分離科學與進展中科大lecture2課件

色層分離法色層分離又稱層析法或色譜法，它的最大特點是分離效率高，它能把各種性質極相似的物質彼此分離，而后分別加以檢出和測定。色層法的發(fā)現(xiàn)俄國植物學家茨維特（Tswett）1906年提出色譜（Chromatography）的概念，Tswett讓植物色素的石油醚萃取液流經(jīng)裝有碳酸鈣的管柱，并繼續(xù)以純凈的石油醚加以洗脫，得到三種顏色的5個色帶。英國生物學家Martin和Synge于1940年提出液液分配色譜，1941年提出用氣體代替液體作為流動相，他們首先提出了色譜塔板理論，以及其遠見卓識的預言。1952年James和Martin因其在色譜理論和實踐方面的貢獻獲得了諾貝爾獎。1944年出現(xiàn)紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析（HPLC）等。茨維特使用的實驗裝置色層分析法的種類名稱分離原理吸附層析法固定相是固體吸附劑，各組份在吸附劑表面的吸附能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠中受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結合，以此和無親和力的其經(jīng)組份分離柱層析吸附柱層析：根據(jù)等分離物質在固體吸附劑表面吸附能力的強弱來加以分離分析的技術分配柱層析：根據(jù)欲分離組分在兩種互不混溶（或部分混溶）的溶劑間溶解度的差異來進行分離的技術吸附柱層析固液兩相中處于液相中的物質在固液兩相的界面發(fā)生密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對不同物質具有不同吸附力使混合物得到分離的現(xiàn)象就叫吸附層析。在某一溫度下某種組分在吸附劑表面的吸附規(guī)律可用平衡狀態(tài)時此組分在兩相中濃度的相對關系曲線來表示，這種關系曲線稱為吸附等溫線。吸附柱層析保留時間和保留體積：組分在柱上的保留特性可用保留時間和保留體積來表示。保留時間是從進樣開始到流出液中出現(xiàn)濃度最高點的時間；保留體積是從進樣開始到流出液中出現(xiàn)濃度最高點時流過色譜柱的流動相的體積。吸附等溫線與對應的洗脫曲線常用的吸附劑及其選擇氧化鋁：由Al(OH)3在300~400°C時脫水制得。氧化鋁因生產時條件的不同可分為中性、酸性和堿性三種，吸附能力有所不同。中性氧化鋁應用較廣泛，適用于醛、酮、醌、酯、內酯化合物及某些苷的分離；酸性氧化鋁適用于酸性化合物，如酸性色素、某些氨基酸，以及對酸穩(wěn)定的中性物質的分離；堿性氧化鋁適用于分離堿性化合物如生物堿、醇以及其它中性和堿性物質。一般講，能用酸性或堿性氧化鋁分離的物質也可用中性氧化鋁分離。氧化鋁具有吸附能力強、分離能力強的優(yōu)點。常用的吸附劑及其選擇硅膠：層析用硅膠是由彈性多聚硅酸脫水制得，每批生產的硅膠，性能比較穩(wěn)定。硅膠的表面化學組成有下面幾種：硅膠吸附活性：活潑型>游離型>束縛型常用的吸附劑及其選擇硅膠：水與硅膠表面的羥基可結合成水合硅酸：Si-OH?OH2,使其失去吸附性能。加熱至100degC左右能可逆地除去這些水分，使硅膠活化。最佳的硅膠活化條件為在105~110degC加熱30min。如果加熱到200degC以上，硅膠將失去結構水，形成硅氧烷，使吸附能力下降，如果加熱至400degC以上，硅膠將發(fā)生燒結硅膠具有微酸性，吸附能力較氧化鋁稍弱，可用于分離酸性和中性物質，如有機酸、氨基酸、匝萜類、甾體等。常用的吸附劑及其選擇聚酰胺：由已內酰胺聚合而成，因而又稱聚已內酰胺或錦綸。層析用的聚酰胺為白色多孔性的非晶形粉末，易溶于濃鹽酸、熱甲酸、苯酚等溶劑；不溶于水及甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、氯仿、苯等有機溶劑，對堿比較穩(wěn)定，對酸的穩(wěn)定性較差、尤其是熱的酸溶液。常用的吸附劑及其選擇聚酰胺：常用的吸附劑及其選擇聚酰胺：一般說來，能形成氫鍵基團較多的溶質，其吸附能力較大；對位、間位取代基團都能形成氫鍵時，吸附能增大，鄰位的使吸附能力減??；芳香核具有較多共軛雙鍵時，吸附能力增大；能形成分子內氫鍵者，吸附能力減小。流動相及其選擇流動相的洗脫作用實質上是流動相分子與被分離的溶質分子競爭占據(jù)吸附劑表面活性中心的過程。強極性的流動相分子占據(jù)吸附中心的能力強，因而具有強的洗脫作用。非極性流動相競爭占據(jù)活性中心的能力弱，洗脫作用就弱得多。常見功能團的極性強弱排序氟碳化合物<烷烴<烯烴<芳烴<有機鹵化物<醚類<硝基化合物<腈<二甲胺<酯類<酮類<醛類<硫醇<胺類<酰胺<醇類<酚類<羧酸類<磺酸當有機分子的基本母核相同時，取代基團的極性增強，整個分子的極性增強；極性基團增多，整個分子的極性增強；分子中的雙鍵多，吸附力強；共軛雙鍵多，吸附力增強；分子中取代基團的空間排列對吸附性能也有影響，如同一母核中羥基處于能形成內氫鍵位置時，其吸附力將弱于不能形成內氫鍵的化合物常見溶劑的極性強弱排序流動相極性較弱時，可使試樣中弱極性的組分洗脫下來，在層析柱中移動較快，而與極性強的組分分離。同樣強極性和中等極性的流動相適用于強極性和中等極性組分的分離常用的流動相按其極性增強順序排列如下：石汕醚<環(huán)已烷<二硫化碳<四氯化碳<三氯乙烯<苯<甲苯<二氯甲烷<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<吡啶<酸流動相也可以把各種溶劑按不同配比配成混合溶劑以滿足分離過程對流動相的要求，流動相的選擇比固定相的選擇更為復雜分離條件的選擇在選擇層析分離條件時，必須從被分離組分、吸附劑和洗脫劑三方面來考慮。因此以上討論是僅是一般規(guī)律，對于具體的分離應通過實驗來選擇適當?shù)姆蛛x條件。聚酰胺柱層析的洗脫劑通常采用水溶液，各種不同配比的乙醇水溶液，不同配比的丙酮水溶液，稀氨水以及由DMF-醋酸-水-乙醇配成的混合溶劑溶解試樣用的溶劑的極性應與流動相接近，以免因兩者極性相差過大而影響層析分離分配柱層析在分配柱層析中，如果在單位時間內，一個分子在流動相中停留的時間分數(shù)（即在流動相中出現(xiàn)的幾率）以R表示，則對于大量的分子，R則可認為是溶質分子在流動相中和固定相中的濃度比：分配柱層析中的擔體（載體）嚴格來說，擔體只起負載固定相的作用，但由于擔體表面的液膜較薄，通常會出現(xiàn)部分擔體表面裸露的現(xiàn)象，從而在分配作用的同時，也發(fā)生吸附作用分配柱層析分配柱層析常用的固定相為水，也可使用如稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強極性溶劑作為固定相分配柱層析中的流動相一般是與水不相混溶的有機溶劑如正丁醇、正戊醇等。通常流動相應預先用水飽和以防止把吸附于擔體上的水分帶走；通常還需加入醋酸、氨水等弱酸、弱堿，以抵制抑制被分離組分離解。分配柱層析分配柱層析常用來分離強極性的、親水性的物質如脂肪酸、多元醇、水溶性氨基酸等；如分離親脂性的有機物，可用疏水性的有機物物作固定相，有親水性溶劑作流動相。此時極性較強的組分易被洗脫，這與一般的層析規(guī)律相反，故稱反相分配層析；分配柱層析的速度較慢，處理量小，并且溫度的影響較大，因此能使用吸附柱層析分離的試樣總是盡量使用吸附柱層析來分離。柱層析的操作層析柱：為一玻璃或塑料管柱，其直徑/長度比通常為1:10~1:60，底部塞有玻璃纖維或脫脂棉以防止固定相流失。柱層析的操作干法裝柱：將吸附劑通過漏斗緩緩加入管柱中，必要時輕敲管柱，使裝填均均；裝填完畢后，在吸附劑表面鋪一層濾紙，打開下端活塞，從管口慢慢加入洗脫劑，吸附劑充分潤濕后應注意柱內有無氣泡（干法將柱易產生氣泡）。濕法裝柱：先在柱內加入已選定的洗脫劑，將下端旋塞稍打開，同時將吸附劑緩緩加入管柱，吸附劑一面沉淀一面添加。加入的速度不宜太快，否則會帶入空氣，必要時可輕輕敲擊柱子使裝填均勻，并可使所泡逸出。柱層析的操作層析分離（注意點）：(1)溶解樣品溶劑極性應與洗脫劑相近；(2)加樣時注意勿使吸附層受到擾動；(3)試樣盡可能濃；(4)對于難溶于與洗脫劑極性相近的溶劑中的試樣可采用干法上樣；(5)展開時洗脫劑時的流速控制在0.5~2mL/min；(6)洗脫方法[分段洗脫、分別測定；分步洗脫（先弱后強）、切開樣品帶再洗脫]紙層析紙層析是在濾紙上進行的色層分離方法。其原理一般認為屬于分配層析，其固定相為濾紙纖維中吸附的水分；由于濾紙中吸附的水分一般條件下很難脫去，因引紙層析不但可用與水不相混溶的溶劑作流動相，也可以采用丙醇、乙醇、丙酮等與水相混溶的溶劑作流動相。紙層析的分離機理除了分配作用之外，還可能存在吸附和交離子交換作用。紙層析常用紙層析裝置示意圖紙層析中的比移值紙層析過程中的比移值Rf：原點至斑點中心間的距離與原點至溶劑前緣間的距離之比：Rf=1/[1+KD?Vs/Vm]=a(或b)/l紙層析中的比移值Rf=1/[1+KD?Vs/Vm]=a(或b)/l不同組分因KD不同而有不同的Rf值，因此根據(jù)Rf值可進行定性鑒定進行定性鑒定時，必須用純物質在同一濾紙上與試樣并排點樣，在相同的條件下進行對照層析要確定某種組分，最好用兩種以下的不同展開劑展開紙層析條件的選擇層析用紙的選擇：均勻，無折痕，邊緣整齊，纖維素松緊合適，粘度較大的展開劑如正丁醇應選較疏松的快速濾紙，粘度較小的應選較厚的慢速濾紙難分離的組分選慢速濾紙，層析方向應與纖維素方向垂直紙層析條件的選擇固定相和流動相水溶性有機物如氨基酸、糖類等的分離可選以水飽和的正丁醇、正戊醇、酚類等，同時加入適量的弱酸和弱堿如乙酸、吡啶氨水以調節(jié)pH值并防止某些分離組分的離解；分離極性較小的物質如酚類時，為增加其在固定相中的溶解度，可用甲酰胺、DMF、丙二醇等的溶液預先處理濾紙，再用非極性的溶劑如氯仿、苯、環(huán)已烷、四氯化碳以及它們的混合溶劑等作展開劑；分離非極性物質如芳香油等，可采用石蠟汕、硅汕、正十一烷等為固定相，以極性溶劑如水、甲醇、乙醇等作展開劑，即反相層析。紙層析的點樣和展開試樣應溶于適當?shù)娜軇┲?，如乙醇、氯仿、丙酮，盡量避免用水作溶劑，因斑點易擴散，且不易揮發(fā)除去液體試樣可直接點樣，點樣可使用玻璃毛細管或微量注射器，并排點樣斑點相距1.5cm左右為佳，點樣處距濾紙條的一端約1.5~2cm。點樣斑點在2~3mm左右為佳，如試樣較稀，可等溶劑揮發(fā)后再在同一點多次點樣展開可使用上升法（展開較慢）、下降法（適用于小比移值試樣）、徑向法、雙向法（如氨基酸分離）紙層析的顯色有色物質可直接觀察無色物質可用各種物理或化學方法顯色：紫外照射、利用顯色劑（酸堿指示劑、茚三酮）、還原劑（SnCl2還原貴金屬離子金鉑鈀銠等）薄層層析法薄層層析是在紙層析和柱層析的基礎上發(fā)展起來的一種色層法。具有分離效率高、分離速度快、靈敏度高，顯色方法多，應用面廣等優(yōu)點薄層層析法的理論基礎由于毛細作用（展開劑在薄層中存在的各種粗細毛細管中流動）和展開劑蒸汽的吸附作用（改變展開劑的流速），薄層層析的理論比各種柱層析要復雜得多溶劑在薄層中的流速與展開劑的表面張力g、粘度h，以及吸附劑的種類、粒度、均勻度等因素有關，和展開距離也有關。薄層層析法的理論基礎層析過程中，展開劑前緣移動的距離與時間的平方根成正比：L=(kt)1/2 其中比例常數(shù)正比于展開劑的表面張力，反比于展開劑的粘度：kg/h 展開劑前緣移動的速度：vf=dL/dt=0.5k(kt)-1/2=k/2L薄層層析法的理論基礎vf=k/2L即展開劑前緣移動的速度反比于展開劑前緣移動的距離，而實際情況還要復雜得多，展開劑在薄層中的流動速度是空間、時間的復雜函數(shù)。薄層層析法的速率理論幾個必要的假設：1.薄層的組成均勻；2.展開劑的組成恒定不變；3.在薄層中的任意一點在任何時候展開劑的流速恒定不變；4.展開劑的流速比展開劑的前沿移動稍慢。薄層層析法的速率理論平均塔板高度可表示為：其中Z0為液面與原點間的距離，a,b,c為三個常數(shù)，對于一定的層析系統(tǒng)和一定的溶質（即被分離組分），它們的值不變。樣品原點與液面的距離應合適。薄層層析法的速率理論此公式包括三項，從左至右為分子擴散項，它隨展開距離的增大而增大；第二項是填充項，第三項是傳質項，它們均隨展開距離的增加而減小。通常擴散項是主要的，當吸附劑顆粒小，展開距離較長時尤其如此因此分子擴散是塔板高度增大的主要原因。而隨吸附劑顆粒的增大，后兩項將成為主要的，因此要得到最佳的分離效果，合適的粒度是關鍵。薄層層析法的速率理論擴散項常數(shù)：b=2gDm/qdpDm是溶質分子在展開劑中的擴散系數(shù)；dp是吸附劑顆粒的平均直徑；g是溶劑的表面張力；q是溶劑的速度常數(shù)。實踐表明隨著Rf值的降低（保留值增大），塔板高度顯著增大，因此有人建議將b改為：b=2gDm/qdpRf薄層層析法的速率理論填充項常數(shù)：a=1.5A(dp5q/2Dm)1/3 式中A是隨填充（涂鋪）情況而定的常數(shù)，當填充情況極好時，A=1傳質項常數(shù)：c=Sqdp3/2Dm S是隨傳質情況而定的常數(shù)值，當傳質情況良好時，S=0.01C.普通薄層的超壓展開D.高效薄層的超壓展開薄層層析的分離度在薄層層析中層析效率同樣也可用分離度Rs來表示。對于一對組分斑點，層析時它們移動的距離分別為x1，x2，兩個斑點寬為w1，w2，則分離度可按如下定義：Rs=2[(x2-x1)/(w1+w2)]薄層層析的分離度經(jīng)推導Rs和比移值Rf、分配系數(shù)KD、薄層的理論塔板數(shù)N’間有如下關系 可見Rf=0或1時無分離薄層層析的分離度對于一定的層析系統(tǒng)和被分離組分而言Rf=0.33時Rs最大，一般說來當Rf=0.15~0.75時都可以獲得較好的分離效果薄層層析的吸附劑和薄層薄層層析用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、纖維素、聚酰胺等。和柱層析相似，最常用的是硅膠和氧化鋁，它們的吸附能力強，可分離的試樣種類多，相對于柱層析薄層層析用的吸附劑粒度更細些。吸附劑的選擇與柱層析相似薄層層析的吸附劑和薄層氧化鋁：鋪層時不加粘合劑，直接用干粉鋪層，這樣的層析稱為“干板”或“軟板”加入煅石膏作粘合劑的氧化鋁稱為氧化鋁G，用氧化鋁G加水調成糊狀，鋪層并活化后使用的層析稱為“硬板”。薄層層析的吸附劑和薄層氧化鋁活度的測定一般把氧化鋁活化成II-III級或III~IV級使用，很少使用I級（強吸附中心的存在導致斑點拖尾）薄層層析的吸附劑和薄層硅膠：機械性能較差，必須加入粘合劑鋪成硬板使用，常用的粘合劑有煅石膏、聚乙烯醇、淀粉、羧甲基纖維素鈉（CMC）等。不含粘合劑（用時需另加）的硅膠稱為硅膠H。硅膠GF254指既含煅石膏又含熒光指示劑的硅膠；不含粘合劑只含熒光指示劑的硅膠稱為硅膠HF254+366，254nm(ZnSiO4?Mn)，366nm(ZnS?CdS?Ag)薄層層析的吸附劑和薄層反相鍵合固定相的硅膠：薄層層析的吸附劑和薄層鋪層方法：干法鋪層（氧化鋁干板）；濕法鋪層預制薄層板，燒結板（因玻璃粉混合燒結，可經(jīng)洗滌后重復使用），厚薄層板各種特制薄層混合薄層：由兩種不同的吸附劑混合而成。例如要降低硅膠的活度，可以在硅膠中加入一定量的硅藻土，也有將硅膠-氧化鋁混合鋪層。還可以把兩種吸附劑的混合配比逐漸改變，制成梯度薄層，按梯度方向展開，可使在均勻薄層在不能分離的組分得到分離各種特制薄層酸堿薄層和pH緩沖薄層：用于氨基酸或生物堿的分離等絡合薄層：用AgNO3等無機試劑的水溶液代替水調硅膠煳來鋪制的薄層，可用于區(qū)分不飽和程度不同的脂