第六章酶與細(xì)胞固定

第六章酶與細(xì)胞固定化直接應(yīng)用酶的不足之處:(1)酶的穩(wěn)定性差;在溫度、pH和無機(jī)離子等外界因素的影響下,容易變性失活(2)酶的一次性使用；酶通常在水溶液中與底物反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，即使仍有較高酶活力，也難于回收利用，成本較高，不便連續(xù)化生產(chǎn)(3)產(chǎn)物分離困難；酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起,增加分離純化的困難發(fā)展歷史1953年,德國,Grubhofer、Schleith,聚氨基苯乙烯樹脂為載體，重氮法;1969年，日本，千煙一郎，固定化氨基?；?，從DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-氨基酸，首次工業(yè)規(guī)模應(yīng)用固定化酶，促使酶工程作為一個(gè)獨(dú)立的學(xué)科從發(fā)酵工程中脫穎而出;1971年，第一次國際酶工程會(huì)議確定固定化酶統(tǒng)一英文名稱為ImmobilizedEnzyme。1973年，日本首次在工業(yè)上成功應(yīng)用固定化大腸桿菌菌體中天門冬氨酸酶，由反丁烯二酸連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸。1976法國首次用固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精；1978年，日本用固定化枯草桿菌細(xì)胞生產(chǎn)淀粉酶，1979年固定化毛地黃細(xì)胞和長春花細(xì)胞成功；1982年日本首次研究用固定化原生質(zhì)體生產(chǎn)谷氨酸。(1)固定化酶(2)固定化菌體(死細(xì)胞)(3)固定化活細(xì)胞(增殖細(xì)胞)(4)固定化原生質(zhì)體(5)固定化動(dòng)植物細(xì)胞種類優(yōu)點(diǎn)(1)提高酶穩(wěn)定性；(2)可反復(fù)或連續(xù)使用,成本降低;(3)易于和反應(yīng)產(chǎn)物分開,簡化提純工藝;（4）酶反應(yīng)過程可嚴(yán)格控制；（5）較游離酶更適合多酶反應(yīng)；（6）增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量；缺點(diǎn)（1）固定化時(shí)酶活有損失；（2）增加了生產(chǎn)初始成本；（3）只能用于可溶底物且較小分子；（4）與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)；第一節(jié)酶固定化定義酶的固定化:將酶或菌體與不溶性載體結(jié)合的過程;固定化酶:固定在載體上并在一定空間內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。概念發(fā)展“水不溶酶”（waterinsolubleenzyme)“固相酶”（solidphaseenzyme)1971年第一屆國際酶工程會(huì)議正式采用“固定化酶（immobilizedenzyme)”固定化酶制備原則（1）維持酶的催化活性及專一性；（2）有利于生產(chǎn)自動(dòng)化、連續(xù)化；載體要有一定的機(jī)械強(qiáng)度，以免攪拌而破碎。（3）應(yīng)有最小的空間位阻；盡可能不妨礙酶與底物接近（4）酶與載體必須結(jié)合牢固；以便回收重復(fù)使用（5）應(yīng)有最大穩(wěn)定性，載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；（6）成本要低。1、吸附法(link)2、包埋法(link)3、結(jié)合法(link)4、交聯(lián)法(link)5、熱處理法(link)一、酶固定化方法go1、吸附法

用固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使其固定的方法;

固體吸附劑:活性炭、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等;(1)操作簡單，條件溫和，不會(huì)引起酶變性失活，載體廉價(jià)易得，可反復(fù)使用;(2)物理吸附結(jié)合能力弱，酶與載體結(jié)合不牢固易脫落.(3)既能吸附酶也能吸附其它物質(zhì)，因此吸附的選擇性差。back2、包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中的固定化方法多孔載體瓊脂、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯酰胺、火棉膠等(1)凝膠包埋法（網(wǎng)格包埋法）天然凝膠條件溫和，操作簡便，對酶活影響小，強(qiáng)度較差合成凝膠強(qiáng)度高，對溫度、pH值變化的耐受性強(qiáng)。但因需聚合反應(yīng)而使部分酶變性失活適用性：適用固定化微生物；不適用于底物或產(chǎn)物分子很大的酶類的固定化(2)半透膜包埋法半透膜聚酰胺膜、火棉膜等，孔徑幾埃至幾十埃，比酶分子直徑小適用性：底物和產(chǎn)物都是小分子物質(zhì)的酶微膠囊直徑一般只有幾微米至幾百微米?微型膠囊法微膠囊型固定化酶制備酶+親水性單體溶于水疏水性單體溶于有機(jī)溶液混合乳化劑乳化酶液分散成小水滴親水性、疏水性單體在兩相界面上聚合成半透膜，將酶包埋Tween-20破乳離心半透膜酶液滴（3）膠格包埋法首先被采用的膠格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶

－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉雙丙稀酰胺,丙稀酰胺引發(fā)劑－－inactiationback3、結(jié)合法選擇適宜的載體,通過共價(jià)鍵或離子鍵(非共價(jià)健)與酶結(jié)合在一起的固定化方法酶載體(1)離子鍵結(jié)合法載體:DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等不溶于水的離子交換劑操作:將酶液與載體混合攪拌幾個(gè)小時(shí);或?qū)⒚敢壕徛亓鬟^處理好的離子交換柱;條件溫和，操作簡便，活力損失少；結(jié)合力較弱，條件(pH值和離子強(qiáng)度)改變時(shí),酶易脫落(2)共價(jià)鍵結(jié)合法是載體結(jié)合法中報(bào)道最多的方法;載體分類:纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)等;也可分三類:天然有機(jī)載體(多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞）、無機(jī)物（玻璃、陶瓷）、合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龍）優(yōu)點(diǎn):結(jié)合很牢固，酶可連續(xù)使用較長時(shí)間缺點(diǎn):操作復(fù)雜，共價(jià)結(jié)合可能影響酶的空間構(gòu)象而影響酶的催化活性載體活化方法1、重氮法;2、迭氮法;3、溴化氰法;4、烷基化法.載體活化:借助某種方法，在載體上引進(jìn)某一活潑基團(tuán)，該基團(tuán)能與酶分子上某一基團(tuán)反應(yīng)。重氮法將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)生成重氮鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的重氮基團(tuán)迭氮法含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成迭氮化合物溴化氰法含有羥基的載體，如纖維素等，可用溴化氰活化生成亞氨基碳酸衍生物烷基化法含羥基的載體可用三氯-均三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體back4、交聯(lián)法借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)特點(diǎn)此法與共價(jià)結(jié)合法一樣也是利用共價(jià)鍵固定酶的，所不同的是不使用載體雙功能試劑戊二醛、己二胺、雙偶氮苯等第一篇報(bào)道是：戊二醛交聯(lián)羧肽酶得到一種分子間交聯(lián)的固定化酶酶雙功能劑戊二醛:(p.163）優(yōu)點(diǎn)結(jié)合牢固，可以長時(shí)間使用缺點(diǎn)因交聯(lián)反應(yīng)激烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活損失大，顆粒較小，使用不便雙重固定化將其與吸附法、包埋法聯(lián)合使用圖7－11酶分子之間共價(jià)交聯(lián)和與水不溶性載體共價(jià)偶聯(lián)酶分子；（a）酶分子之間用雙功能基團(tuán)的化學(xué)交聯(lián)試劑相互交聯(lián)成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶聯(lián)到水不溶性載體上形成水不溶性的固定化酶5、熱處理在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體體內(nèi)適用性：熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化嚴(yán)格控制加熱及其時(shí)間back酶固定化方法示意圖固定化酶方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較評估指標(biāo)判斷固定化方法的優(yōu)劣及其固定化酶的實(shí)用性,常見的評估指標(biāo)有以下幾條:

(1)相對酶活力具有相同酶蛋白量的固定化酶與游離酶活力的比值稱為相對酶活力.＝固定化酶活力/（總酶活力－未結(jié)合的酶活力）它與載體的結(jié)構(gòu)、顆粒大小、底物分子量大小及酶的結(jié)合效率有關(guān)．相對酶活力低于75%的固定化酶,一般沒有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值．

（2）酶結(jié)合效率（偶聯(lián)率）＝（總酶活力－未結(jié)合的酶活力)/總酶活力＝（總酶蛋白－未結(jié)合的酶蛋白）/總酶蛋白偶聯(lián)率＝1時(shí)，表示反應(yīng)控制好，固定化或擴(kuò)散限制引起的酶失活不明顯；偶聯(lián)率＜1時(shí)，擴(kuò)散限制對酶活力有影響；偶聯(lián)率＞1時(shí)，有細(xì)胞分裂或從載體排除抑制劑等原因。(3)酶活力回收率：固定化酶的總活力與用于固定化的酶的活力的百分比稱為酶的活力回收率。

＝固定化酶總活力/用于固定化的總酶活力測定酶的活力回收率可以確定固定化的效果．一般情況下,活力回收率應(yīng)小于1,若大于1,可能由于固定化活細(xì)胞增殖或某些抑制因素排除的結(jié)果．(4)固定化酶的半衰期即固定化酶的活力下降到為初始活力一半所經(jīng)歷的時(shí)間。它是衡量固定化酶操作穩(wěn)定性的關(guān)鍵．其測定方法可以通過長期實(shí)際操作,也可以通過較短時(shí)間的操作來推算．1、穩(wěn)定性(link)2、最適溫度(link)3、最適pH(link)4、底物特異性(link)

go二、固定化酶的性質(zhì)1、穩(wěn)定性比游離酶的好（1）對熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度A固定化酶B游離酶穩(wěn)定性(續(xù))（2）保存穩(wěn)定性好，保存時(shí)間延長（3）對蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解（4）對變性劑(如尿素、有機(jī)溶劑、鹽酸胍等)的耐受性提高，保留較高酶活（5）對酶抑制劑、對不同pH穩(wěn)定性提高.(back)2、最適溫度與游離酶差不多A固定化酶B游離酶最適溫度(續(xù))例外用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，比游離酶高5-10℃;以共價(jià)結(jié)合法固定的色氨酸酶，比游離酶高5-15℃湯亞杰以交聯(lián)法用殼聚糖固定胰蛋白酶最適溫度為80℃，比固定化前提高了30℃。同一種酶，用不同的方法或載體進(jìn)行固定化，其最適溫度可能不同不同方法和載體固定化氨基?；傅淖钸m溫度(back)3、最適pH值酶固定化后，對底物作用的最適pH和酶—pH曲線常發(fā)生偏移（見圖），原因是微環(huán)境表面電荷性質(zhì)的影響pH對固定化前后天冬酰胺酶活力的影響帶負(fù)電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的高(1)載體的帶電性質(zhì)對最適pH的影響原因:吸引作用帶正電荷的載體，固定化酶最適pH值比游離酶的低H+H+H+H+H+H+H+偏酸微環(huán)境OH-OH-OH-OH-OH-OH-H+H+大環(huán)境偏堿酶不帶電荷的載體，固定化酶最適pH值一般不變(2)產(chǎn)物酸堿性對最適pH值的影響酸性:固定化酶的最適pH值比游離酶的高堿性:固定化酶的最適pH值比游離酶的低中性:固定化酶的最適pH值一般不變原因:載體障礙產(chǎn)物的擴(kuò)散(back)4、底物的特異性與底物分子量的大小有關(guān);作用于低分子量底物的酶，沒有明顯變化，如氨基?；?、葡聚糖氧化酶等;既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，往往會(huì)發(fā)生變化。如，固定在羧甲基纖維素上的胰蛋白酶，對二肽或多肽的作用保持不變，而對酪蛋白的作用僅為游離酶的3%左右原因:載體的空間位阻作用(back)三、固定化酶的應(yīng)用1、工業(yè)生產(chǎn)(link)2、酶傳感器(link)3、藥物控釋載體（link)go1、固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(1)氨基?；窤minoacylase首例，1969年，日本田邊制藥公司，DEAE-葡聚糖凝膠固定化酶,拆分DL-乙酰氨基酸，連續(xù)生產(chǎn)L-aa，成本降低40%左右。DL-乙?！狝laL—Ala+乙酸泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)消旋反應(yīng)器固定化酶柱子晶體L-AlaL-AlaA-D-AlaA-L-AlaA-D-Ala固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(續(xù))(2)葡萄糖異構(gòu)酶規(guī)模最大。1973年。熱處理法，國內(nèi)外廣泛研究和應(yīng)用。(3)天門冬氨酸酶1973年，日本，聚丙烯酰胺凝膠為載體固定化具高活力天冬氨酸酶的大腸桿菌體，包埋法，將延胡索酸轉(zhuǎn)化成L-天冬氨酸。1978年，角叉菜膠固定化純酶，離子鍵結(jié)合法。(4)青霉素?；?973年，催化青霉素或頭孢菌素水解生成6-氨基青霉烷酸(6-APA）或7-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA),也可催化6-APA或7-ACA+羧酸衍生物合成不同側(cè)鏈基團(tuán)的青霉素或頭孢霉素;6-氨基青霉烷酸青霉素頭孢霉素固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用(續(xù))(5)延胡索酸酶1974年，由延胡索酸制L-蘋果酸，聚丙烯酰胺包埋法，產(chǎn)氨短桿菌體。1977年，由延胡索酸制L-蘋果酸，角叉菜膠包埋法，黃色短桿菌(6)?-半乳糖苷酶1977年，水解乳中的乳糖生產(chǎn)低乳糖奶(7)天門冬氨酸-?-脫羧酶1982年，天門冬氨酸生產(chǎn)L-丙氨酸。假單孢菌，凝膠包埋Back２、固定化酶在酶傳感器方面的應(yīng)用酶傳感器是由固定化酶與能量轉(zhuǎn)換器(電極、場效應(yīng)管、離子選擇場效應(yīng)管)密切結(jié)合而成的傳感裝置，屬于生物傳感器的一種酶電極:固定化酶+電極，應(yīng)用最廣泛;用途:臨床診斷、工業(yè)發(fā)酵過程控制、環(huán)境監(jiān)測go生物傳感器用生物活性材料（酶、蛋白質(zhì)、DNA、抗體、抗原、生物膜等）與物理、化學(xué)傳感器有機(jī)結(jié)合的一門交叉學(xué)科，是發(fā)展生物技術(shù)必不可少的一種先進(jìn)的檢測方法與監(jiān)控手段，也是物質(zhì)分子水平的快速、微量分析方法;在21世紀(jì)生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展中，生物傳感技術(shù)將是介于信息和生物技術(shù)之間的新增長點(diǎn);中國生物傳感器的研究起步于70年代末期。早期研究普遍采取氧電極作生物反應(yīng)中的換能器,以葡萄糖氧化酶為活性材料一、概述生物傳感器(續(xù))早期的血糖速測儀我國第一種實(shí)用化的生物傳感器---SBA-30型乳酸分析儀維生素C速測儀

生物傳感器(續(xù))傳感器能將一種被測信號(hào)（參量）轉(zhuǎn)換成一種可輸出信號(hào)的裝置。生物傳感器(biosensors):用生物成分作為感受器的傳感器。由感受器、換能器、電子線器組成二、生物傳感器組成和工作原理感知固定化配基與待測物結(jié)合產(chǎn)生的微小變化，把這種變化轉(zhuǎn)化為其它可識(shí)別信號(hào)，其質(zhì)量好壞決定了傳感器的靈敏度。換能器是生物傳感器的心臟，整個(gè)生物傳感器的核心技術(shù)也在此。制備分兩方面工作，一是選擇最佳載體材料（需活化）；二是在載體表面固定化親和配基（非共價(jià)和共價(jià)）感受器葡萄糖氧化酶電極1962年Clark和Lyons提出模型1967年Updike和Hicks首先制造聚丙烯酰胺凝膠包埋法固定化葡萄糖氧化酶，酶膜強(qiáng)度20~50um基本結(jié)構(gòu)酶膜+多分子膜(聚四氟己烯等)+氧電極圖5-1葡萄糖氧化酶電極

感應(yīng)電極

酶電極示意圖?－D－葡萄糖＋O2 D－葡萄糖酸－1，5－內(nèi)酯＋H2O２半透膜酶膠層GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode根據(jù)反應(yīng)中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧電極、pH電極和H2O2電極來測定葡萄糖的含量。脲電極Urea+2H2O 2NH4++2HCO3-脲酶產(chǎn)生的2NH4+為陽離子電極感應(yīng)。此外還有： 氨基酸電極 醇電極 尿酸電極 乳酸電極 青霉素電極 亞硝酸離子電極：菠菜亞硝酸還原酶產(chǎn)生NH3青霉素酶電極酶膜:青霉素酶+聚丙烯酰胺凝膠(或光交聯(lián)樹脂)電極:pH電極結(jié)合:酶膜緊貼在玻璃(pH)電極上反應(yīng):青霉素+H2O青霉烷酸+H+青霉素酶表5-1一些常用的酶電極back固定化酶在酶傳感器方面的應(yīng)用(續(xù))圖4、SBA-40型谷氨酸葡萄糖雙功能分析儀

圖5、SBA-50型糖化酶生物傳感分析儀SBA-70型生物傳感在線血糖乳酸自動(dòng)分析系統(tǒng)固定化酶在酶傳感器方面的應(yīng)用(續(xù))Back藥物控釋載體藥物應(yīng)用臨床不順利的原因:蛋白類藥物被胃酸破壞被肝和血液中的酶系統(tǒng)清除藥物本身毒副作用免疫問題藥物穩(wěn)定性差建立合理的給藥體系，核心是從時(shí)間和空間分布上控制藥物的釋放控釋體系涉及到將藥物與聚合物載體偶聯(lián)或固定于某種聚合物載體上，也稱載體藥物(1)聚合物修飾(2)凝膠包埋(3)微球制劑(4)脂質(zhì)體(5)導(dǎo)向藥物Back第二節(jié)細(xì)胞固定化細(xì)胞特性比較概念：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞.該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)類型：微生物細(xì)胞、植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞生理狀態(tài)：活細(xì)胞（增殖細(xì)胞、靜止細(xì)胞、完整細(xì)胞）形狀：顆粒狀、塊狀、條狀、薄膜狀或不規(guī)則形狀。最多使用：顆粒狀珠體使用周期：理論上講，固定化增殖細(xì)胞保持了細(xì)胞原有的全部活性，只要載體不解體，不污染就可以長期使用。一、細(xì)胞固定化方法吸附法包埋法吸附法它主要通過載體與細(xì)胞間的靜電引力，即細(xì)胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細(xì)胞固定在載體上的。影響吸附法的主要因素

（1）Z-電位：Z-電位能近似地代表表面電荷密度的大?。?）細(xì)胞的性質(zhì)和細(xì)胞壁的組成：細(xì)胞壁的電荷性質(zhì)（3）載體的性質(zhì)：特別是玻璃、陶瓷等無機(jī)材料包埋固定法

包理法是在細(xì)胞自身并不與凝膠基體發(fā)生化學(xué)鍵合的情況下將其包埋在半透性聚合物顆粒（或膜）內(nèi)的一種固定化方法。包埋法的最大優(yōu)點(diǎn)是能較好的保持細(xì)胞內(nèi)多酶系統(tǒng)的活力，可象游離細(xì)胞那樣進(jìn)行產(chǎn)物的發(fā)酵生產(chǎn)。

包埋法分類常用載體：瓊脂、