引物設(shè)計和實(shí)時熒光定量pcr

引物設(shè)計和實(shí)時熒光定量pcr第一頁，共七十八頁，2022年，8月28日一、熒光定量PCR技術(shù)的基礎(chǔ)理論第二頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、熒光定量PCR技術(shù)概論熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代，由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時監(jiān)控，并且自動化程度高，所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時間，在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。第三頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、熒光定量PCR技術(shù)概論熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程，并通過分析軟件對PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。系統(tǒng)組成：定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

第四頁，共七十八頁，2022年，8月28日常規(guī)PCRvs實(shí)時PCR常規(guī)PCR：借助電泳對擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析定量PCR技術(shù)：利用熒光信號的變化實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終精確的對起始模板的定量分析第五頁，共七十八頁，2022年，8月28日常規(guī)PCRvs實(shí)時PCR優(yōu)缺點(diǎn)比較

定量PCR

常規(guī)PCR靈敏度高高精確度安全省時只能進(jìn)行半定量或定性分析不安全易污染費(fèi)時費(fèi)力第六頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念擴(kuò)增曲線、閾值、CT值（1）、擴(kuò)增曲線及擴(kuò)增曲線的兩種形式

左圖反映的是隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行相應(yīng)的熒光信號的變化，比較直觀，但是指數(shù)期很短；右圖反映的是熒光信號的變化量的對數(shù)與PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)的關(guān)系，從右圖可知，指數(shù)期很明顯，在確定閾值線時具有簡單明了的特點(diǎn)，所以很多軟件都采用右圖的形式，當(dāng)然了，這兩種實(shí)時擴(kuò)增曲線可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的需要相互轉(zhuǎn)換。第七頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念（2）、閾值線在熒光定量PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，畫一條線，在此直線上，所有樣品的熒光強(qiáng)度與其本底熒光強(qiáng)度的差值全部相同。第八頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、熒光定量PCR常用的三個概念（3）、CT值

PCR過程中，各樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時，所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。第九頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)熒光定量PCR是隨著PCR循環(huán)的進(jìn)行，以熒光信號強(qiáng)度的積累來實(shí)時反映PCR反應(yīng)進(jìn)程的。理想的熒光物質(zhì)需具備以下特點(diǎn)：（1）、本底低（2）、熒光強(qiáng)度高（3）、每輪PCR反應(yīng)完成后都有熒光強(qiáng)度的增高，而且這種熒光強(qiáng)度的增高和每輪循環(huán)后PCR產(chǎn)物的量成線性關(guān)系（4）、沒有PCR產(chǎn)物時，沒有熒光（5）、該熒光物質(zhì)的受激發(fā)后其發(fā)射光的波長范圍窄，各種熒光不會產(chǎn)生熒光的交叉干擾第十頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)目前常用的幾種熒光物質(zhì)（1）、Taqman探針類5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針完整時，沒有熒光，探針斷裂后，在激發(fā)光的作用下，熒光基團(tuán)產(chǎn)生熒光；探針本身序列與目的基因序列互補(bǔ)，特異性高，退火后探針與目的基因互補(bǔ)序列結(jié)合，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，在Taq酶5’---3’外切酶的作用下，探針?biāo)鈹嗔?，熒光產(chǎn)生。第十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman常用的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)熒光基團(tuán)：5’端常用熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記，最佳激發(fā)光波長：494-495nm，最大發(fā)射光波長：518-520nm。淬滅基團(tuán)：TAMRA、BHQ、ECLIPSE等。

TAMRA本身也是一種熒光基團(tuán)，激發(fā)光波長范圍較寬，500—560nm，最佳激發(fā)光波長在560nm附近，對FAM基團(tuán)產(chǎn)生的發(fā)射光具有較好的吸收作用；其發(fā)射光波長較寬，560—650nm，當(dāng)做多重?zé)晒鈺r，容易產(chǎn)生熒光交叉干擾，并且本底較高，故現(xiàn)已不常用。

BHQ和ECLIPSE為非熒光物質(zhì)，只是一種熒光淬滅劑，本身不會產(chǎn)生熒光，光吸收范圍較寬，因此本底較低，作為淬滅基團(tuán)較為常用，尤其在多重?zé)晒舛縋CR時常常被采用。第十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)Taqman探針的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高本身具有序列特異性，保證了所檢測目的基因的特異性；其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)保證了其所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比關(guān)系，因此準(zhǔn)確性極高。（2）、對引物及試劑要求不高，配套的普通引物就可以使用，普通的Taq酶就能滿足實(shí)驗(yàn)的要求。（3）、常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達(dá)幾十個拷貝)

及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（4）、目前價格也不是太貴，2OD1000.00左右第十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)（2）、熒光染料類目前常用的熒光染料為SYBRGreenⅠ、SYBRGreenⅡ、

SYTO9、HRM等。其共同性質(zhì)為：（a）、結(jié)合于雙鏈核酸的小溝處（b）、與雙鏈DNA結(jié)合后受激產(chǎn)生熒光（c）、在變性條件下雙鏈分開，熒光消失第十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、熒光定量PCR的化學(xué)基礎(chǔ)熒光染料的特點(diǎn)及應(yīng)用（1）、能夠與所有的核酸雙鏈結(jié)合，受激后產(chǎn)生熒光，其熒光的強(qiáng)度與雙鏈核酸的含量及長度成正比，因此本底較高；（2）、可做雙鏈核酸的熔解曲線分析；（3）、SYBRGreenⅠ染料本身價格便宜，但是做熒光定量PCR時對引物設(shè)計的要求很高；對Taq酶要求較高，最好是HotStarTaq酶，或者操作時需要嚴(yán)格的冷啟動，冰上操作，否則引物二聚體及非特異性擴(kuò)增會嚴(yán)重干擾結(jié)果的準(zhǔn)確性，尤其是模板含量較低時；（4）、適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；（5）、在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（6）、對PCR反應(yīng)的毒性，能抑制PCR反應(yīng)，降低PCR反應(yīng)的效率。第十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日兩種化學(xué)試劑的比較化學(xué)試劑工作原理有否淬滅劑信號檢測階段SYBRGreenI結(jié)合于雙鏈DNA的小溝中否延伸TaqMan水解型雜交探針（5‘-3’外切）有任何步驟第十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理對于普通的PCR反應(yīng)來說

n

Xn=X0（1＋E）上式中，

Xn為n輪PCR循環(huán)后，目的基因PCR產(chǎn)物的量；n為PCR循環(huán)數(shù)；X0為目的基因的初始模板量，E為PCR的反應(yīng)效率，0≤E≤1。第十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理

由于PCR反應(yīng)體系中熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量成正比，所以用熒光強(qiáng)度來代替PCR產(chǎn)物的量，我們可以得到：

Rn=RB+X0(1+E)Rsn總熒光信號強(qiáng)度=本底信號+分子數(shù)量×單位信號強(qiáng)度Rn：第n個循環(huán)時的總信號RB：本底RS：單位信號強(qiáng)度X0：起始DNA數(shù)目E：PCR效率第十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、熒光定量PCR的數(shù)學(xué)原理當(dāng)循環(huán)數(shù)n等于CT值時，所有樣品熒光信號強(qiáng)度變化量的對數(shù)全部一致，都達(dá)到了閾值。

RT=RB+X0(1+E)Rslg(RT-RB)=lgX0+CTlg(1+E)+lgRsCTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs

此時，PCR反應(yīng)處于指數(shù)期階段，所有樣品的反應(yīng)效率E穩(wěn)定且近似相等；lg(RT-RB)、Rs也都相同，只有CT值和-lgX0為變量，且這兩個變量之間成一次性方程。也就是說，所有樣品的lgX0與到達(dá)閾值時的循環(huán)數(shù)n（Ct值）呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量CT第十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析CTlg(1+E)=-lgX0+lg(RT-RB)–lgRs（1）、PCR效率相等，在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期，E穩(wěn)定且為常數(shù)；（2）、RT

–RB要相等；也就是說到達(dá)閾值時樣品的熒光強(qiáng)度與樣品的熒光本底之差要相等；（3）、樣品的單位信號強(qiáng)度Rs要相等，用熒光染料做熒光基團(tuán)時，Rs就是每條PCR產(chǎn)物結(jié)合熒光染料后所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，此熒光強(qiáng)度和

PCR產(chǎn)物的長短有關(guān)，PCR產(chǎn)物越長，結(jié)合的熒光染料越多，Rs值越大；用探針做熒光基團(tuán)時，Rs就等于PCR反應(yīng)時，Taq酶水解掉探針，探針的發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度，和PCR產(chǎn)物的長度沒有直接關(guān)系。第二十頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析左圖橫坐標(biāo)是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度Rn，改圖反映的是各個樣品隨著每輪PCR反應(yīng)，其總的熒光量的實(shí)時變化；右圖橫坐標(biāo)也是PCR循環(huán)次數(shù)，縱坐標(biāo)是總的熒光強(qiáng)度與熒光本底的差值RT–RB即△Rn的對數(shù)，在右圖中確定閾值線，該直線上所有樣品的RT–RB的對數(shù)都相同，熒光定量PCR的線性關(guān)系才會成立。第二十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日5、熒光定量PCR線性關(guān)系成立的條件分析LogX0與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)未知樣品Ct值，就可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出未知樣品初始模板量。第二十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析使用熒光染料作為熒光基團(tuán)時，由于熒光染料的特性隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，SYBRGreenⅠ與雙鏈PCR產(chǎn)物結(jié)合后熒光越來越強(qiáng)，當(dāng)PCR反應(yīng)結(jié)束時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，此時對PCR產(chǎn)物進(jìn)行緩慢加熱，從50℃一直加熱到99℃，在此過程中PCR產(chǎn)物按照TM值的大小雙鏈被依次打開，熒光強(qiáng)度也隨著雙鏈的打開依次減弱，如下圖：第二十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析對于核酸序列相同的PCR產(chǎn)物，其TM值也相同，而且其TM值在一個很小的溫度范圍內(nèi)，在此溫度區(qū)間，其序列相同的核酸雙鏈全部打開，熒光強(qiáng)度急劇降低，以熒光強(qiáng)度的變化率和溫度來作圖，則可得到如下圖：第二十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日6、雙鏈核酸的熔解曲線分析上圖就是熔解曲線，熔解曲線反映的是一定序列長度的核酸雙鏈，在一定的離子強(qiáng)度下的TM值。核酸雙鏈的TM值由雙鏈核苷酸之間相連接的氫鍵決定，不同的核酸雙鏈，其TM值也不同，所以通過熔解曲線，我們能獲知雙鏈核酸的均一性、野生型和突變型雙鏈之間的堿基差異等，如果采用高分辨率熒光染料，鏈條核酸雙鏈哪怕只有一個堿基的差異，通過熔解曲線也能分析出來。電泳是通過核酸分子量的大小和構(gòu)象來分析的，熔解曲線是根據(jù)雙鏈核酸的TM值來分析的，這與瓊脂糖電泳及SSCP有異曲同工之處。第二十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達(dá)的相對定量分析

研究基因表達(dá)的情況，我們只需搞清楚該基因在不同生理階段的變化趨勢如何就行了，而無需知道該基因的絕對量有多少。

實(shí)驗(yàn)操作中，由于樣品選取時樣品的細(xì)胞個數(shù)不可能完全相同，RNA提取時得率不同、RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA的效率不同等客觀因素，用于定量分析的初始樣品濃度不同，這就造成了比較上的混亂，因此在進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控研究中都會用一些看內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化，以校正因樣品初始濃度不同而造成的差異。常用的內(nèi)參基因是在各種生理?xiàng)l件下表達(dá)量恒定的基因，這些基因也常被稱為看家基因，該基因表達(dá)一般不隨外界的變化而變化，所以常被用作內(nèi)參照，常用的內(nèi)參基因有RPS16基因、GAPDH基因、β-Actin基因、18srRNA基因等。第二十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達(dá)的相對定量分析以上公式就是引入內(nèi)參基因后相對定量分析的基本公式，并由此派生出兩種相對定量的分析方法：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和Delta-deltaCt法。第二十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達(dá)的相對定量分析（1）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法所謂的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法就是對每個樣品的內(nèi)參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內(nèi)參基因和目的基因的絕對數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達(dá)。（2）、2-△△CT法該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實(shí)驗(yàn)中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。第二十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日7、mRNA差異表達(dá)的相對定量分析（2）、2-△△CT法

該方法的前提條件是目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相同且都為1，在試驗(yàn)開始前必須分別對目的基因和內(nèi)參基因作標(biāo)準(zhǔn)曲線，看兩者擴(kuò)增效率的差別，假如兩者擴(kuò)增效率之間的差異小于0.1，就可以用該方法分析。而且在接下來的實(shí)驗(yàn)中，無需再做標(biāo)準(zhǔn)品。該方法要求嚴(yán)格的重復(fù)，因?yàn)镃T值的差異只要有很小的變化，測得的結(jié)果就會有很大的差別。該方法特別適合于樣品量不大，但是檢測的基因種類很多的情況。第二十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日二、引物設(shè)計及原則第三十頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、染料法引物的設(shè)計原則：（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物自身形成環(huán)狀發(fā)卡結(jié)構(gòu)；（3）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；（4）、引物之間的TM相差避免超過2℃；（5）、典型的引物18到24個核苷長；（6）、目的基因和內(nèi)參基因所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于

300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同（7）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性

第三十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設(shè)計原則：

在Taqman探針法中，Taq酶除了5’-3’聚合酶作用之外，還要5’-3’外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，普通PCR的延伸溫度為72℃，此溫度為Taq酶聚合作用的最佳溫度；Taqman探針法反應(yīng)中，在要求Taq酶5’-3’聚合酶活性的同時，還需要Taq酶5’-3’外切酶的活性來切斷探針鏈產(chǎn)生熒光，Taq酶5’-3’外切酶活性的最佳溫度為60℃，所以TaqmanPCR反應(yīng)的一般采用兩步法，即95℃變性，60℃復(fù)性延伸。

在Taqman探針及引物的設(shè)計過程中，引物的TM值已經(jīng)確定為60℃左右，在每輪PCR循環(huán)的復(fù)性過程中（95→60℃），為了確保探針先于引物與模板結(jié)合，這就要求探針的TM值高于引物10℃左右，所以Taqman探針及引物一般都是引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右。第三十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設(shè)計原則：（1）、序列選取應(yīng)在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴(kuò)增，引物設(shè)計最好能跨兩個外顯子；（3）、引物TM值為60℃左右，探針的TM值為70℃左右；（4）、探針的5’端應(yīng)避免使用鳥嘌呤G，因?yàn)?’G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用；

（5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量G含量高會降低反應(yīng)效率，這時就應(yīng)選擇配對的另一條鏈作為探針；（6）、引物之間的TM相差避免超過2℃；（7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp；（8）、PCR產(chǎn)物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；（9）、將設(shè)計好的引物用序列分析軟件分析其二級結(jié)構(gòu)并做BLAST分析其特異性

第三十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、Taqman探針及引物的設(shè)計原則：探針中GC含量的差異對定量PCR反應(yīng)效率的影響第三十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、Taqman探針及引物合成時注意事項(xiàng)（1）、引物及探針設(shè)計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）、先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通

PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物，看是否和設(shè)計的長度吻合，再看看非特異性擴(kuò)增情況，必要時進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證；（3）、確定引物沒有問題后，再將探針?biāo)徒缓铣桑@樣安排能避免很多以外的損失；（4）、探針合成好后，先檢測一下探針的質(zhì)量，250nm的探針終濃度，

25ul水，反應(yīng)體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測，

95℃，2min;95℃，20s，60℃，20s，40個cycles；看熒光本底和熒光強(qiáng)度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應(yīng)，熒光強(qiáng)度不會變化，假如熒光強(qiáng)度變化的比較大，說明探針合成質(zhì)量較差，建議重新合成。第三十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日4、引物設(shè)計的具體步驟及操作詳解（1）、在Pubmed中查找引物基因的全序列；第三十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第三十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日（2）、用primer3.0引物序列及大小設(shè)計；在網(wǎng)頁中搜索Primer3第四十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日將上一步中在Word中粘貼的基因序列信息，復(fù)制到Primer3中，如圖：第四十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日（3）、在Pubmed中找引物序列中各個內(nèi)含子外顯子片段構(gòu)架，確保設(shè)計的引物序列跨兩個外顯子；第四十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日第四十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日第五十頁，共七十八頁，2022年，8月28日三、內(nèi)參基因的選擇第五十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日1、理想的內(nèi)參基因具有的特點(diǎn)（1）、不存在假基因；（2）、高度或中度表達(dá)，排除太高或低表達(dá)（3）、穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織(如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞)，而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；（4）、表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)；（5）、其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；（6）、不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響，如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。理想的內(nèi)參基因很少或者說不存在，因?yàn)樗谢蛟诓煌募?xì)胞或組織中、在細(xì)胞的不同生理時期、在不同的理化等外界刺激下，其表達(dá)量都會有所差異，有時可以是幾倍、幾十倍甚至是上百倍的差異。盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能引致錯誤甚至相反的結(jié)論。第五十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日2、常用內(nèi)參基因的表達(dá)情況（1）、GAPDHGAPDHmRNA在不同癌組織(包括肺癌、乳腺癌、腎細(xì)胞癌等)中的表達(dá)升高，在不同個體間、懷孕期間以及細(xì)胞周期的不同階段等變化很大，在正常的結(jié)腸上皮、人類前列腺癌的細(xì)胞周期不同階段也呈現(xiàn)出顯著性變化。在各種因素(例如低氧、胰島素、地塞米松、絲裂原、表皮生長因子等)刺激下，培養(yǎng)細(xì)胞GAPDHmRNA的表達(dá)水平也不同。（2）、β-actin

當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時，β-actinmRNA的表達(dá)水平增加。（3）、Rps16等第五十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日3、內(nèi)參基因的選擇策略根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，不同組織、不同細(xì)胞、細(xì)胞的不同生理時期、不同的理化條件刺激等，查閱相關(guān)資料，選取三、四合適的內(nèi)參基因，做熒光定量PCR，先以CT值最小的那條基因作為內(nèi)參，其他幾條內(nèi)參基因與其相比，分析所得的比值，找出比值穩(wěn)定的幾條基因，比值穩(wěn)定說明該基因表達(dá)穩(wěn)定，適合作為理想的內(nèi)參。也可用geNorm內(nèi)參分析軟件來選擇合適的內(nèi)參基因。對于比較精確的實(shí)驗(yàn)，最好采用兩種或兩種以上表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參，對每種內(nèi)參基因測得的基因表達(dá)變化求方差和平均值。

第五十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日四、定量PCR的實(shí)驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)處理第五十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR實(shí)驗(yàn)方案定量PCR實(shí)驗(yàn)方案熒光染料法Taqman探針法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△CT法雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法2-△△CT法第五十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR實(shí)驗(yàn)方案（1）、染料法適合于基因含量及基因表達(dá)變化的粗略分析或初篩；在分析的基因種類很多，但是樣品量很少時，尤其適用。（2）、探針法適合常被用作基因含量的精確檢測(精確度可達(dá)幾十個拷貝)

及基因表達(dá)變化的精確分析（精確度可達(dá)0.1倍的變化）。（3）、雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法適合樣品量大、檢測的基因種類相對較少、精度要求較高的實(shí)驗(yàn)。（4）、2-△△CT法適合檢測精度要求一般，樣品量相對較少，檢測的基因種類相對較多的實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際情況，如檢測的精度要求、樣品數(shù)量、基因數(shù)量、經(jīng)費(fèi)情況等來選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。第五十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日絕對定量與相對定量絕對定量：精確的計算初始反應(yīng)的模板濃度（DNA，RNA）相對定量：計算初始反應(yīng)模板的相對含量第五十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR--絕對定量標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線已知濃度的相應(yīng)DNA模板，按不同濃度稀釋根據(jù)實(shí)時PCR反應(yīng)得到相應(yīng)的C(t)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時進(jìn)行PCR反應(yīng)得到未知濃度樣品的C(t)值unknown104103第五十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日使用定量PCR進(jìn)行絕對定量的優(yōu)勢敏感性高檢測低拷貝數(shù)樣品：單拷貝大范圍拷貝數(shù)樣品同時檢測100—1010省時有效第六十頁，共七十八頁，2022年，8月28日定量PCR--相對定量相對定量的目的比較基因在不同情況下的表達(dá)差異（倍數(shù)關(guān)系）相對定量的問題樣品材料不均一造成的差別內(nèi)標(biāo)基因內(nèi)標(biāo)通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因（內(nèi)標(biāo)基因的表達(dá)要相對恒定，表達(dá)不受處理因素影響）對目的基因進(jìn)行均一化：去除樣本間加樣量不同帶來的誤差第六十一頁，共七十八頁，2022年，8月28日SYBRGreenI法進(jìn)行相對定量的問題問題：SYBRGreenI可以與非特異性雙鏈結(jié)合非特異產(chǎn)物信號結(jié)果不準(zhǔn)確解決辦法：引入熔鏈曲線分析第六十二頁，共七十八頁，2022年，8月28日熔鏈曲線分析決定退火溫度Non-specificproductspecificproductspecificproduct第六十三頁，共七十八頁，2022年，8月28日五、實(shí)時定量PCR兩種相對定量方法比較相對雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法和2-ΔΔc(t)

法第六十四頁，共七十八頁，2022年，8月28日1.相對標(biāo)準(zhǔn)曲線法用目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)品分別獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線處理與未處理樣品同時擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因，獲得C(t)值用內(nèi)標(biāo)基因?qū)δ繕?biāo)基因均一化處理樣本與未處理樣本目標(biāo)基因C(t)值經(jīng)內(nèi)參基因均一化后相除，即可得出處理樣本與未處理樣本的表達(dá)差異適用范圍目標(biāo)基因與內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率差異較大擴(kuò)增效率較低第六十五頁，共七十八頁，2022年，8月28日2.2-ΔΔc(t)

法公式推導(dǎo)M:目標(biāo)基因，N：內(nèi)標(biāo)基因XC(t)M=X0M*2C(t)M=A(域值)(1)XC(t)N=X0N*2C(t)N=A(域值)(2)均一化(1)/(2):X0M/X0N=2C(t)N-C(t)M=2-ΔC(t)處理2與處理1相比：

(X0M2/X0N2):(X0M/X0N)=2-ΔC(t)2-ΔC(t)1=2-ΔΔC(t)ΔΔC(t)=(C(t)M2-C(t)N2)-(C(t)M1-C(t)N1)當(dāng)有多個樣品時（如時間點(diǎn)），各樣品均一化后都與同一時間點(diǎn)相比第六十六頁，共七十八頁，2022年，8月28日一般步驟選定目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因設(shè)計一步法或兩步法RT-PCR反應(yīng)數(shù)據(jù)獲得及處理目標(biāo)基因C(t)值（處理，未處理）內(nèi)標(biāo)基因C(t)值（處理，未處理）計算2-ΔΔc(t)

作圖適用范圍當(dāng)擴(kuò)增效率較高，且目標(biāo)基因和內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效率比較一致不做標(biāo)準(zhǔn)曲線，高通量檢測第六十七頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（1）、實(shí)驗(yàn)方案本身的誤差熒光染料法由于染料本身的特性，不可避免的會引起誤差；

2-△△CT法由于也是一種近似的算法，所以不可避免的也會引起誤差；

Taqman探針法誤差相對較??；雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法誤差相對較小。（2）、儀器設(shè)備引起的誤差測量標(biāo)準(zhǔn)品核酸濃度時，分光光度計的誤差，從光密度值到質(zhì)量再到摩爾量，誤差本身就很大（雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法不一定非要測標(biāo)準(zhǔn)品的濃度）；定量PCR儀的誤差耗材引起的誤差，96空板封口膜透光性的差異等第六十八頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范1、誤差分析（3）、相對定量時內(nèi)參基因表達(dá)不穩(wěn)定引起的誤差（4）、操作引起的誤差樣品處理、選取、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄、加樣，操作過程中引起的誤差。2、操作規(guī)范熒光定量PCR是一項(xiàng)對操作要求很高的實(shí)驗(yàn)，同時又是花費(fèi)很高的一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，這就要求必須最大程度的減少誤差或避免錯誤。要想達(dá)到這個目標(biāo)，我們必須從樣品的選取開始到上樣檢測，每一步都要規(guī)范操作。（1）、樣品的處理及選取處理樣品時，必須確保樣品都得到了充分的處理。如測定一種藥物到小白鼠免疫系統(tǒng)的影響，必須做到每次飼喂時此藥品完全被小白鼠攝食；選取試驗(yàn)樣品時，要保證選取的組織盡可能的純，不要污染其他組織，如選取脾臟組織時，盡可能的選取脾臟，不能混有結(jié)締組織等，樣品選取好后，即可放入液氮或超低溫冰箱保存。第六十九頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范（2）、核酸提取加入液氮研磨要徹底，蛋白、多糖、多酚類物質(zhì)要去除干凈，確保得到高質(zhì)量的核酸，分光光度計檢測核算質(zhì)量，RNAOD260/280＝

2.0左右，DNAOD260/280＝1.8左右，最好再做電泳檢測；同一樣品要提取2到3個RNA，所剩余的樣品不要丟棄，繼續(xù)低溫保存。（3）、得到的RNA立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RNA樣品最好不要存放，反轉(zhuǎn)錄所得

cDNA要用看家基因檢測。（4）、對于精度要求較高的定量PCR，最好先在樣品的所有組織類型內(nèi)做內(nèi)參基因的穩(wěn)定性分析，找出表達(dá)恒定基因作為內(nèi)參。（5）、做定量PCR時，先把除模板外的所有試劑預(yù)混，然后分裝到PCR管中，分裝時盡量采用排槍，加樣時盡量最好采用排槍。（6）、體系中最好摻入ROX參比熒光，消除光程差和加樣的偏差。第七十頁，共七十八頁，2022年，8月28日六、誤差分析及操作規(guī)范2、操作規(guī)范（7）、重復(fù)操作讓重復(fù)操作最大的修正偏差？最有意義的重復(fù)是在提取樣品RNA時就重復(fù)，同一個樣品，分別提取3份RNA，3份RNA都做反轉(zhuǎn)錄，所得的3份cDNA都做定量PCR檢測，這樣的重復(fù)之所以最有意義是因?yàn)槲覀兪前裄NA提取、反轉(zhuǎn)錄、上機(jī)檢測三步做了重復(fù)，這樣得出的平均值要比只在上機(jī)檢測時對同一cDNA樣品做三個重復(fù)要有意義的多。

同一個cDNA樣品做三個重復(fù)定量檢測求平均值主要是消除