第四軍醫(yī)大分子生物學基因工程

一、重組DNA技術相關概念克隆(clone)來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。獲取同一拷貝的過程稱為克隆化(cloning)，即無性繁殖。（一）DNA克隆技術水平：分子克隆(molecularclone)即DNA克隆

細胞克隆個體克?。▌游锘蛑参铮〥NA克隆應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質（同源的或異源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）與載體DNA接合成一具有自我復制能力的DNA分子——復制子(replicon)，繼而通過轉化或轉染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增提取獲得大量同一DNA分子，也稱基因克隆或重組DNA(recombinantDNA)

。目的①分離獲得某一感興趣的基因或DNA②獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）基因工程(geneticengineering)

——實現(xiàn)基因克隆所用的方法及相關的工作稱基因工程，又稱重組DNA技術。重組DNA技術中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內切酶識別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而無53外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標記等逆轉錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進行填補，標記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標記探針末端轉移酶在3′羥基末端進行同質多聚物加尾TaqDNA聚合酶PCR堿性磷酸酶切除末端磷酸基（二）分子克隆實驗指南—冷泉港實驗室5’---A-G-C-T-A-G-A-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-A-G-A-A-T-G-G---5’限制性核酸內切酶（RestrictionEndonuclease）EcoRIenzymeG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G5’---A-G-C-T-A-G3’---T-C-G-A-T-C-T-T-A-AA-A-T-T-C-T-T-A-C-C---3’G-A-A-T-G-G---5’-OH3’5’P--P5’3’OH-EcoliStrainR#I互補的5’突出末端限制性核酸內切酶

限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BamHⅠ細菌限制/修飾體系細菌基因組噬菌體DNAEcoRI甲基化酶EcoRI核酸酶限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine,1978限制性核酸內切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：

Ⅰ型

Ⅱ型*

Ⅲ型限制性核酸內切酶第一類（I型）限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在識別點附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒有專一性，是隨機的。這類限制性內切酶在DNA重組技術或基因工程中用處不大，無法用于分析DNA結構或克隆基因。這類酶如EcoB、EcoK等。限制性核酸內切酶第二類(II型)限制性內切酶能識別專一的核苷酸順序，并在該順序內的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內切酶的識別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內切酶是DNA重組技術中最常用的工具酶之一。限制性核酸內切酶第三類（III型）限制性內切酶也有專一的識別順序，但不是對稱的回文順序,在識別順序旁邊幾個核苷酸對的固定位置上切割雙鏈。但這幾個核苷酸對不是特異性的。因此，這種限制性內切酶切割后產生的一定長度DNA片段，具有各種單鏈末端。因此不能應用于基因克隆。限制性核酸內切酶限制酶識別序列特征A5’----3’----TTCGAHin

dIII

A----5’----3’AGCTT5’----CTGCAG3’----G----3’ACGTC----5’Pst

I

5’----AG3’----TCCT----3’GA----5’Alu

I

平末端長度為4~8bp特征為回文結構粘性末端限制性核酸內切酶第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶限制性核酸內切酶同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC

G+BstⅠ限制性核酸內切酶同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍末端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCC

G++ATCTAG

GATCT

A限制性核酸內切酶https:///products/restriction-endonucleases酶的活性：在適當反應條件下（溫度，pH，離子強度），1小時內完全降解1μgλ

噬菌體DNA中所有同一限制內切酶位點所需的酶量定義為1個活性單位。影響核酸限制性內切酶活性的因素(1)DNA的純度（蛋白質，酚，氯仿，乙醇，SDS，高鹽濃度）；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反應的溫度；(4)DNA的分子結構；(5)緩沖液的pH值。限制性核酸內切酶限制性核酸內切酶反應體系（15uL）：質粒DNA6uL酶10.5uL酶20.5uLBuffer1.5uLH2O6.5uL限制性核酸內切酶DNA連接酶（DNALigase）催化雙鏈DNA的5’-磷酸末端和3’-OH末端之間以磷酸二酯鍵結合

T4DNALigase

，10×T4DNALigaseBufferT4連接酶：連接效率高，既可用于粘端連接，也可用于平端連接。DNA連接酶DNA聚合酶TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine,1959ForthediscoveryofDNApolymeraseI合成雙鏈cDNA分子缺口平移制作同位素標記DNA探針DNA序列分析（一）大腸桿菌DNA聚合酶I（二）Klenow聚合酶Klenowfragment

smallfragment(323AA):having5′→3′exonucleaseactivitylargefragment(604AA):calledKlenowfragment,havingDNApolymerizationand3′→5′exonucleaseactivityNendCendcaroidDNA-polⅠ（三）熱穩(wěn)定DNA聚合酶第一個被發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定DNA聚合酶：Taq。最初的具有耐熱性的DNA聚合酶來自于水生棲熱菌（Thermusaquaticus），因此被稱為Taq。改善了低效的PCR反應。Taq酶缺乏3‘-5’校正外切酶活性，因此，在復制DNA時有時會出錯，造成DNA序列突變（錯配），從古菌中獲得的Pwo酶及Pfu酶均有校正機制，能夠大大降低PCR反應中的突變。將Taq與Pfu結合使用可以保證真實準確得擴增DNA。目的基因的獲取方法文庫篩選PCR獲取化學合成可以獲取序列未知基因，操作繁瑣獲取序列已知基因，操作相對簡單合成序列已知的基因HumanDNA文庫（Library）（一）基因組DNA文庫胰島素基因生長激素基因血紅蛋白基因存在于轉化細菌內由載體攜帶所有基因組DNA的集合問題：如何篩選含目的基因的克隆？文庫篩選文庫篩選（二）CDNA文庫cDNA文庫概述

利用某種生物的總mRNA合成cDNA，再將這些cDNA與載體連接，轉入細菌細胞中進行保存和擴增，稱cDNA文庫。cDNA文庫特點

1)時空特異性構建cDNA文庫時最好選取目的基因表達量最高的發(fā)育時期或這一時期的特殊組織。2)基因特異性來自結構基因，僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表正在表達的基因的遺傳信息。3）器官特異性有的結構基因的表達就有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫也就不同。4）代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結構基因表達亦不相同。相對于基因組文庫而言，cDNA文庫有優(yōu)點1）特別適用于RNA病毒的基因組結構研究。2）出現(xiàn)假陽性的概率較低。3）有效地分析間斷基因的結構。4）發(fā)育過程中時間調節(jié)基因及組織特異基因的表達特征的分析，都要用到cDNA文庫。不足之處1）包含的遺傳信息遠遠少于基因組DNA文庫。2）不能直接獲得基因內含子序列和基因編碼區(qū)外調控序列的結構與功能方面信息。3）在cDNA文庫中，高豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例比較高，分離起來比較容易，而低豐度mRNA的cDNA克隆所占的比例較低，分離也比較困難?；瘜W合成已知基因的核苷酸序列，或根據(jù)氨基酸序列推導核苷酸序列

一般用于小分子活性多肽基因的合成轉化菌篩選鑒定載體DNA

基因組DNA已知基因克隆---PCRβ-globingene

問題：如何在體外大量擴增單基因？Forthe

improvementofthe

polymerasechainreaction

(PCR)technique,TheNobelPrizeinChemistry,1993KaryMullis引物dNTP模板DNA

耐高溫

DNA聚合酶PCR反應要素PCR反應過程變性

(95℃,30s）退火（55℃,30s）延伸（72℃,1min）30循環(huán)HowtoPerformPCR?“PCR僅僅是實驗中的一個小技巧，雖然其中的知識和智慧含量似乎并不豐富，但是畢竟沒有人更早的發(fā)明它。它對分子生物學的影響遠遠超過了其他所有的技術”——諾貝爾頒獎典禮AmazingImagination染色體DNA細菌Ori載體DNA（VectorDNA）

載體：指可以攜帶目的基因進入宿主細胞的運載工具。理想的載體應符合的條件：1.具有自主復制能力，以保證重組DNA在宿主細胞內擴增；2.具有較多拷貝數(shù)，易與宿主細胞染色體DNA分開，便于分離提純；3.分子量相對較小，易于操作，并有足夠的接納目的基因的容量；4.在非宿主功能必須的DNA區(qū)段有較多的單一限制性核酸內切酶位點用于目的基因的克?。?.有一個或多個篩選標記抗性基因Ori目的DNA載體DNA克隆載體抗性基因Ori目的DNA啟動子序列表達載體克隆載體——克隆了外源DNA后，轉入宿主細胞中進行繁殖，使克隆的DNA片段數(shù)量大大增加。表達載體——將外源基因或DNA片段在宿主細胞中表達蛋白質。是否含有表達系統(tǒng)元件，即啟動子--核糖體結合位點--克隆位點--轉錄終止信號，這是用來區(qū)別克隆載體和表達載體的標志1.質粒

DNA存在于細菌染色體之外的環(huán)狀雙鏈DNA分子，可獨立自主地進行自我復制可從一個細菌轉移到另一個細菌廣泛存在于原核細胞，對宿主的生存不是必需的所攜帶的遺傳信息可賦予宿主一些遺傳性狀，如抗藥性按復制方式分類：嚴緊型，1-10拷貝/細胞;松弛型，10-1000拷貝/細胞載體DNApBR3221977年，F(xiàn)ranciscoBolivar克服當時載體的各種缺陷，構建了一個新的載體——pBR322，成為后來幾乎所有基因工程質粒載體的祖先。質粒載體的代表，長4.36kb；在細菌中的拷貝數(shù)（分子個數(shù)）高，便于制備；有數(shù)個限制性內切酶的單一酶切位點用于插入外源片段；有四環(huán)素Tetr和Ampr兩個抗藥性基因標記λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)（允許插入的外源片段遠遠超過質粒，感染能力也大于質粒轉化細菌的能力，所以一直作為基因組文庫和cDNA文庫的克隆載體）λgt系列（插入型，允許插入6-8kb，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，允許插入可達30kb，適用基因組克隆，）2.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列載體DNA酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關病毒，逆轉錄病毒）其他載體DNA1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接外源基因與載體的連接BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶16oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點Bg

lⅡ切割位點+EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ雙酶切T4

DNA連接酶16oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄2.平端連接適用于：限制性內切酶切割產生的平端粘端補齊或切平形成的平端3.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA連接酶15oC重組體目錄4.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生粘性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄導入方式轉化(transformation)：

重組載體導入原核細胞轉染(transfection)：重組載體導入真核細胞感染(infection)：病毒載體導入細胞重組DNA導入宿主細胞受體菌條件安全宿主菌限制酶和重組酶缺陷處于感受態(tài)(competent)

重組DNA導入宿主細胞重組載體導入原核細胞重組DNA導入宿主細胞常用轉染方法：1.磷酸鈣轉染：使DNA形成一種DNA-磷酸鈣沉淀物粘附于細胞表面，通過內吞作用被細胞捕獲。優(yōu)點：不需昂貴的儀器和試劑。2.電穿孔：利用儀器產生的高壓電脈沖，使細胞膜表面出現(xiàn)微小孔洞，重組質粒可通過這些孔洞進入細胞。優(yōu)點：操作簡單轉染效率高3.脂質體轉染法：利用脂質體（一種人造類脂膜）攜帶DNA進入細胞真核細胞表達載體：大多是穿梭載體，有兩套復制原點及選擇標記，分別在大腸桿菌和真核細胞中作用。重組載體導入真核細胞

1.直接選擇法(1)

抗藥性標記選擇(2)標志補救(markerrescue)(3)分子雜交法原位雜交Southern印跡

2.免疫學方法如免疫化學方法及酶免檢測分析等重組體的篩選(插入失活法)抗藥性標記選擇目錄抗性基因OriAmpR氨芐青霉素Ampicillin質粒細菌人DNA組氨酸缺陷型大腸桿菌無組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進組氨酸合成λDNA重組體標志補救目錄α互補的檢測目錄原位雜交目錄瓊脂糖凝膠電泳分離DNA凝膠制備上樣電泳染色結果觀察瓊脂糖凝膠電泳分離DNA凝膠制備——瓊脂糖的稱量凝膠濃度（％）分辨ＤＮＡ范圍（ｂｐ）０.３５０００～６０００００.６１０００～２０００００.９５００～７０００１.２４００～６０００１.５２００～３０００２１００～２０００瓊脂糖凝膠電泳分離DNA1.凝膠制備——瓊脂糖的熔解加熱后加熱前瓊脂糖凝膠電泳分離DNA1.凝膠制備——冷卻凝固瓊脂糖凝膠電泳分離DNA2.上樣瓊脂糖凝膠電泳分離DNA3.電泳瓊脂糖凝膠電泳分離DNA4.DNA染色溴化乙錠瓊脂糖凝膠電泳分離DNA5.結果觀察表達體系的建立表達載體的構建受體細胞的建立表達產物的分離純化（六）克隆基因的表達克隆基因的表達1.原核表達體系（E.coli表達體系最為常用）標準：選擇標志 強啟動子翻譯調控序列 多接頭克隆位點E.coli表達體系的不足

不宜表達真核基因組DNA不能加工表達的真核蛋白質表達的蛋白質常形成不溶性包涵體(inclusionbody)

很難表達大量可溶性蛋白優(yōu)點：可表達克隆的cDNA及真核基因組DNA可適當修飾表達的蛋白質表達產物分區(qū)域積累缺點：操作技術難、費時、經(jīng)濟轉染

——將表達載體導入真核細胞的過程方法：磷酸鈣轉染DEAE葡聚糖介導轉染電穿孔脂質體轉染顯微注射

2.真核表達體系

酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞（一）疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之并研究其性質，而認識疾病的分子機制。三、重組技術與醫(yī)學的關系（二）生物制藥

重組DNA醫(yī)藥產品產品功能組織胞漿素原激活劑抗凝血液因子VIII促進凝血顆粒細胞-巨噬細胞集落剌激因子剌激白細胞生成促紅細胞生成素剌激白細胞生成生長因子(bFGF,EGF)刺激細胞生長與分化生長素治療侏儒癥胰島素治療糖尿病干擾素(1b,2a,2b,)抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶抗組織損傷單克隆抗體利用其結合特異性進行診斷試驗、腫瘤導向治療乙肝疫苗(CHO,酵母)預防乙肝口服重組B亞單位菌體霍亂菌苗預防霍亂目錄基因診斷(geneticdiagnosis)是利用分子生物學及分子遺傳的技術和原理，在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。（三）基因診斷基本過程區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴增待測的DNA片斷標準.能正確擴增靶基因；.能準確區(qū)分單個堿基的差別；.本底或噪聲低，不干擾DNA的鑒定;.便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。（四）基因治療定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。方式體細胞基因治療(somaticcellgenetherapy)性細胞基因治療(germlinegenetherapy)1.產前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性（五）遺傳疾病的預防思考題

Therearemanypossiblebenefitsofgeneticengineeringinhumans,likeendofhunger,cureforallailments,longlife,