第四章食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

第四章食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

食品安全（衛(wèi)生）標(biāo)準(zhǔn)食品安全法第18條——制定食品安全標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)當(dāng)以保障公眾身體健康為宗旨，做到科學(xué)合理、安全可靠食品安全標(biāo)準(zhǔn)是唯一強(qiáng)制性的標(biāo)準(zhǔn)食品安全標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)務(wù)院衛(wèi)生行政部門(mén)負(fù)責(zé)制定公布食品安全標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容（一）食品中的致病性微生物、農(nóng)（獸）藥殘留、重金屬、污染物質(zhì)以及其他危害人體健康物質(zhì)的限量規(guī)定；（二）食品添加劑的品種、使用范圍、用量；（三）專(zhuān)供嬰幼兒的主輔食品的營(yíng)養(yǎng)成分要求；（四）對(duì)與食品安全、營(yíng)養(yǎng)有關(guān)的標(biāo)簽、標(biāo)識(shí)、說(shuō)明書(shū)的要求；（五）食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)過(guò)程的衛(wèi)生要求；（六）與食品安全有關(guān)的質(zhì)量要求；（七）食品檢驗(yàn)方法與規(guī)程；（八）其他需要制定為食品安全標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容；食品安全標(biāo)準(zhǔn)的主要技術(shù)指標(biāo)1.感官指標(biāo)2.理化指標(biāo)3.微生物指標(biāo)(1)菌落總數(shù)(2)大腸菌群(3)霉菌和酵母(4)致病菌(5)益生菌（乳酸菌、雙歧桿菌）(6)抗生素殘留、商業(yè)無(wú)菌如膨化食品中微生物學(xué)指標(biāo)項(xiàng)目指標(biāo)菌落總數(shù)/（CFU/g）

≤

100大腸菌群/（MPN/100g）≤90致病菌沙門(mén)氏菌志賀氏菌金黃色葡萄球菌

不得檢出食品安全檢驗(yàn)方法與規(guī)程在食品安全標(biāo)準(zhǔn)中所規(guī)定的每個(gè)項(xiàng)目，為保證檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量有可比性、準(zhǔn)確性、統(tǒng)一性和權(quán)威性，使之具有科學(xué)的評(píng)價(jià)意義，都必須規(guī)定統(tǒng)一的檢驗(yàn)方法和條件。理化檢驗(yàn)（GB/T5009）微生物檢驗(yàn)（GB/T4789）放射性物質(zhì)檢驗(yàn)（GB/Tl4883）食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序（GB/Tl5193）為什么要進(jìn)行食品微生物學(xué)檢驗(yàn)食品安全問(wèn)題是關(guān)系到人民健康、國(guó)家經(jīng)濟(jì)（特別是工業(yè)、貿(mào)易和農(nóng)業(yè)）的可持續(xù)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定的重要問(wèn)題，是世界關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題食品微生物污染問(wèn)題突出，細(xì)菌性、真菌性食物中毒占各種食物中毒之首，每年的發(fā)生數(shù)量、受害人數(shù)、死亡人數(shù)和造成的經(jīng)濟(jì)損失都是非常巨大的，我國(guó)如此，先進(jìn)的發(fā)達(dá)國(guó)家同樣深受其害為什么要進(jìn)行食品微生物學(xué)檢驗(yàn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的廣泛應(yīng)用和不斷改進(jìn)，是制定各級(jí)預(yù)防、監(jiān)控和預(yù)警系統(tǒng)的重要組成部分，是食品微生物污染的溯源、控制和降低由此引起的一系列重大損失的重要有效手段，對(duì)促進(jìn)人民身體健康、經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展和社會(huì)穩(wěn)定都很重要，具有較大的經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和衛(wèi)生意義。食品微生物檢驗(yàn)的范圍食品不論在產(chǎn)地或加工前后，均可能遭受微生物的污染。污染的機(jī)會(huì)和原因很多，一般有：食品生產(chǎn)環(huán)境的污染，食品原料的污染，食品加工過(guò)程的污染等。根據(jù)食品被細(xì)菌污染的原因和途徑可知，食品微生物檢驗(yàn)的范圍1、生產(chǎn)環(huán)境的檢驗(yàn)：車(chē)間用水、空氣、地面、墻壁等。2、原輔料檢驗(yàn)：包括食用動(dòng)物、谷物、添加劑等一切原輔材料。3、食品加工、儲(chǔ)藏、銷(xiāo)售諸環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)：包括食品從業(yè)人員的衛(wèi)生狀況檢驗(yàn)、加工工具、運(yùn)輸車(chē)輛、包裝材料的檢驗(yàn)等。4、食品的檢驗(yàn)：重要的是對(duì)出廠食品、可疑食品及食物中毒食品的檢驗(yàn)。微生物學(xué)檢驗(yàn)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的演變建國(guó)六十多年來(lái)，我國(guó)食品安全（衛(wèi)生）微生物學(xué)檢驗(yàn)方法的發(fā)展經(jīng)歷了三個(gè)階段?！椒ㄖ鸩浇?、統(tǒng)一階段（1949～1976年）——方法標(biāo)準(zhǔn)化形成階段（1977～1984年）——不斷修訂和完善階段（1985年至今）第一節(jié)GB/T4789.1－2010總則1范圍——規(guī)定了食品微生物檢驗(yàn)基本原則和要求適用于食品微生物學(xué)檢驗(yàn)2規(guī)范性引用文件3實(shí)驗(yàn)室基本要求（環(huán)境、人員、設(shè)備、檢驗(yàn)用品、培養(yǎng)基和試劑、菌株）4樣品的采集（原則、方案、方法、標(biāo)記、儲(chǔ)存和運(yùn)輸）5樣品檢驗(yàn)（處理、檢驗(yàn)方法的選擇）6生物安全與質(zhì)量控制7記錄與報(bào)告8檢驗(yàn)后處理（檢畢樣品處理、不進(jìn)行復(fù)檢）食品微生物學(xué)檢驗(yàn)的一般程序檢驗(yàn)前準(zhǔn)備樣品的采集與處理樣品的送檢與檢驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告食品微生物學(xué)檢驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容細(xì)菌——菌落總數(shù)、大腸菌群、腸道致病菌（沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌）霉菌——霉菌與酵母菌總數(shù)及產(chǎn)毒霉菌的鑒別等等第二節(jié)食品中菌落總數(shù)的測(cè)定

GB4789.2—2010一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握菌落（細(xì)菌）總數(shù)測(cè)定程序和要點(diǎn)。2.學(xué)會(huì)對(duì)不同樣品稀釋度確定原則。二、概述菌落總數(shù)：食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下培養(yǎng)后所得1克或1毫升檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)

衛(wèi)生學(xué)意義：判定食品被細(xì)菌污染程度；觀察細(xì)菌在食品中繁殖動(dòng)態(tài)。以便對(duì)被檢樣品進(jìn)行衛(wèi)生學(xué)評(píng)價(jià)時(shí)提供依據(jù)三、實(shí)驗(yàn)步驟檢樣

10倍稀釋

2-3個(gè)連續(xù)適宜稀釋度，各以1ml之量加入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)

每皿內(nèi)加入適量平板計(jì)數(shù)瓊脂，混勻

36±1℃培養(yǎng)48h

菌落計(jì)數(shù)、報(bào)告圖四、思考題為什么平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基在使用前要保持溫度在45℃左右？如何保持？在進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定時(shí)，為什么培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？培養(yǎng)溫度為什么選擇36℃？根據(jù)菌落總數(shù)的原始記錄報(bào)告測(cè)定結(jié)果。說(shuō)明在進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定時(shí)應(yīng)特別注意的問(wèn)題食品中大腸菌群的測(cè)定

GB4789.3—2010一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)食品中大腸菌群的測(cè)定方法。2.了解大腸菌群檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義二、概述概念：在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。

意義：食品被糞便污染的指標(biāo)菌；食品被致病菌污染的可能

三、（第一法MPN計(jì)數(shù)法）（1）檢樣稀釋?zhuān)?）初發(fā)酵（LST）試驗(yàn)--36±1℃培養(yǎng)48h（3）復(fù)發(fā)酵（BGLB）驗(yàn)證--36±1℃培養(yǎng)48h（4）報(bào)告LST肉湯管或BGLB管是否產(chǎn)氣？LST肉湯管或BGLB管是否產(chǎn)氣？大腸菌群測(cè)定第二法——平板計(jì)數(shù)法四、思考題初發(fā)酵（LST）試驗(yàn)后，產(chǎn)氣的管怎么做初發(fā)酵（LST）試驗(yàn)后，沒(méi)有產(chǎn)氣的管能否報(bào)告為未檢出大腸菌群某學(xué)生在對(duì)糕點(diǎn)中大腸菌群檢驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原始記錄（采用稀釋度為1g，0.1g，0.01g）：發(fā)酵管編號(hào)：12345～9初發(fā)酵試驗(yàn)：＋＋＋＋－復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)：＋＋－－根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，查表，說(shuō)明大腸菌群的最可能數(shù)。食品中沙門(mén)氏菌的檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌——最重要的病原菌屬，根據(jù)生化特性分為6個(gè)亞屬。檢查食品中沙門(mén)氏菌的衛(wèi)生學(xué)意義沙門(mén)氏菌可引起人類(lèi)傷寒、副傷寒和食物中毒---在世界各地的食物中毒中常占首位或第二位沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)程序GB4789.4-2010為什么要前增菌？前增菌時(shí)間不能長(zhǎng)？為什么要用2種增菌液？平板分離——為什么用2種選擇性鑒別培養(yǎng)基沙門(mén)氏菌在BS上的可疑菌落特征在HE培養(yǎng)基上的典型菌落沙門(mén)氏菌TSI的特征如何提高沙門(mén)氏菌的檢出率？對(duì)樣品進(jìn)行前增菌，使受損的沙門(mén)氏菌恢復(fù)活力選擇性增菌使用兩種選擇性分離增菌液，一種是抑制除沙門(mén)氏菌以外其它腸道菌的生長(zhǎng)，一種是在不影響其他腸道菌生長(zhǎng)的情況下促進(jìn)沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)。為了最大可能的檢出沙門(mén)氏菌，原則上必須使用兩種以上選擇性分離培養(yǎng)基接TSI時(shí)，應(yīng)盡可能多挑幾個(gè)可疑菌落C-BSI-BSC-HEI-HE生化試驗(yàn)在接種TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的同時(shí)增加一項(xiàng)營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），經(jīng)TSI瓊脂和賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)培養(yǎng)基的選擇后，可篩掉大部分非沙門(mén)氏菌株，大大減少了工作量同時(shí)直接接種蛋白胨水(供做靛基質(zhì)試驗(yàn))、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN培養(yǎng)基的內(nèi)容。本部分還增加了對(duì)疑似菌落進(jìn)行留樣確認(rèn)的部分，以備必要時(shí)復(fù)查血清學(xué)鑒定（選擇做）——將含有已知抗體的診斷血清與待檢菌懸液各一滴要玻片上混合，數(shù)分鐘后，如出現(xiàn)顆粒狀或絮狀凝集，即為陽(yáng)性反應(yīng)。此法簡(jiǎn)便快速，適用于新分得的細(xì)菌的鑒定或分型。報(bào)告綜合以上生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定的結(jié)果,報(bào)告25g樣品中檢出或未檢出沙門(mén)氏菌食品中志賀氏菌的檢驗(yàn)GB4789.5-2003志賀氏菌檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義志賀氏菌檢驗(yàn)的基本步驟：增菌、平板分離、生化試驗(yàn)、血清學(xué)分型增菌——在對(duì)食品中志賀氏菌檢驗(yàn)時(shí)，為什么要用志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素增菌并在厭氧環(huán)境41.5℃進(jìn)行培養(yǎng)？平板分離在對(duì)增菌液中可能存在的志賀氏菌進(jìn)行分離時(shí)，為什么要用選擇性強(qiáng)和選擇性弱的瓊脂平板各一個(gè)？志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)什么樣的菌落特征？為什么？志賀氏菌的菌落典型特征圖志賀氏菌的菌落典型特征圖福氏志賀氏菌形態(tài)圖鮑氏志賀氏菌形態(tài)圖志賀氏菌的TSI試驗(yàn)可疑志賀氏菌非志賀氏菌如何利用實(shí)驗(yàn)判定細(xì)菌是否具有動(dòng)力動(dòng)力陰性（無(wú)鞭毛）的細(xì)菌沿著接種線生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)線清晰動(dòng)力陽(yáng)性（有鞭毛）的細(xì)菌可擴(kuò)散生長(zhǎng)，因此生長(zhǎng)線模糊，呈羽毛狀半固體培養(yǎng)基、穿刺、培養(yǎng)、觀察血清學(xué)試驗(yàn)顆粒性抗原（細(xì)菌等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象，稱為凝集反應(yīng)。其中的抗原稱為凝集原，抗體稱為凝集素。食品中金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)GB/T4789.10致病性金黃色葡萄球菌定性檢驗(yàn)的原理（3個(gè)）為什么要用7.5%氯化鈉肉湯溶液增菌制備Baird-Parker平板或血平板的過(guò)程中注意的問(wèn)題金黃色葡萄球菌

在BP平板上的菌落特征金黃色葡萄球菌

在血平板上的菌落特征在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？為什么？鑒定致病性金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)有哪些？為什么？金黃色葡萄球菌血漿凝固酶試驗(yàn)預(yù)防金黃色葡萄球菌食物中毒的發(fā)生食品中霉菌和酵母菌檢驗(yàn)食品中霉菌學(xué)檢驗(yàn)的衛(wèi)生學(xué)意義對(duì)食品中霉菌學(xué)檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題在培養(yǎng)后的平板上出現(xiàn)的粘稠狀的菌落，如何確定它是酵母菌而不是細(xì)菌

根據(jù)原始記錄報(bào)告檢測(cè)結(jié)果霉菌菌落GB/T4789.35－2008

食品中乳酸菌檢驗(yàn)乳酸菌——一群通過(guò)發(fā)酵糖類(lèi)產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌通稱。乳桿菌屬雙歧桿菌屬鏈球菌屬的嗜熱鏈球菌檢驗(yàn)程序樣品25g（mL）+225mL滅菌生理鹽水，10倍系列稀釋。選擇2～3個(gè)適當(dāng)稀釋度各以0.1mL加入到MRS和/或MC瓊脂平板進(jìn)行表面涂布。根據(jù)樣品中所含菌種選擇培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件，見(jiàn)表1。表1乳酸菌計(jì)數(shù)條件選擇

樣品種所含菌屬M(fèi)RS平板36℃±1℃，48hMC瓊脂平板36℃±1℃，48h厭氧兼性厭氧兼性厭氧只含乳桿菌屬－＋－只含雙歧桿菌屬＋－－同時(shí)含乳桿菌屬和雙歧桿菌屬＋＋－只含嗜熱鏈球菌－－＋同時(shí)含乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌＋＋＋注:+表示使用此培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件；－表示不使用此培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件。報(bào)告根據(jù)菌落計(jì)數(shù)結(jié)果出具檢測(cè)報(bào)告。最終確定的乳酸菌菌落在30～300之間的平板計(jì)數(shù)，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，修約保留兩位有效數(shù)字，之后的數(shù)字，采用10的指數(shù)表示。參照GB/T4789.2規(guī)定。每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌數(shù)以CFU/g（mL）表示。StreptococcusStreptococcusandLactobacillus乳酸菌的鑒定純培養(yǎng)挑取3個(gè)或以上的可疑菌落，嗜熱鏈球菌接種于MC瓊脂平板，乳桿菌屬接種于MRS瓊脂平板，兼性厭氧，置36℃±1℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48