、細(xì)胞培養(yǎng)
是從機(jī)體中取出組織或細(xì)胞,模擬機(jī)體內(nèi)的生理?xiàng)l件在體外進(jìn)行培養(yǎng),使之生存和生長(zhǎng)。36第三十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日病毒的細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶單層細(xì)胞37第三十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn):來(lái)源方便,容易選擇易感細(xì)胞。無(wú)免疫力,利于病毒生長(zhǎng)。培養(yǎng)條件易于控制:可以用人工控制溫度、氣體、pH、培養(yǎng)基成分。接種量大:細(xì)胞可以大量生產(chǎn),而且還可較久地持續(xù)培養(yǎng)。動(dòng)物和雞胚的接種均受數(shù)量、年齡、途徑的限制。加速病毒分離過(guò)程:病毒分離采用細(xì)胞培養(yǎng)不僅陽(yáng)性率高,而且分離過(guò)程可顯著加速,早出結(jié)果。38第三十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(1)細(xì)胞類(lèi)型原代細(xì)胞動(dòng)物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長(zhǎng)。(人胚肺細(xì)胞,雞胚細(xì)胞、猴腎細(xì)胞、兔腎細(xì)胞等)39第三十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日二倍體細(xì)胞在體外連續(xù)培養(yǎng)50~60代仍保持其二倍染色體數(shù)目的細(xì)胞。為生產(chǎn)人用疫苗的首選細(xì)胞株。傳代細(xì)胞能在體外連續(xù)傳代,來(lái)自腫瘤細(xì)胞或發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化、突變的原代細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株。40第四十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)用途原代細(xì)胞
多種V敏感來(lái)源困難、成本高、分離攜帶潛伏病毒二倍體細(xì)胞
多種V敏感來(lái)源易,50代診斷/疫苗制備傳代細(xì)胞
無(wú)限傳代,來(lái)源易致瘤性分離/鑒定/研究V41第四十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(2)病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖的指征①細(xì)胞的變化細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE):病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖后,可引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,如細(xì)胞腫脹、變圓、皺縮、融合或細(xì)胞聚集成葡萄串狀,甚至細(xì)胞溶解或脫落等,這種可在普通光鏡下看到的由病毒增殖引起的細(xì)胞形態(tài)變化,稱(chēng)為CPE。包涵體42第四十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)43第四十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日44第四十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日包涵體形成45第四十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日②紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象某些病毒感染的宿主細(xì)胞能吸附脊椎動(dòng)物的紅細(xì)胞。③干擾現(xiàn)象46第四十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日4、病毒的鑒定(1)病毒種類(lèi)與型別鑒定初步鑒定:動(dòng)物感染范圍及潛伏期、對(duì)雞胚的敏感性、細(xì)胞形態(tài)變化類(lèi)型、紅細(xì)胞吸附、病毒干擾現(xiàn)象、血凝性質(zhì)、理化性質(zhì)(核酸類(lèi)型測(cè)定、大小形態(tài)、乙醚敏感試驗(yàn)、耐酸試驗(yàn))等。最后鑒定:主要是血清學(xué)方法(中和試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、血凝抑制試驗(yàn)、IFA和ELISA等)和分子生物學(xué)方法。47第四十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(2)病毒感染性測(cè)定50%組織培養(yǎng)感染量(50%tissuecultureinfectivedose,TCID50):
引起半數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生病變(CPE)的病毒量。蝕斑形成單位(plaqueformingunit,PFU):
在細(xì)胞培養(yǎng)表面覆蓋一層半固體物質(zhì)使細(xì)胞病變形成蝕斑。48第四十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日病毒標(biāo)本(充分稀釋?zhuān)龁螌蛹?xì)胞↓37℃,60min,吸附,洗滌覆蓋瓊脂↓37℃,3~5d觀(guān)察蝕斑(中性紅/結(jié)晶紫染色)PFU/ml:定量測(cè)定病毒感染性49第四十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(三)血清學(xué)診斷中和試驗(yàn):中和試驗(yàn)是指病毒在活體內(nèi)或細(xì)胞培養(yǎng)中被特異性抗體中和而失去感染性的一種試驗(yàn)??捎脕?lái)檢查患病后或人工免疫后機(jī)體血清中抗體的增長(zhǎng)情況,也可用來(lái)鑒定病毒或研究其抗原結(jié)構(gòu)。中和抗體特異性高,維持時(shí)間較長(zhǎng),因此流行病學(xué)常用此法。50第五十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日血凝抑制試驗(yàn):許多病毒能凝集雞、豚鼠、人等的紅細(xì)胞,稱(chēng)為血凝現(xiàn)象。這種現(xiàn)象能被相應(yīng)抗體所抑制,稱(chēng)血凝抑制試驗(yàn)。常用于含血凝素的病毒(如流感病毒、乙腦病毒)的輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn):可作為近期感染的指標(biāo)。ELISA:可檢測(cè)多種病毒抗體,應(yīng)用廣泛。51第五十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日形態(tài)學(xué)檢查1、光學(xué)顯微鏡檢查:檢查包涵體2、電子顯微鏡檢查:如輪狀病毒、冠狀病毒等病毒抗原檢查
有免疫熒光(IFA)、放射免疫技術(shù)、酶免疫技術(shù)(EIA)等。(四)病毒感染的快速診斷52第五十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日輪
狀
病
毒53第五十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日特異性抗體(IgM)的檢測(cè):
如:HAV、風(fēng)疹病毒和針對(duì)EBV早期抗原的抗體;用于急性感染,特別是先天性感染的診斷。檢測(cè)病毒核酸:
包括核酸分子雜交技術(shù)和PCR,如HBV、HCV、HSV、CMV等的檢測(cè)。
54第五十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日三、真菌學(xué)診斷(一)標(biāo)本采集的原則
55第五十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(二)病原性真菌的分離與鑒定1.直接鏡檢不染色標(biāo)本:皮屑、毛發(fā)、指(趾)甲屑等置玻片上,加10%KOH、微微加溫,軟化角質(zhì)。輕壓蓋玻片,使標(biāo)本變薄透明,然后鏡檢。如觀(guān)察到菌絲和孢子,可初步診斷。染色標(biāo)本:GS、墨汁負(fù)染2.分離培養(yǎng)標(biāo)本處理后接種沙保培養(yǎng)基或血平板上,觀(guān)察菌落及菌絲孢子形態(tài)等加以鑒定,必要時(shí)作小培養(yǎng)。56第五十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)4.核酸的檢測(cè)5.真菌毒素的檢測(cè)57第五十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日第二節(jié)微生物感染的防治原則58第五十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日一、細(xì)菌感染的特異性防治
特異性防治是應(yīng)用特異性免疫的原理,給機(jī)體注射或服用病原微生物抗原(包括類(lèi)毒素)或特異性抗體以達(dá)到預(yù)防和治療感染性疾病的目的。這種方式稱(chēng)為人工免疫。人工免疫分為人工主動(dòng)免疫和人工被動(dòng)免疫兩種。59第五十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日(一)人工主動(dòng)免疫人為地將疫苗(vaccine)或類(lèi)毒素接種于人體,使機(jī)體主動(dòng)產(chǎn)生特異性免疫力的一種防治微生物感染的措施。常用人工主動(dòng)免疫制劑有:
60第六十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日常用制劑疫苗
----滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、重組活載體疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗和治療性疫苗。類(lèi)毒素61第六十一頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日1.死疫苗:選用免疫原性強(qiáng)的細(xì)菌經(jīng)人工大量培養(yǎng)后,用理化方法殺死而成。如傷寒、百日咳、霍亂等。優(yōu)點(diǎn):易于保存。缺點(diǎn):接種劑量大;維持時(shí)間短;接種次數(shù)多;注射的局部和全身性副反應(yīng)較大;不產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答。62第六十二頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日2.減毒活疫苗:
用減毒或無(wú)毒力的活病原體制成;如BCG優(yōu)點(diǎn):只需接種一次、接種劑量較小、副反應(yīng)輕微或無(wú)、免疫效果好且持久、能同時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫;以自然途徑接種,有SIgA抗體的局部粘膜免疫形成。缺點(diǎn):不易保存(冷藏且保存期短)、回復(fù)毒力的危險(xiǎn)性63第六十三頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日區(qū)別點(diǎn)死疫苗活疫苗制劑特點(diǎn)死,強(qiáng)毒株活減毒株接種劑量與特點(diǎn)量較大,2~3次量較小,1次保存及有效期易保存,約1年不易保存免疫效果較低,體液免疫,維持?jǐn)?shù)月~2年較高,體液及細(xì)胞免疫均有,維持3~5年甚至更長(zhǎng)死疫苗與活疫苗的區(qū)別64第六十四頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日3.亞單位疫苗:
用化學(xué)方法裂解和提取或通過(guò)基因工程產(chǎn)生的細(xì)菌保護(hù)性抗原組分制成的疫苗。如:腦膜炎球菌的莢膜多糖,乙肝疫苗等。65第六十五頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日4.核酸疫苗/DNA疫苗/基因疫苗
將能編碼誘發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的病原體基因片段和能在真核細(xì)胞表達(dá)的質(zhì)粒重組,直接注入宿主體內(nèi)使其表達(dá)目的免疫原,進(jìn)而誘導(dǎo)出保護(hù)性抗體和細(xì)胞免疫的新型疫苗。核酸疫苗的出現(xiàn)與發(fā)展是疫苗發(fā)展史上的第三次革命。66第六十六頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日類(lèi)毒素:
外毒素經(jīng)0.3~0.4%甲醛作用3~4周后,毒性消失仍保持免疫原性的制品。如白百破三聯(lián)疫苗(DPT)是將白喉類(lèi)毒素、百日咳死菌苗、破傷風(fēng)類(lèi)毒素混合而成。67第六十七頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日
(二)人工被動(dòng)免疫
給機(jī)體注射含特異性抗體的免疫血清或純化免疫球蛋白抗體,或細(xì)胞因子等制劑,使機(jī)體即刻獲得特異性免疫力的過(guò)程,以治療或緊急預(yù)防感染。人工被動(dòng)免疫常用試劑有:68第六十八頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日1、抗毒素:
一般用細(xì)菌類(lèi)毒素或外毒素多次免疫馬后采血,從血清中提取免疫球蛋白精制而成??苟舅啬苤泻拖鄳?yīng)的外毒素,阻斷其毒性作用。例如用于白喉、破傷風(fēng)等疾病。注射前需做皮膚試驗(yàn)。應(yīng)早期、足量注射。
69第六十九頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日2、抗菌血清3、胎盤(pán)球蛋白/丙種球蛋白
主要用于免疫力低下的人或者球蛋白缺乏患者。4、免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子
IFN-γ、IL、CSF等70第七十頁(yè),共七十九頁(yè),2022年,8月28日區(qū)別要點(diǎn)
人工主動(dòng)免疫
人工被動(dòng)免疫免疫物質(zhì)抗原或類(lèi)毒素抗體或細(xì)胞因子免疫出現(xiàn)時(shí)間慢,2~4周快,立即免疫維持時(shí)間長(zhǎng),數(shù)月~數(shù)年短,2~3周
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