高三生物一輪復(fù)習(xí)課件 【備課精研+高效課堂】基因工程的基本操作程序

DNA重組技術(shù)的基本工具“分子運(yùn)輸車“”分子手術(shù)刀““分子縫合針”例如：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的簡(jiǎn)要過程提取棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)蘇云金芽孢桿菌抗蟲基因與運(yùn)載體DNA拼接導(dǎo)入普通棉花(無抗蟲特性)棉花植株(有抗蟲特性)基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序：獲：目的基因的篩選與獲取構(gòu)：基因表達(dá)載體的構(gòu)建導(dǎo)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞檢：目的基因的檢測(cè)和鑒定（核心）一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變_______________或獲得_______________等的基因。受體細(xì)胞性狀預(yù)期表達(dá)產(chǎn)物(2)實(shí)例：與生物抗逆性相關(guān)的基因（Bt抗蟲基因）與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因與生物藥物和保健品相關(guān)的基因（胰島素、干擾素基因）與毒物降解相關(guān)的基因與工業(yè)用酶相關(guān)的基因等主要指編碼蛋白質(zhì)的基因。2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關(guān)的______________和____________的基因中進(jìn)行篩選。(2)實(shí)例：已知結(jié)構(gòu)功能清晰Bt抗蟲蛋白基因（Bt基因）的篩選過程

當(dāng)Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。相關(guān)信息：Bt抗蟲蛋白的抗蟲原理：思考討論：抗蟲棉中的Bt抗蟲蛋白會(huì)不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生危害？

Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細(xì)胞也沒有特異性受體，因此，Bt抗蟲蛋白不會(huì)對(duì)人畜產(chǎn)生上述影響。3．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)__________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)_____________________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列提取蘇云金桿菌抗蟲基因？快速獲得大量抗蟲基因3．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因(1)PCR的概念：PCR是________________的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)__________________的原理，在體外提供______________的各種組分與反應(yīng)條件，對(duì)_____________________進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制參與DNA復(fù)制目的基因的核苷酸序列①全稱：②原理：③操作環(huán)境：④目的：⑤優(yōu)點(diǎn)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA半保留復(fù)制體外（PCR擴(kuò)增儀/PCR儀）對(duì)目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）PCR條件:四種脫氧核苷酸(dNTP)激活真核細(xì)胞和細(xì)菌的DNA聚合酶3．利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因注：引物是一小段能與________的一段堿基序列________的___________。

用于PCR的引物有

種，長(zhǎng)度通常為20~30個(gè)核苷酸。DNA母鏈互補(bǔ)配對(duì)短單鏈核酸3’5’DNA母鏈3’5’DNA母鏈3’5’引物3’5’引物2

3’5’3’5’3’5’3’5’A.變性

當(dāng)溫度上升到90℃以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈B.復(fù)性當(dāng)溫度下降到50℃左右時(shí)，兩種引物通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合C.延伸當(dāng)溫度上升到72℃左右時(shí)，溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈PCR反應(yīng)過程：3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’一.目的基因的篩選與獲取(3)利用PCR獲取和擴(kuò)增目的基因第一輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第二輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第二輪循環(huán)的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物作為第三輪反應(yīng)的模板，經(jīng)過變性、復(fù)性和延伸三步產(chǎn)生第三輪的產(chǎn)物；第二輪循環(huán)的產(chǎn)物第三輪的產(chǎn)物完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR的產(chǎn)物③PCR反應(yīng)過程一.目的基因的篩選與獲取PCR反應(yīng)的過程動(dòng)畫：受熱變性引物

耐高溫的DNA聚合酶PCR技術(shù)

(1)過程：(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種_______、四種______________、____________________。引物脫氧核苷酸耐高溫的DNA聚合酶（3）結(jié)果：1個(gè)模板DNA分子經(jīng)過n輪PCR，以_____方式擴(kuò)增，可以擴(kuò)增出

個(gè)DNA片段。指數(shù)2n【知識(shí)小結(jié)】PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較比較項(xiàng)目生物體內(nèi)DNA復(fù)制PCR技術(shù)

區(qū)別解旋方式場(chǎng)所酶溫度條件合成對(duì)象解旋酶催化細(xì)胞內(nèi)(主要在細(xì)胞核內(nèi))DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等細(xì)胞內(nèi)溫和條件DNA分子DNA在高溫作用下變性解旋細(xì)胞外(在PCR擴(kuò)增儀內(nèi))耐高溫的的DNA聚合酶(Taq聚合酶)需控制溫度，在較高溫度下進(jìn)行DNA片段或基因聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進(jìn)行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進(jìn)行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復(fù)制的比較用PCR可以直接擴(kuò)增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴(kuò)增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進(jìn)行擴(kuò)增。①逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補(bǔ)的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；②核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；③以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補(bǔ)的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA獲得了足量的目的基因后，是否能直接將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞呢？若這樣操作，效果如何？——核心步驟1．基因表達(dá)載體構(gòu)建的目的：二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建確保目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在和表達(dá)，并且能遺傳給下一代。2．基因表達(dá)載體的組成：限制酶切割位點(diǎn)啟動(dòng)子終止子質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)標(biāo)記基因便于重組DNA分子的篩選目的基因、標(biāo)記基因、啟動(dòng)子、終止子等位置:位于基因的下游功能:終止轉(zhuǎn)錄本質(zhì):有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段位置:位于基因的上游功能:是RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位,驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA本質(zhì):有特殊序列結(jié)構(gòu)的DNA片段——核心步驟二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建目的基因必須插入到

與

之間。啟動(dòng)子終止子重組DNA分子限制酶3.基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程目的基因限制酶切割位點(diǎn)獲取目的基因DNA連接酶限制酶啟動(dòng)子限制酶切割位點(diǎn)終止子標(biāo)記基因復(fù)制原點(diǎn)質(zhì)粒同種限制酶或能產(chǎn)生相同末端的限制酶？【典例】如圖是利用基因工程技術(shù)培育轉(zhuǎn)基因植物，生產(chǎn)可食用疫苗的部分過程示意圖，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ為四種限制性內(nèi)切核酸酶。下列說法錯(cuò)誤的是(

)BA.卡那霉素抗性基因的存在有利于將含有抗原基因的細(xì)胞篩選出來B.表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)需要用到限制酶SmaⅠC.圖示過程是基因工程的核心步驟D.除圖示組成外，表達(dá)載體中還應(yīng)該含有啟動(dòng)子和終止子等結(jié)構(gòu)辨析：“啟動(dòng)子與終止子”和“起始密碼子與終止密碼子”啟動(dòng)子與終止子位于DNA分子中；作用：起始和終止轉(zhuǎn)錄過程。起始密碼子與終止密碼子位于mRNA分子中；作用：起始和終止翻譯過程。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法花粉管通道法(最多)

導(dǎo)入方法1.花粉管通道法：我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)①用___________將___________________直接注入____中；微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時(shí)間內(nèi)，剪去____，將________滴加在________上，使目的基因借助___________進(jìn)入_____；柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊受體細(xì)胞：受精卵子房花粉柱頭花粉管精子卵細(xì)胞胚囊③花粉管通道法的過程：

目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法①轉(zhuǎn)化：②農(nóng)桿菌特點(diǎn)：a.能在自然條件下侵染___________和_________，而對(duì)大多數(shù)___________沒有侵染能力；雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有______，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將______上的______（___________）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其_________________________；Ti質(zhì)粒Ti質(zhì)粒T-DNA可轉(zhuǎn)移的DNA整合到該細(xì)胞的染色體DNA上

將目的基因插入_____________中，通過農(nóng)桿菌的_____作用，就可以使目的基因___________③利用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化的思路：Ti質(zhì)粒的T-DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入植物細(xì)胞（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞④農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：T-DNA目的基因構(gòu)建表達(dá)載體含目的基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞表現(xiàn)出新性狀的植物植物細(xì)胞將目的基因插入染色體DNA中植物組織培養(yǎng)兩次拼接：第一次拼接是將目的基因拼接到Ti質(zhì)粒的T-DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA拼接到受體細(xì)胞染色體的DNA上。兩次導(dǎo)入：第一次導(dǎo)入是將含目的基因的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌；第二次導(dǎo)入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。

提醒：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法中的兩次拼接、兩次導(dǎo)入⑤轉(zhuǎn)化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；受體細(xì)胞為_______體細(xì)胞b.可以將____直接浸沒在含有農(nóng)桿菌的溶液中一段時(shí)間，然后培養(yǎng)植株并獲得____，再進(jìn)行篩選、鑒定等；受體細(xì)胞為_______花序種子受精卵2.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法（一）導(dǎo)入植物細(xì)胞——顯微注射法1.受體細(xì)胞：受精卵。(因?yàn)槭芫讶菀妆憩F(xiàn)出全能性)2.過程：構(gòu)建基因表達(dá)載體并提純利用顯微注射將基因表達(dá)載體注入動(dòng)物的受精卵中早期胚胎培養(yǎng)胚胎移植獲得具有新性狀的動(dòng)物（二）導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)——Ca2+處理法1.受體細(xì)胞：

常用原核生物作為受體細(xì)胞，其中以大腸桿菌最廣泛。2.原核生物的優(yōu)點(diǎn):

繁殖快、單細(xì)胞、遺傳物質(zhì)相對(duì)較少、易于培養(yǎng)。3.過程:2023/2/7Ca2+處理大腸桿菌使細(xì)胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)將重組的基因表達(dá)載體導(dǎo)入其中（Ca2+的作用：增加細(xì)胞壁的通透性）（感受態(tài)細(xì)胞）（三）導(dǎo)入入微生物細(xì)胞Ca2+感受態(tài)細(xì)胞吸收生物種類植物細(xì)胞動(dòng)物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法;花粉管通道法顯微注射法Ca2＋處理法(感受態(tài)細(xì)胞法)受體細(xì)胞體細(xì)胞或受精卵受精卵原核細(xì)胞小結(jié)：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞(1)花粉管通道法是我國(guó)科學(xué)家獨(dú)創(chuàng)的一種方法，主要適用于雙子葉植物和裸子植物。()解析：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法主要適用于雙子葉植物和裸子植物。(2)農(nóng)桿菌侵入植物細(xì)胞后，其Ti質(zhì)粒上的T－DNA能轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且整合到該細(xì)胞的染色體DNA上。()(3)培育轉(zhuǎn)基因動(dòng)物時(shí)，常選擇受精卵作為受體細(xì)胞，利用顯微注射法將目的基因直接注入受精卵中。(

)(4)將目的基因?qū)朐思?xì)胞時(shí)，通常用大腸桿菌作為受體細(xì)胞，并需要用Ca2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)。(

)×√√√【基礎(chǔ)過關(guān)】【典例】下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的方法中，不正確的是(

) A.我國(guó)利用花粉管通道法培育了轉(zhuǎn)基因抗蟲棉 B.用Ca2＋處理大腸桿菌，使之成為感受態(tài)細(xì)胞 C.將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最常用、最有效的方法是顯微注射法 D.利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育大多單子葉轉(zhuǎn)基因植物

解析：目前我國(guó)的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是利用花粉管通道法培育的，A正確；為使大腸桿菌易吸收DNA分子，應(yīng)先用氯化鈣溶液進(jìn)行處理，使大腸桿菌處于易于吸收周圍環(huán)境中DNA分子的感受態(tài)，B正確；顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞最為有效的一種方法，C正確；農(nóng)桿菌對(duì)大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力，D錯(cuò)誤。D【檢測(cè)】菊花是一種雙子葉植物，易感桃蚜。桃蚜不但直接影響植物生長(zhǎng)，還是多種植物病毒的傳播媒介。雪花蓮凝集素基因GNA的表達(dá)產(chǎn)物能有效抑制桃蚜生長(zhǎng)。某科研團(tuán)隊(duì)運(yùn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得了轉(zhuǎn)GNA基因菊花。下列有關(guān)敘述錯(cuò)誤的是(

)A．受體細(xì)胞可以選擇菊花葉片細(xì)胞或桃蚜細(xì)胞B．將目的基因GNA插入到Ti質(zhì)粒的T-DNA上構(gòu)建表達(dá)載體C．菊花外植體產(chǎn)生的酚類化合物能吸引農(nóng)桿菌移向受體細(xì)胞D．應(yīng)用抗蟲接種實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因菊花對(duì)桃蚜的抗性及抗性的程度A1、目的基因的篩選與獲取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因的檢測(cè)與鑒定基因工程的基本操作的四個(gè)步驟思考：將目的基因成功導(dǎo)入受體細(xì)胞后，為什么還要進(jìn)行目的基因的檢測(cè)與鑒定？

檢查目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，是否穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性；目的:（一）檢測(cè)內(nèi)容及方法:類型檢測(cè)內(nèi)容方法分子水平的檢測(cè)個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定受體細(xì)胞的染色體DNA上是否插入了目的基因目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNAPCR等技術(shù)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原-抗體雜交技術(shù)個(gè)體是否具有相應(yīng)性狀病原體接種實(shí)驗(yàn)等四、目的基因的檢測(cè)與鑒定檢測(cè)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)—

抗原-抗體雜交蛋白質(zhì)（抗原）提取蘇云金桿菌Bt抗蟲蛋白提取抗體出現(xiàn)沉淀轉(zhuǎn)基因抗蟲棉說明轉(zhuǎn)基因抗蟲棉表達(dá)出了Bt抗蟲蛋白抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等個(gè)體水平鑒定（二）鑒定——轉(zhuǎn)基因生物鑒定方法成功標(biāo)志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實(shí)驗(yàn)）害蟲死亡病毒（菌）接種實(shí)驗(yàn)未染病鹽水澆灌正常生長(zhǎng)噴灑除草劑正常生長(zhǎng)提取細(xì)胞產(chǎn)物與天然產(chǎn)品進(jìn)行功能活性比較功能、活性正常(1)常使用PCR等技術(shù)，從分子水平上檢測(cè)棉花的染色體DNA上是否插入了Bt基因或Bt基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。()(2)從分子水平上檢測(cè)目的基因是否翻譯出相關(guān)蛋白質(zhì)的方法之一是利用抗原—抗體雜交技術(shù)。()(3)可以通過鹽堿地栽培試驗(yàn)