中藥材快檢方法研究-鄭州藥分會-杜慶鵬課件

中藥材中金屬汞、鎘元素和兩類（總有機(jī)磷、氨基甲酸酯）農(nóng)藥的殘留量的快速檢測方法研究

中國藥品生物制品檢定所

中藥與民族藥檢驗管理處

2010-03-03由于中藥的安全性已經(jīng)嚴(yán)重阻礙中藥的臨床應(yīng)用和發(fā)展。目前，我國已逐步制訂完善了中藥材和中成藥中重金屬元素和農(nóng)藥殘留量的檢測標(biāo)準(zhǔn)方法和限量標(biāo)準(zhǔn)。但在配合重大安全預(yù)警事件反應(yīng)缺失、現(xiàn)場檢測方面研究的涵蓋面不夠，需進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究中藥有害殘留物快速檢測方法。簡介主要內(nèi)容一、中藥材中汞快速檢測試紙方法研究（紙片法）二、中藥材中鎘快速檢測試紙方法研究（紙片法）三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留

快速測定方法（速測卡）一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究方法原理

在酸性條件下，顯色劑二苯碳酰二肼（DPC）與Hg2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，生成紫紅色絡(luò)合物（520nm），檢測試紙由白色變?yōu)樽霞t色，顏色的深淺與Hg2+的含量成正比。儀器與試劑

二苯碳酰二肼；乳化劑OP；緩沖溶液：pH9.0的硼砂-NaOH緩沖體系；分析用定量濾紙圖1自制反應(yīng)裝置A-為100ml標(biāo)準(zhǔn)錐形瓶；B-帶彎口中空的標(biāo)準(zhǔn)磨口塞，上連彎口的乳膠導(dǎo)氣管C；D-為玻璃口；E-帶刻度玻璃管或者塑料管。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究試紙制作

取10ml0.5%二苯碳酰二肼乙醇溶液，加入2ml12%乳化劑OP；將定量分析用濾紙剪成0.6cm寬的試紙條，用上述溶液充分浸泡后自然晾干，備用。使用時，剪成0.6×0.8cm試紙片。試紙使用方法

取3.0ml待測樣品，加入1.0ml緩沖溶液；從試紙瓶中快速取出一條汞檢測試紙浸入上述樣品溶液中，20秒后取出；檢視，與對照顏色比較，即可對樣品中汞含量進(jìn)行定性或定量檢測。粉紅紫紅一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究標(biāo)準(zhǔn)色階

分別取系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液3ml置10ml刻度試管中，加1mlpH=9.0的硼酸-氯化鉀緩沖液，混勻，用1％NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至5.0左右，取試紙片置于上述溶液中浸泡片刻，取出檢視。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究條件優(yōu)化反應(yīng)酸度的選擇

試驗中遇到試紙本底顏色變化較大嚴(yán)重影響顏色判斷的問題，經(jīng)查找原因發(fā)現(xiàn)酸度的強弱影響試紙本底的顏色，干擾實驗結(jié)果的檢視。為了減少這種本底顯色的干擾，對在不同的酸度條件下試紙本底的顯色進(jìn)行了研究，經(jīng)優(yōu)化選擇在pH=5.0的酸性條件下本底顯色最淺，對實驗的干擾會最小。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究表面活性劑的選擇

由于在紙層析實驗中易出現(xiàn)擴(kuò)散，影響結(jié)果。本實驗采用加入一定量表面活性劑，使待測體系的穩(wěn)定性增加并且能減小顏色擴(kuò)散程度，因此實驗中分別比較了10%、12%、15%的OP乳化劑含量時試紙的顯色以及色階的情況。12%和15%的色階明顯好于10%，而12%和15%結(jié)果差別不大，因此試驗采取加入2ml12%的乳化劑OP量。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究紙片顯色時間及絡(luò)合物的穩(wěn)定性

紙片浸泡片刻后，將試紙片取出放置到白色PV底板上在0~30分鐘內(nèi)觀察顏色的變化。

隨著試紙暴露在空氣中時間的延長，顯色越深，色階越不明顯。因此最佳的觀察時間應(yīng)該在試紙取出之后，待殘留在白板上的液體揮發(fā)完全而試紙表面仍舊保持濕潤的情況下檢視（觀察）。具體觀察的時間可以根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)具體情況具體掌握。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究樣品提取酸液的酸度選擇

分別采取1%、3%、5%的鹽酸進(jìn)行提取試驗，發(fā)現(xiàn)3%的鹽酸空白本底干擾較小，而且與起泡劑的反應(yīng)速度適中，因此選擇3%的鹽酸作為提取樣品溶液一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究回收試驗

取中藥材黃芪粗粉約2.0g置于50ml錐形瓶，加20ml3%HCl，分別添加汞1、10μg/ml對照品溶液，振搖10min，按上述方法操作一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究產(chǎn)氣劑的回收效率

對3ml含汞（5μg/ml）的標(biāo)準(zhǔn)液，按標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)氣得3毫升吸收液（回收液），與標(biāo)準(zhǔn)的吸收液3ml（含汞濃度5μg/ml、對照溶液）相比較。從圖看略有差異。說明該操作方法下，溶液轉(zhuǎn)換較為完全。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究結(jié)果與討論

*目前已經(jīng)市場化的汞快速測定的方法，比如北京一家公司所生產(chǎn)的銅片法快速測定汞含量。我們將銅片法與我們的實驗方法進(jìn)行了比較實驗，發(fā)現(xiàn)，銅片法只有當(dāng)汞的含量大于20μg/ml時銅片表面才會出現(xiàn)銀灰色，而且現(xiàn)象不明顯，不太好判斷，此方法靈敏度較低，而且實驗費時，費力，不方便現(xiàn)場操作，而我們的方法靈敏度較高（3μg/ml），并且實驗時間短，易操作，不需要加熱，適用于現(xiàn)場操作，為中藥材中重金屬汞的現(xiàn)場質(zhì)量控制提供了比較好的方法依據(jù)。方法驗證

濃度為1μg/ml的汞標(biāo)準(zhǔn)溶液加產(chǎn)氣劑，按標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)氣得吸收液，用原子熒光法進(jìn)行測定，結(jié)果吸收液汞含量為1.01μg/ml，同時進(jìn)行試紙法測定，結(jié)果表明該溶液汞含量為1μg/ml左右。產(chǎn)氣后的溶液殘留汞含量為0.012μg/ml，試紙法測定結(jié)果為空白色。

結(jié)果說明：

（1）產(chǎn)氣劑反應(yīng)較完全，

（2）試紙法測定結(jié)果與儀器分析法檢驗結(jié)果基本一致。一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究一、中藥材中重金屬汞的快速檢測方法研究結(jié)果與討論*顯色劑使用過程中要避光。*制作好的試紙要避光保存，現(xiàn)用現(xiàn)取，不可置于空氣中過長時間。*由于試紙片顏色變化為櫻紅色到紫紅色，兩種顏色干擾較大，基于肉眼觀察的基礎(chǔ)，我們認(rèn)為當(dāng)最低檢出濃度為3μg/ml時人眼觀察比較明顯，誤判的幾率會大大減少，而且比較時最好同時做一隨行對照，并且最好使用同一批次的紙片。*有條件的情況下可以將產(chǎn)氣劑壓成片子，直接使用，既攜帶方便又減少了稱量過程，同時還保證產(chǎn)氣反應(yīng)相對持久。*處理樣品時采用投入產(chǎn)氣劑的方式，操作簡單，樣品的顏色等因素不會干擾實驗現(xiàn)象，并且不會引入其他的干擾離子。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究方法原理

在堿性條件下，鎘試劑與Cd2+反應(yīng)生成橘紅色絡(luò)合物（330nm），顏色的深淺與Cd2+的含量成正比，通過顏色的深淺就可以確定鎘的濃度。儀器和試劑鎘試劑

氫氧化鉀

乙醇；定量濾紙；0.1%鎘試劑的氫氧化鉀乙醇溶液

（取0.1克鎘試劑，加0.125mol/L氫氧化鉀乙醇溶液，溶解，并稀釋至100mL）二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究試紙制作方法

配置0.1%鎘試劑的氫氧化鉀乙醇溶液，將定量分析用濾紙剪成0.6cm寬的試紙條，充分浸泡后自然晾干，備用。使用時，剪成0.6×0.8cm試紙片。試紙使用方法

取10ml待測樣品，置15ml刻度試管中，用氫氧化鉀（10mol/l）調(diào)節(jié)（約6~7滴）pH值約為7.0，從試紙瓶中快速取出一條鎘檢測試紙浸入上述樣品溶液中，5秒后取出，檢視。

與標(biāo)準(zhǔn)色階比較，即可對樣品中鎘含量進(jìn)行定性或半定量檢測。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究標(biāo)準(zhǔn)系列色階的制備

取鎘標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100μg/ml）適量，分別加3%HNO3稀釋并配制成0.0、0.1、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0μg/mlCd2+標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，檢驗。黃色橘紅色測定步驟*取中藥材粉碎（粗粉）或者剪成小碎片，取約2g精密稱定于50mL錐形瓶中，加20mL3%HCl，振搖5min，靜置。（同時作試劑空白）*取上清液10mL和試劑空白液按上述方法進(jìn)行測定，之后與標(biāo)準(zhǔn)色階或者隨行對照溶液顏色比較。*完成一次檢驗周期耗時僅為15~20分鐘二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究紙片浸入反應(yīng)時間的選擇

同時將六片試紙片浸于5.0μg/mlCd2+溶液中，分別在5s、10s、20s，30s，40s，50s后取出觀察顏色深淺由試驗可知，鎘與鎘試劑的反應(yīng)是迅速的，因此只要紙片在溶液中浸透以保證顯色均勻即可，我們選擇了5s的反應(yīng)時間。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究紙片取出最佳檢視時間的選擇

將紙片從溶液中取出后置于白色底板上，記錄放置不同時間后顏色的變化及色階情況，實驗所用鎘標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度分別為1.0μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml、10.0μg/ml。

最佳觀察時間應(yīng)該在2~10min時觀察，為節(jié)省實驗時間我們選擇了放置2min時觀察顏色。二、中藥材中重金屬鎘的快速檢測方法研究結(jié)果與討論1.鎘試紙顏色變化由空白的黃色，轉(zhuǎn)為橘紅色，濃度太低時，肉眼不太好分辨，考慮到本實驗?zāi)康氖强焖俸Y選，因此我們認(rèn)為本法的最低檢出濃度為0.5μg/ml時即可滿足實驗要求。2.本試紙片貯藏進(jìn)行了-34℃、室溫、50℃，1~6個月的考察。結(jié)果表明，該試紙在六個月內(nèi)均可保證有效。3.通過對幾十種中藥材中Cd2+含量測定的研究，認(rèn)為本方法是可行的。個別藥材如金銀花，紅花等樣品，建議藥材不要粉碎過細(xì)或者提取時間過長，提取之后馬上測定，防止色素影響結(jié)果的檢視。4.本研究研制出的鎘試紙主屬性較強，方法操作簡便快速、靈敏、攜帶方便，是一種比較理想的檢測試紙，可以用于定性和半定量分析。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法隨著近年來人民生活水品的日益提高，人們對農(nóng)藥殘留的關(guān)注程度是與日俱增。雖然在這方面國家已經(jīng)頒布了眾多的政策法規(guī)來規(guī)范農(nóng)藥的使用，出臺了各類農(nóng)藥殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行監(jiān)管，同時檢驗儀器的推陳出新不斷提高農(nóng)殘檢測技術(shù)的靈敏度。但是在現(xiàn)場監(jiān)控方面還有著許多的不足。我們之所以選擇有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥作為檢驗的方向。是因為上述兩種農(nóng)藥現(xiàn)今適用范圍廣；毒性大；且屬于急性中毒性反應(yīng)。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法方法原理：膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍(lán)色），有機(jī)磷或氨基甲酸脂類農(nóng)藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發(fā)生改變，由此可判斷出樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在。試劑及試藥

固化有膽堿酯酶和靛酚乙酸酯試劑的紙片（速測卡）；磷酸氫二鈉；無水磷酸二氫鉀；乙酸乙酯；pH7.5磷酸氫二鈉緩沖溶液；PR-3測定儀

下面將分有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥兩個方面進(jìn)行說明三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法對照溶液的考察

以對硫磷為代表進(jìn)行實驗。用緩沖溶液依次稀釋即得（一）有機(jī)磷類農(nóng)藥有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)色階藍(lán)白三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法供試品溶液制備

第一法

取中藥材樣品適量，搗碎成粗粉稱取1.0g放入帶蓋塞瓶中，加入10mL緩沖溶液，振搖，靜置片刻，取上清液備用（適用于一般樣品）。

第二法

取中藥材樣品適量，搗碎成粗粉，稱取1.0g樣品放入帶蓋瓶中，加入10mL乙酸乙酯，超聲3分鐘，靜置，取上清液過活性炭小柱，取濾液2mL于50℃水浴蒸至近干，加1mL緩沖溶液溶解，備用（適用于色素含量較高的樣品）。（一）有機(jī)磷類農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法測定

取一片速測卡，在白色藥片上滴2～3滴供試品溶液，放置10min進(jìn)行預(yù)反應(yīng)，（有條件時在37℃±2℃恒溫裝置中放置10min，預(yù)反應(yīng)后的反應(yīng)表面必須保持濕潤）然后將速測卡對折，用手捏3min（或用恒溫裝置恒溫3min），使紅色藥片與白色藥片疊合發(fā)生反應(yīng)。之后觀察白色藥片的顏色變化。注：每批次測定應(yīng)設(shè)一個緩沖溶液的空白對照卡。完成一次檢驗周期耗時僅為20~30分鐘（一）有機(jī)磷類農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法中藥材中添加農(nóng)藥的回收試驗的考察*取麥冬粗粉樣品數(shù)份，并按某一系列濃度對樣品進(jìn)行對照品添加。按第一法制備（一）有機(jī)磷類農(nóng)藥*取紅花粗粉數(shù)份，并按某一系列濃度對樣品進(jìn)行對照品添加。按第二法制備。對照溶液的情況考察

稱取對照品抗蚜威5mg和克百威5mg于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度?？偘被姿狨ヮ愞r(nóng)藥濃度為100μg/mL。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法（二）氨基甲酸酯類農(nóng)藥藍(lán)白三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法

供試品溶液配制及測定，同前文有機(jī)磷測定中藥材中添加農(nóng)藥的回收情況考察

取麥冬粗粉樣品數(shù)份，并按某一系列濃度對樣品進(jìn)行對照品添加。按第一法制備（二）氨基甲酸酯類農(nóng)藥

取銀杏葉粗粉數(shù)份，并按某一系列濃度對樣品進(jìn)行對照品添加。按第二法制備。三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留快速測定方法

樣品測定

根據(jù)中藥的莖、根、葉、花、果等分類，選取了有代表性的幾十種中藥材進(jìn)行實驗。如黃芪、紅花、金銀花、銀杏葉等。按方法一、二法制備供試液，測定。結(jié)果

所有參與實驗的中藥材檢測結(jié)果都呈陰性，未檢出有機(jī)磷或者氨基甲酸酯類農(nóng)藥三、中藥材中有機(jī)磷及氨基甲酸酯