第十五章DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組

Chapter15DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組

1.掌握遺傳信息傳遞的中心法則。2.掌握DNA復(fù)制的一般規(guī)律：DNA的半保留復(fù)制、DNA的半不連續(xù)復(fù)制的概念。3.了解三種大腸桿菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的復(fù)制過程。4.了解使DNA損傷的因素；DNA損傷的修復(fù)機制：錯配修復(fù)、堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù)、直接修復(fù)、重組修復(fù)及傾向差錯的修復(fù)的過程及過程所需要的酶類；了解DNA損傷修復(fù)的意義。目的要求

1953年，Watson和Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動。1964-1970發(fā)現(xiàn)勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉(zhuǎn)錄及RNA的復(fù)制存在于RNA病毒

中心法則病毒（復(fù)制）復(fù)制轉(zhuǎn)錄DNARNA蛋白質(zhì)翻譯逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制：以親代DNA或RNA為模板，根據(jù)堿基配對的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。轉(zhuǎn)錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。翻譯：亦叫轉(zhuǎn)譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的氨基酸順序的過程。逆轉(zhuǎn)錄：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，生成DNA的過程。幾個基本概念Reversetranscription中心法則圖示§1DNA的代謝一、DNA代謝包括DNA復(fù)制、修復(fù)和重組二、大腸桿菌遺傳圖

遺傳圖：通過遺傳學(xué)方法測定的一物種各基因沿著染色體相對順序和位置的排列圖。

一、關(guān)于模板的概念

二、DNA的半保留復(fù)制

1.定義以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復(fù)制方式叫半保留復(fù)制。2.半保留復(fù)制的實驗證據(jù)1958年Meselson和Stahl用15N標記大腸桿菌DNA，首先證明了DNA的半保留復(fù)制?！?DNA復(fù)制的一般規(guī)律全保留與全新復(fù)制分散復(fù)制半保留復(fù)制DNA半保留復(fù)制圖示半保留復(fù)制的證明

Meselson和Stahl將15N標記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌DNA都帶上15N標記，然后將該大腸桿菌轉(zhuǎn)入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進行氯化銫密度梯度離心，實驗證明了DNA的半保留復(fù)制。親代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N,14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N,14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N,14N～14N1:7)親代DNA與子二代DNA的混合物親代DNA與子四代DNA的混合物復(fù)制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖DNA半保留復(fù)制的生物學(xué)意義DNA的半保留復(fù)制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物。三、DNA復(fù)制的起點與方向雙向復(fù)制單向復(fù)制復(fù)制中的DNA

復(fù)制原點復(fù)制叉DNA復(fù)制的主要方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制（一個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）真核細胞線狀染色體DNA的復(fù)制方式（多個復(fù)制起點，雙向復(fù)制）單向滾環(huán)式復(fù)制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）3不同位置D-環(huán)式復(fù)制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復(fù)制起點不同位置，且復(fù)制不同步）四、DNA復(fù)制的半不連續(xù)性前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段前導(dǎo)鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復(fù)制叉移動方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。半不連續(xù)復(fù)制的發(fā)現(xiàn)日本學(xué)者岡崎（1968）：用3HdT標記T4噬菌體感染大腸桿菌短時間內(nèi)分離的DNA均為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當(dāng)用DNA連接酶缺失的變異株時，檢測到大量DNA小片段的積累。證明DNA復(fù)制中有小片段合成。一、DNA是由DNA聚合酶催化合成的原料：四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈,

也可以是單鏈DNA。合成產(chǎn)物與模板互補。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH。合成方向：53§3DNA聚合酶

1956年，Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶，其后發(fā)現(xiàn)該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質(zhì)如下：二、DNA復(fù)制的精確性（高保真復(fù)制）

DNA復(fù)制必須具有高度精確性，在大腸桿菌的細胞DNA復(fù)制中其錯誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個核苷酸才出現(xiàn)一個錯誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復(fù)制1000～10000次才出現(xiàn)一個核苷酸的錯誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關(guān)：（1）堿基的配對規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。（2）DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能，使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。（3）DNA的損傷修復(fù)系統(tǒng)。三、大腸桿菌三種DNA聚合酶DNA聚合酶Ⅰ1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶，含一個鋅原子。為多功能酶，具有:（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（校對功能）；（3）還具有5’3’外切酶活性（雙鏈有效）；該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對DNA損傷的修復(fù)能力下降，容易導(dǎo)致變異和死亡。推測該酶主要是對DNA損傷的修復(fù)，以及在DNA復(fù)制時RNA引物切除及其缺口的填補。

DNA聚合酶催化的反應(yīng)ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"DNA聚合酶Ⅱ

多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復(fù)紫外光引起的DNA損傷中起作用。DNA聚合酶Ⅲ含十種亞基:(αβγθτδδ’χΨε)，其中(αεθ)稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復(fù)合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強，主要與該結(jié)構(gòu)有關(guān)。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時大腸桿菌因DNA復(fù)制抑制而致死。因此認為該酶DNA的真正復(fù)制酶。亞基相對分子量亞基數(shù)目基因亞基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校對功能組建核心酶使核心酶二聚化依賴DNA的ATP酶，形成γ復(fù)合物與β亞基結(jié)合，形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物形成γ復(fù)合物兩個β亞基形成滑動夾子，以提高酶的持續(xù)合成能力。DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基組成DNA

聚

合

酶

Ⅲ

的

異

二

聚

體前導(dǎo)鏈的合成滯后鏈的合成DNA聚合酶Ⅲ的β-鉗子俯視圖DNA雙螺旋DNAPolⅠDNAPolⅡDNAPolⅢ結(jié)構(gòu)基因＊不同種類的亞基數(shù)目相對分子質(zhì)量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復(fù)PolB≥788,000＋－2,4001,500修復(fù)PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復(fù)制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較蛋白質(zhì)功能相對分子量（×103）分子/細胞DNA旋轉(zhuǎn)酶（或拓撲異構(gòu)酶）DNA解鏈酶單鏈結(jié)合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松開超螺旋使雙鏈DNA解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)合成RNA引物除去引物并填滿缺口40065746010950300100300四、DNA復(fù)制許多酶和蛋白因子

拓撲異構(gòu)酶：催化DNA的拓撲連環(huán)數(shù)發(fā)生變化的酶,在DNA重組修復(fù)和其它轉(zhuǎn)變方面起重要作用。除連環(huán)數(shù)不同外其它性質(zhì)均相同的DNA分子稱為拓撲異構(gòu)體，催化拓撲異構(gòu)體之間互變的酶稱為拓撲異構(gòu)酶。拓撲異構(gòu)酶?

使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應(yīng)不需要能量。主要集中在活性轉(zhuǎn)錄區(qū)，同轉(zhuǎn)錄有關(guān)。拓撲異構(gòu)酶Π使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當(dāng)引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，同復(fù)制有關(guān)。二者共同控制DNA的拓撲結(jié)構(gòu)。兩類拓撲異構(gòu)酶作用特點

解螺旋酶（解鏈酶）通過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2ATP分子。單鏈結(jié)合蛋白穩(wěn)定DNA解開的單鏈，防止復(fù)性和保護單鏈部分不被核酸酶水解。

引物合成酶催化引物RNA的生成。引發(fā)前體它由多種蛋白質(zhì)dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結(jié)合組裝成引發(fā)體。引發(fā)體可以沿模板鏈5’3’方向移動，具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物合成。移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶活力。引發(fā)體的移動與復(fù)制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。參與DNA復(fù)制的酶

與蛋白因子總覽圖§4細胞DNA復(fù)制的階段性（以大腸桿菌為例）一、復(fù)制的起始階段1、起始復(fù)合物的形成：稱為引發(fā)2、RNA引物的合成二、復(fù)制的延長階段三、復(fù)制的終止階段復(fù)制原點oriC和原點的識別

DNA的復(fù)制有特定的起始位點，叫做復(fù)制原點，常用oriC（或o）表示。大腸桿菌的復(fù)制原點oriC由245bp構(gòu)成，含兩組保守的重復(fù)序列：三個13bp的序列（富含A、T的序列）和四個9bp的序列；許多生物的復(fù)制原點也都富含A、T區(qū)段。復(fù)制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈（DNA雙鏈的解開還需DNA拓撲異構(gòu)酶Π、SSB），在原點處形成一個眼狀結(jié)構(gòu)，叫復(fù)制眼。從復(fù)制原點到終點，組成一個復(fù)制單位，叫復(fù)制子（基因組獨立進行復(fù)制的單位）。復(fù)制原點oriC和原點的識別1.拓撲異構(gòu)酶解開超螺旋。2.DnaA蛋白識別并在ATP存在下結(jié)合于四個9bp重復(fù)序列。3.在類組蛋白（HU）、ATP參與下,DanA蛋白變性13bp的重復(fù)序列，形成開鏈復(fù)合物。4.DnaB借助于水解ATP產(chǎn)生的能量在DnaC的幫助下沿5’→3’方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復(fù)合物。5.單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合于單鏈。6.引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。一、復(fù)制的起始二、鏈的延長

真核生物的岡崎片段為：100-200bp

原核生物的岡崎片段為：1000-2000bpDNA鏈的延伸

在DNA聚合酶Ш催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈延伸的同時進行前導(dǎo)鏈和滯后鏈合成。兩條鏈方向相反。

前導(dǎo)鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復(fù)制岡崎模型岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接

前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成（DNA聚合酶的異二聚體催化）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體DNA連接酶不僅能連接雙鏈DNA的粘性切口，而且能連接無粘性末端的平頭雙鏈DNA。DNA連接酶在DNA復(fù)制、損傷修復(fù)、重組等過程中起重要作用。DNA連接酶作用機理三、復(fù)制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱

Ter:終止陷阱，引起復(fù)制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質(zhì)Tus可識別并結(jié)合，從而導(dǎo)致DNA復(fù)制的終止。大腸桿菌DNA

復(fù)制的終止連環(huán)、解連環(huán)四、真核生物DNA復(fù)制的特點1.真核生物染色體有多個復(fù)制起點，稱自主復(fù)制序列(ARS)或復(fù)制基因(replicator)；多復(fù)制眼，呈雙向復(fù)制，多復(fù)制子。2.岡崎片段長約200bp，相當(dāng)于核小體長度。3.真核生物DNA復(fù)制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/Min（僅為原核生物的1/20～1/50）。4.真核生物染色體在全部復(fù)制完之前起點不再重新開始復(fù)制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復(fù)制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復(fù)制。真核生物快速生長時，往往采用更多復(fù)制起點。5.真核生物有多種DNA聚合酶，DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復(fù)制酶，在增殖細胞核抗原（PCNA）存在下有持續(xù)合成能力。PCNA相當(dāng)于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當(dāng)于夾子裝配器。6.真核生物線性染色體兩端有端粒結(jié)構(gòu)，它是由許多成串的短重復(fù)序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結(jié)構(gòu)，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶。7.RPA：真核生物的單鏈結(jié)合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口。DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亞基數(shù)目外切酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力抑制劑功能細胞核4－＋中等蚜腸霉素引物合成細胞核1－－低雙脫氧TTP修復(fù)線粒體23’→5’外切酶－高雙脫氧TTP線粒體DNA合成細胞核23’→5’外切酶－有PCNA時高蚜腸霉素核DNA合成細胞核＞15’→3’外切酶－高蚜腸霉素修復(fù)(POLⅠ)真核細胞內(nèi)有五種DNA聚合酶細菌和真核生物復(fù)制體的組成組成細菌真核生物復(fù)制酶POLⅢ全酶POLα/POLδ進行性因子Β夾子增殖細胞核抗原定位因子γ復(fù)合物RF-C(夾子裝配器)引物合成酶DnaGPOLα除去引物RNaseH和POLⅠRNaseH和MF-1滯后鏈修復(fù)POLⅠ和DNA連接酶POLε和DNA連接酶解螺旋酶DnaB（旋轉(zhuǎn)酶）T抗原消除螺旋張力旋轉(zhuǎn)酶TOPⅡ單鏈結(jié)合SSBRP-A真核細胞DNA復(fù)制示意圖五、復(fù)制起始的時序控制六、逆轉(zhuǎn)錄（reversetranscription）定義:以RNA為模板，按照RNA中的核苷酸順序合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，由逆轉(zhuǎn)錄酶催化進行。1970年Temin等和Baltimore分別從勞氏肉瘤病毒和小鼠白血病病毒等致病RNA病毒中分離出逆轉(zhuǎn)錄酶，迄今已知的致癌RNA病毒都含有逆轉(zhuǎn)錄酶。用DNA復(fù)制的特異抑制物（放線菌素D）能抑制致癌RNA病毒的復(fù)制，而對一般RNA病毒的復(fù)制無影響，可見致癌RNA病毒的復(fù)制過程必然涉及到DNA。所以Temin于1964年提出前病毒的假說。

以前病毒形式整合到宿主細胞DNA中而使細胞惡性轉(zhuǎn)化。單鏈病毒RNA

RNA-DNA雜交分子雙鏈DNA（前病毒）

逆轉(zhuǎn)錄酶也和DNA聚合酶一樣，沿53’方向合成DNA，底物為四種dNTP,并要求短鏈RNA作引物。+RNA+DNA-RNA+DNA-DNA+致癌RNA病毒的逆轉(zhuǎn)錄過程

逆轉(zhuǎn)錄酶是多功能酶，兼有3種酶的活性

RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；

DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性；核糖核酸酶H的活性，專一水解RNA-DNA雜交分子中的RNA，可沿5’3’方向起核酸外切酶的作用;無校對功能，錯誤率高，易產(chǎn)生變異。逆轉(zhuǎn)錄病毒的生活史

cDNA：反義DNA幾乎所有真核生物mRNA分子的3‘末端都有一段polyA，當(dāng)加入寡聚dT作為引物時，mRNA就可作為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶催化下在體外合成與該mRNA互補的DNA，稱cDNA。逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)現(xiàn)的理論與實踐意義：不能把“中心法則”絕對化，遺傳信息也可以從RNA傳遞到DNA。促進了分子生物學(xué)、生物化學(xué)和病毒學(xué)的研究，為腫瘤防治提供了新的線索。目前，逆轉(zhuǎn)錄酶已經(jīng)成為研究工具。

1983年，發(fā)現(xiàn)人類免疫缺陷病毒（humanimmunedeficiencevirus），感染T淋巴細胞后即殺死細胞，造成宿主機體免疫系統(tǒng)損傷，引起艾滋?。╝cquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS），該病毒為逆轉(zhuǎn)錄病毒。

因發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄病毒的遺傳物質(zhì)而獲1975年諾貝爾獎的三位科學(xué)家

端粒（telomere）是真核染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，它一般含許多串聯(lián)重復(fù)的寡聚核苷酸序列，通常是TxGy的形式，x、y常為1-4。端粒結(jié)構(gòu)提出了一個特別的生物學(xué)問題。DNA復(fù)制需要引物，但在線形DNA分子中，DNA復(fù)制結(jié)束后，引物去除留下的鏈的短缺無法進行補缺，若沒有特殊的機制解決末端復(fù)制，DNA就會因為復(fù)制而不斷變短。這個問題是由一種特殊的酶—端粒酶（telomerase）解決的。端粒酶，端粒的合成酶，含有一段RNA和蛋白質(zhì)，其中的RNA成分為150個核苷酸，并含1.5個拷貝的與端粒互補的重復(fù)序列CyAx，這是端粒TxGy合成的模板。端粒酶是以該段RNA為模板的逆轉(zhuǎn)錄酶，端粒合成時以該段RNA為引物和模板，合成因引物切除而產(chǎn)生的DNA末端缺口，使染色體的端粒達到正常的長度。端粒酶是一種逆轉(zhuǎn)錄酶端粒的合成

DNA的損傷與DNA突變DNA在復(fù)制時產(chǎn)生錯配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學(xué)誘變等，都可能使DNA的結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生改變。從而引起生物突變，甚至導(dǎo)致死亡?！?DNA修復(fù)

DNA突變

DNA的核苷酸順序永久性的改變稱為DNA的突變。其主要形式有：1.點突變DNA分子中一個堿基對替代另一個堿基對稱為點的突變。2.插入作用DNA分子中插入一個或幾個堿基稱為插入作用。3.缺失作用DNA分子中缺失一個或多個堿基對稱為缺失作用。

沉默突變：突變影響非必需的DNA或突變對一個基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變。

回復(fù)突變：一些突變可以克服第一次突變造成的影響，這類突變稱為回復(fù)突變。

?缺失、插入和移框突變；5'.....GCAGUACAUGUC..3'

丙纈組纈

...GAGUACAUGUC..

谷酪蛋絲

GACGUGCAGGCCU