第五章植物人工繁殖

第五章植物人工繁殖生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院蘭花組織培養(yǎng)：一個(gè)組織培養(yǎng)成功產(chǎn)業(yè)化的植物。珍稀而名貴的達(dá)摩蘭等名貴蘭花，如今已成市井之花。一株不過(guò)百元。脫毒植物的培育：土豆，"第二面包"，"植物之王”，熱量低于谷類(lèi)糧食是理想的減肥食物和玉米小麥水谷類(lèi)糧食，是理想的減肥食物，和玉米、小麥、水稻、燕麥被稱(chēng)為世界五大糧食作物。傳統(tǒng)途徑存在的問(wèn)題？為什么要采用組織培養(yǎng)？視頻重要知識(shí)回顧1、細(xì)胞全能性：是指分化細(xì)胞保留著全部的核基因組，具有生物個(gè)體生長(zhǎng)、發(fā)育所需要的全部遺傳信息具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛需要的全部遺傳信息，具有發(fā)育成完整個(gè)體的潛能。2、細(xì)胞分化：是指細(xì)胞在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上發(fā)生差異的過(guò)程，包括時(shí)間上和空間上的分化。同一種類(lèi)型的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分裂后，逐漸在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上形成穩(wěn)定性的差異，產(chǎn)生不同的細(xì)胞類(lèi)群的過(guò)程。3、脫分化：也稱(chēng)去分化，是指分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過(guò)程，即分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝誀顟B(tài)而重新獲得分裂能力的過(guò)程。脫分化后的植物細(xì)胞經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無(wú)組織結(jié)構(gòu)、無(wú)明顯極性的松散的細(xì)胞團(tuán)，稱(chēng)之為愈傷組織。4、再分化：是指在離體條件下，無(wú)序生長(zhǎng)的脫分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下重新進(jìn)入有序生長(zhǎng)和分化狀態(tài)的過(guò)程。5、脫分化是細(xì)胞全能性表現(xiàn)的前提，而再分化是最終體現(xiàn)，是再生的基礎(chǔ)。第一節(jié)植物人工繁殖植物外植體愈傷組織單細(xì)胞體細(xì)胞胚激素調(diào)控器官發(fā)生胚胎發(fā)育再生植株人工種子植物人工繁殖的主要目的是為了克服自然有性生殖的不足，滿(mǎn)足對(duì)優(yōu)良植物的大量需求。植物人工繁殖通過(guò)無(wú)性繁殖的組織培養(yǎng)、人工種子、胚胎培養(yǎng)等技術(shù)實(shí)驗(yàn)植物快速繁殖。愈傷組織：在離體培養(yǎng)過(guò)程中形成的具有分生能力的一團(tuán)不規(guī)則細(xì)胞，多在外植體切面上產(chǎn)生。第二節(jié)植物組織培養(yǎng)植物組織培養(yǎng)是將植物器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等（屬于外植體）在無(wú)菌條件下培養(yǎng)在人工培養(yǎng)基上，在適當(dāng)條件下誘發(fā)長(zhǎng)成完整植株的一種技術(shù)。外植體：主要指用于離體培養(yǎng)的植物或組織切段或組織切段。不同植物品種的取材部位和發(fā)育階段不同。通常為生長(zhǎng)點(diǎn)或幼嫩組織。植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用1、脫毒和離體快速繁殖（1）種苗脫毒：可以有效地培育出大量的無(wú)病毒種苗。很多農(nóng)作物如馬鈴薯、甘薯、大蒜等都帶有病毒，但感病植株并非每個(gè)部位都帶有病毒，White在1943年就發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)點(diǎn)附近的病毒濃度很低甚至無(wú)病毒。利用組織培養(yǎng)方法，取一定大小的莖尖進(jìn)行培養(yǎng)再生可獲得脫病毒苗，再用脫毒苗進(jìn)行繁殖，則種植的作物就不會(huì)或極少發(fā)生病毒。目前已經(jīng)取得成功的有馬鈴薯、草莓、香蕉等。（2）離體快速繁殖：運(yùn)用組織培養(yǎng)法繁殖植物的明顯特點(diǎn)是快速，每年可以數(shù)百萬(wàn)倍的速度繁殖。對(duì)一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的名、優(yōu)、特植物品種的繁殖意義尤為重大。觀(guān)賞植物、園藝作物、經(jīng)濟(jì)林木、無(wú)性繁殖等作物等部分或大部分都用離體快繁提供苗木，試管苗已出現(xiàn)在國(guó)際市場(chǎng)上并形成產(chǎn)業(yè)化。3、育種（1）單倍體育種：?jiǎn)伪扼w植株往往不能結(jié)實(shí)，在培養(yǎng)中用秋水仙素處理可使染色體加倍，成為純和的二倍體植株，這種培養(yǎng)技術(shù)稱(chēng)為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純和等優(yōu)點(diǎn)，因此，通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)的單倍體育種，已經(jīng)作為一種嶄新的育種手段目前，在水稻、小麥、玉米、辣椒以及許多藥用植物如枸杞、人參，平貝母中獲得單倍體植株，共計(jì)300多種。（2）誘變和篩選：細(xì)胞培養(yǎng)中，胞內(nèi)遺傳物質(zhì)會(huì)發(fā)生一些變異（自發(fā)產(chǎn)生或誘發(fā)產(chǎn)生），通過(guò)此法可以直接誘變篩選出具抗病、抗鹽以及高賴(lài)氨酸、高蛋白等優(yōu)良性狀的品種。（3）體細(xì)胞雜交（4）三倍體育種（5）轉(zhuǎn)基因育種4、種質(zhì)資源的保存植物種質(zhì)資源的保存、挽救瀕于滅絕的植物。長(zhǎng)期以來(lái)人們想了很多方法來(lái)保存植物，如儲(chǔ)存果實(shí)，儲(chǔ)存種子，儲(chǔ)存塊根、塊莖等；方法上也采用常溫、低溫、變溫、低氧、充惰性氣體等，這些方法在一定程度上收到了好的或比較好的效果，但仍存在許多問(wèn)題，比如代價(jià)高，空間大，保存時(shí)間短，而且易受環(huán)境條件限制。植物組織培養(yǎng)結(jié)合超低溫保存技術(shù)，可以給植物種質(zhì)保存帶來(lái)一次大的飛躍。因?yàn)楸４嬉粋€(gè)細(xì)胞就相當(dāng)與保存一粒種子，但所占的空間僅為原來(lái)的幾萬(wàn)分之一，而且在液氮中可以長(zhǎng)時(shí)間保存，不像種子那樣需要年年更新或經(jīng)常更新。植物組織培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)1、周期短，便于人工控制培養(yǎng)條件，繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高。2、占用空間小，不受地區(qū)、季節(jié)限制限制。3、繁殖珍稀、瀕危苗木和突變體是優(yōu)良品種培育的有效途徑。4、利于保持原來(lái)品種的特性。植物組織培養(yǎng)---植物細(xì)胞脫分化與再分化細(xì)胞分化：同一種類(lèi)型的細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞分裂后，逐漸在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能上形成穩(wěn)定性的差異，產(chǎn)生不同的細(xì)胞類(lèi)群的過(guò)程。脫分化：分化細(xì)胞失去特有的結(jié)構(gòu)和功能變?yōu)榫哂形捶只?xì)胞特性的過(guò)程。再分化：在離體條件下，無(wú)序生長(zhǎng)的脫分化的細(xì)胞在適當(dāng)條件下重新進(jìn)入有序生長(zhǎng)和分化狀態(tài)的過(guò)程。脫分化分裂再分化成熟細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織器官發(fā)生再生植株脫分化再生細(xì)胞分化細(xì)胞分裂和分化組成植物體人工脫分化和再分化誘導(dǎo)再生植物體脫分化再分化植物組織培養(yǎng)---植物脫分化脫分化分裂再分化成熟細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織器官發(fā)生再生植株再生植物的成熟的已分化的細(xì)胞通過(guò)植物激素的誘導(dǎo)進(jìn)入脫分化過(guò)程并形成愈傷組織。此過(guò)程經(jīng)歷三個(gè)階段：1、誘導(dǎo)期：細(xì)胞形態(tài)如多大變化，胞內(nèi)代謝水平上升，RNA迅速增加，胞核體積增大2、分裂期：細(xì)胞數(shù)量迅速增加，細(xì)胞體積小，胞核增大3、形成期：細(xì)胞大小平均，形成分生組織結(jié)節(jié)和維管組織結(jié)節(jié)植物組織培養(yǎng)---植物再分化方式脫分化分裂再分化成熟細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織器官發(fā)生再生植株愈傷組織的形態(tài)發(fā)生方式主要有不定芽方式（器官發(fā)生）和胚狀體方式兩種。1、不定芽方式是在某些條件下，愈傷組織中的分生細(xì)胞發(fā)生分化，形成不同的器官原基，再逐漸形成芽和根。2、胚狀體方式是由愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化出具有胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而長(zhǎng)成完整植株。這種由愈傷組織中的薄壁細(xì)胞不經(jīng)過(guò)有性生殖過(guò)程，直接產(chǎn)生類(lèi)似于胚的結(jié)構(gòu)，叫做胚狀體。器官發(fā)生途徑（不定芽）胚狀體發(fā)生或無(wú)性胚胎發(fā)生途徑再生影響植物細(xì)胞脫分化和再分化因素內(nèi)部因子：植物的遺傳性狀、生理狀況。外部因子：營(yíng)養(yǎng)條件（植物激素、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分等）、環(huán)境條件（培養(yǎng)基的ph、滲透壓、溫度、濕度、光照等）。不同程度的影響植物細(xì)胞脫分化、再分化及器官建成的各個(gè)過(guò)程。植物生長(zhǎng)物質(zhì)的添加量生長(zhǎng)素(mg/L)330.030細(xì)胞分裂素(mg/L)

0.20.0210.2當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素濃度比高時(shí)，有利于芽的發(fā)生；濃度比低時(shí)，有利于根的發(fā)生。愈傷組織再分化過(guò)程應(yīng)先誘導(dǎo)生芽，再誘導(dǎo)生根植物組織培養(yǎng)---植物組織的再生方式脫分化分裂再分化成熟細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織器官發(fā)生再生植株不定芽型器官型器官發(fā)生型胚狀體發(fā)生型原球型再生再生方式1、不定芽型：不定芽：在高等植物正常的個(gè)體發(fā)育中，芽一般是只從莖尖或葉腋等位置生出。這種芽稱(chēng)為定芽。與此相反，凡從葉、根、或莖節(jié)間或是離體培養(yǎng)的愈傷組織等部位生出的芽則統(tǒng)稱(chēng)為不定芽。不定芽型是指誘導(dǎo)頂端分生組織產(chǎn)生不定芽，再生成植株的方式。即選取已經(jīng)發(fā)育成熟的頂芽和腋芽，連同它們的短枝經(jīng)表面消毒后，在無(wú)菌條件下培養(yǎng)，誘導(dǎo)不定芽并使其生根形成植株的方式。特點(diǎn)：不僅繁殖率高，利用外植體原有的芽，包括隱芽在內(nèi)繁殖數(shù)量大，同時(shí)能保持該物種的遺傳穩(wěn)定性，只要有明顯的頂端分生組織和次生分生組織的植物均適用。不定芽2、器官型：從器官外植體誘導(dǎo)不定芽，再生成植株的方式。即選取充分發(fā)育的器官諸如莖、葉、花器、鱗片等，經(jīng)離體培養(yǎng)而產(chǎn)生植株的方式。如煙草、大蒜、甘藍(lán)的花莖培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽；水仙、百合、風(fēng)信子、貝母的鱗片培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽；亞麻的下胚軸培養(yǎng)誘導(dǎo)不定芽；虎眼萬(wàn)年青的任何一部分均可誘導(dǎo)不定芽。特點(diǎn)：遺傳性也比較穩(wěn)定，但繁殖速度慢。3、器官發(fā)生型從器官外植體誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)愈傷組織細(xì)胞的分化再生成植株的方式。如甘蔗、水稻、小麥，百合、小蒼蘭、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕櫚等常以器官發(fā)生型方式再生植株。特點(diǎn)：繁殖速度快，由于經(jīng)愈傷組織而再生植株，遺傳性不穩(wěn)定。4、胚狀體發(fā)生型由植物器官、組織和細(xì)胞培養(yǎng)而直接發(fā)生類(lèi)胚體結(jié)構(gòu)，最后以胚狀體成苗的方式。胚狀體：離體培養(yǎng)條件下，沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程，但是經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚狀類(lèi)似物，此現(xiàn)象無(wú)論在體細(xì)胞培養(yǎng)還是生殖細(xì)胞培養(yǎng)中均可以看到，因而統(tǒng)稱(chēng)為體細(xì)胞胚或胚狀體。在被子植物中有胚狀體發(fā)生的植物已達(dá)100余種，分屬近40個(gè)科。特點(diǎn)：遺傳性一致，有些植物體細(xì)胞發(fā)生數(shù)量也相當(dāng)大。如胡羅卜1L培養(yǎng)基有10萬(wàn)個(gè)以上的胚狀體。5、原球莖型種子萌發(fā)時(shí)先是胚的膨大，種皮破裂，40天時(shí)肉眼可見(jiàn)淺黃色的原胚呈球狀，稱(chēng)為原球莖。原球莖結(jié)構(gòu)為短縮的、珠粒狀的、胚性細(xì)胞、類(lèi)似幼莖的器官，可增殖、形成原球莖叢。蘭屬植物特有的器官發(fā)生方式。種子消毒后，在培養(yǎng)基上播種，經(jīng)一段時(shí)間培養(yǎng)而發(fā)生原球莖，然后由原球莖直接長(zhǎng)成植株。

幾種器官發(fā)生方式的優(yōu)點(diǎn)、缺點(diǎn)比較（1）不定芽型容易成苗，對(duì)培養(yǎng)基要求不高，后代遺傳性較為穩(wěn)定，但取材受到一定的限制，僅限于具有明顯頂端分生組織和次生分生組織的物種；（2）器官型和胚狀體發(fā)生型，對(duì)培養(yǎng)基要求高，器官發(fā)生條件苛刻。繁殖數(shù)量不如不定芽型和器官發(fā)生型多，但遺傳性穩(wěn)定；（3）器官發(fā)生型成苗數(shù)量大，對(duì)培養(yǎng)基要求不算高，容易調(diào)配。但由于是通過(guò)愈傷組織成苗，細(xì)胞的染色體容易發(fā)生數(shù)量和結(jié)構(gòu)變異，很難使再生植株群體保持穩(wěn)定的遺傳性。植物組織培養(yǎng)---植物組織的再生途徑脫分化分裂再分化成熟細(xì)胞分生細(xì)胞愈傷組織器官發(fā)生再生植株再生器官發(fā)生途徑體細(xì)胞胚發(fā)生途徑再生途徑1、器官發(fā)生途徑（1）啟動(dòng)期：通過(guò)向培養(yǎng)基中添加一定濃度、種類(lèi)和比例的外源激素刺激外植體細(xì)胞改變?cè)瓉?lái)的代謝途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞活化，重新獲得分裂能力。需要選擇合適的較高濃度的生長(zhǎng)素誘導(dǎo)劑（如NAA、IAA、2-4D等）或細(xì)胞分裂素啟動(dòng)誘導(dǎo)外植體細(xì)胞脫分化和分裂。（2）愈傷組織誘導(dǎo)：細(xì)胞開(kāi)始分裂并不斷增生子細(xì)胞的過(guò)程。這個(gè)階段一般需要降低激素濃度，有些情況下甚至不需要生長(zhǎng)素和分裂素。（3）擬分生組織的形成：將愈傷組織轉(zhuǎn)移到有利于有序生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)部開(kāi)始發(fā)生系于有序生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)，細(xì)胞內(nèi)部開(kāi)始發(fā)生一系列形態(tài)和生理變化，分化出形態(tài)和功能不同的細(xì)胞。在若干部位出現(xiàn)類(lèi)似形成層的細(xì)胞群，通常稱(chēng)為“生長(zhǎng)中心”，又可稱(chēng)為“擬分生組織”，該過(guò)程是器官發(fā)生的一個(gè)轉(zhuǎn)變時(shí)期。（4）器官原基和器官的形成：擬分生組織形成后，一些細(xì)胞分化成為管狀細(xì)胞，進(jìn)而形成維管組織形成不同的器官原基進(jìn)步分化出相應(yīng)的組織，形成不同的器官原基，進(jìn)一步分化出相應(yīng)的組織和器官。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑體細(xì)胞胚又叫胚狀體，指離體培養(yǎng)條件下沒(méi)有經(jīng)過(guò)受精過(guò)程而形成的胚胎。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑：指體細(xì)胞在離體培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程。包括器官外植體直接發(fā)生途徑，懸浮細(xì)胞途徑和愈傷組織途徑。體細(xì)胞胚起源于非合子細(xì)胞，因此不同于合子胚。1、器官外植體直接發(fā)生途徑莖表皮、葉、子葉、下胚軸等外植體分化細(xì)胞經(jīng)過(guò)脫分化后均可以產(chǎn)生胚狀體。一般經(jīng)過(guò)兩個(gè)階段：1）誘導(dǎo)期。葉片表皮細(xì)胞或亞表皮細(xì)胞感受刺激后進(jìn)入分裂狀態(tài)，形成小的瘤狀突起；2）胚胎發(fā)育期。瘤狀物繼續(xù)發(fā)育，經(jīng)過(guò)球形胚、心形胚等階段最后形成體細(xì)胞胚。2、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生途徑：在懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中一些細(xì)胞可以產(chǎn)生胚性細(xì)胞團(tuán)，一個(gè)胚性細(xì)胞團(tuán)可以發(fā)育成一個(gè)胚狀體，也可以產(chǎn)生多個(gè)胚狀體。3、愈傷組織發(fā)生途徑：愈傷組織內(nèi)部或表面細(xì)胞均可以產(chǎn)生胚狀體。包括三個(gè)階段：1）誘導(dǎo)外植體形成愈傷組織；2）誘導(dǎo)愈傷組織胚性化；3）體細(xì)胞胚形成。分生組織/胚狀體脫分化再分化（分化）幼芽或幼根條件？?jī)?yōu)點(diǎn)？特點(diǎn)？繁殖速度快不受季節(jié)限制幼苗無(wú)毒保持優(yōu)良性狀①適宜溫度、無(wú)光照、pH和無(wú)菌環(huán)境。②無(wú)機(jī)、有機(jī)成分和植物激素（生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素和赤霉素）無(wú)定形狀態(tài)薄壁細(xì)胞高度液泡化排列疏松、無(wú)規(guī)則分化程度低脫分化較易離體的植物器官、組織或細(xì)胞愈傷組織外植體植物體再生植物組織培養(yǎng)的問(wèn)題分析1、玻璃化問(wèn)題植物組織培養(yǎng)中，常會(huì)出現(xiàn)一些半透明狀的畸形試管植物，這類(lèi)植物體被稱(chēng)為“玻璃苗”，這種現(xiàn)象稱(chēng)為玻璃化現(xiàn)象，又稱(chēng)過(guò)度水化現(xiàn)象。由于玻璃苗的組織結(jié)構(gòu)和生理功能異常，因此分化能力低，難以增殖成芽，也難以生根成苗，移栽大田更難成活。玻璃化已成為組培的大問(wèn)題。組織培養(yǎng)過(guò)程中試管苗的玻璃化現(xiàn)象主要是試管苗不能很好適應(yīng)培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)性的生理問(wèn)題。2、褐變問(wèn)題褐變可分為酶促褐變和非酶促褐變。酶促褐變是由多酚氧化酶引起的。當(dāng)外值體處于機(jī)械損傷等逆境時(shí)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)遭到破壞，多酚氧化酶催化多酚類(lèi)化合物，使其發(fā)生氧化形成棕褐色的醌類(lèi)物質(zhì)和水；醌類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)非酶促聚合，形成黑褐色物質(zhì)(羥醌與黑色素等)，引起褐變的發(fā)生。3、微生物污染造成污染的病原菌主要包括外部污染菌和內(nèi)源菌。外部污染菌主要由外植體帶菌或培養(yǎng)基滅菌不徹底以及操作人員操作不慎造成。內(nèi)源菌引起的污染與外植體的種類(lèi)、取材季節(jié)、部位、預(yù)處理及消毒方法等密切相關(guān)。應(yīng)該嚴(yán)格按照無(wú)菌操作，取材時(shí)應(yīng)選擇嫩梢、新芽或胚作為外植體材料，對(duì)外植體進(jìn)行徹底消毒。4、品種限制目前，裸子植物組織培養(yǎng)成功的比較少。主要原因是裸子植物很難脫分化誘導(dǎo)成具有全能性的細(xì)胞。對(duì)細(xì)胞脫分化能力不同，決定了組織培養(yǎng)再生的難易。植物組織培養(yǎng)技術(shù)---培養(yǎng)基技術(shù)培養(yǎng)基的組成無(wú)機(jī)鹽有機(jī)物調(diào)節(jié)物質(zhì)其他物質(zhì)糖類(lèi)氨基酸維生素醇類(lèi)植物激素生長(zhǎng)素細(xì)胞分裂素赤霉素1、無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度通常在25mmol/L左右。根據(jù)添加量多少分為大量元素(濃度大于0.5mmol/L)和微量元素(濃度低于0.5mmol/L)。大量元素主要有氮、硫、磷、鉀、鈣、鎂。微量元素主要包括鐵、錳、銅、鋅、氯、硼、鉬等。微量元素對(duì)于蛋白或酶的生物活性十分重要并參與生物過(guò)程的調(diào)節(jié)分重要，并參與生物過(guò)程的調(diào)節(jié)。2、有機(jī)物（1）糖類(lèi)糖是離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞所必需的，既可以作為碳源，又可以維持滲透壓。最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是較好的碳源。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。（2）氨基酸氨基酸是很好的有機(jī)氮源，可直接被細(xì)胞吸收利用。培養(yǎng)基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。通常采用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（包括酪蛋白水解物）、谷氨酰胺或氨基酸混合物。（3）維生素維生素以各種輔酶的形式參與多種代謝活動(dòng)，對(duì)生長(zhǎng)、分化等有促進(jìn)作用。大多數(shù)的植物細(xì)胞在培養(yǎng)中都能合成所必需的維生素，但在數(shù)量上不足，通常需加入一至數(shù)種維生素。常用的維生素包括鹽酸硫胺素（VB1）、鹽酸吡哆醇（VB6）、抗壞血酸（Vc）、煙酸（Vpp）、生物素（Vh）、泛酸鈣、葉酸等。VB1對(duì)愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有重要作用；VB6能促進(jìn)根的生長(zhǎng)；Vc有防止組織變褐的作用。（4）肌醇肌醇對(duì)糖類(lèi)的相互轉(zhuǎn)化有促進(jìn)作用。肌醇能促進(jìn)愈傷組織的生長(zhǎng)以及胚狀體和芽的形成，對(duì)組織和細(xì)胞的繁殖、分化有促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞壁的形成也有作用。腺嘌呤是合成細(xì)胞分裂素的前體物質(zhì)之一。添加腺嘌呤能促進(jìn)細(xì)胞合成分裂素，有利于細(xì)胞的分裂和分化，促進(jìn)芽的形成。3、調(diào)節(jié)物質(zhì)（1）植物激素植物激素是植物自然狀態(tài)下產(chǎn)生的、對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育有顯著作用的微量有機(jī)物。植物激素能影響植物的生長(zhǎng)和分化。在個(gè)體發(fā)育中，不論是種子發(fā)芽、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、繁殖器官形成以至整個(gè)器官成熟過(guò)程都主要由激素控制。植物體內(nèi)的激素與細(xì)胞內(nèi)某種稱(chēng)為激素受體的蛋白質(zhì)結(jié)合后，影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，并對(duì)特殊酶的合成起調(diào)控作用，從而表現(xiàn)出調(diào)節(jié)代對(duì)特殊酶的合成起調(diào)控作用從而表現(xiàn)出調(diào)節(jié)代謝的功能。（2）生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素是由色氨酸通過(guò)一系列中間產(chǎn)物形成的。在植物組織培養(yǎng)中，生長(zhǎng)素主要用來(lái)刺激細(xì)胞分裂和誘導(dǎo)根的分化。常用的生長(zhǎng)素有吲哚乙酸（IAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）等。IAA能促進(jìn)生長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的分裂和非生長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，誘導(dǎo)根系的發(fā)生，促進(jìn)雌花的分化及果實(shí)的形成。NAA和IBA廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。2，4-D起動(dòng)能力比IAA高10倍，特別在促進(jìn)愈傷組織的形成上活力最高，但它強(qiáng)烈抑制芽的形成。（3）細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素大多是嘌呤族衍生物。自然狀態(tài)下分裂素主要在根中形成，莖端、萌發(fā)中的種子、發(fā)育中的果實(shí)和種子也能合成分裂素。分裂素的生理作用主要是誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。分裂素主要有6-呋喃氨基嘌呤（激動(dòng)素KT）、6-芐基腺嘌呤（6-BA）和玉米素（ZT）等。其中最常用的是6-芐基腺嘌呤。ZT活性最強(qiáng)，但昂貴。激素配比生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素高適中低有利于根的形成和愈傷組織的形成有利于根芽的分化有利于芽的形成培養(yǎng)基分類(lèi)1、富鹽平衡培養(yǎng)基目前使用最廣泛的一類(lèi)，代表性的培養(yǎng)基有MS、LS、BL、BM、ER等。特點(diǎn)：無(wú)機(jī)鹽濃度高，微量元素種類(lèi)齊全，濃度高；元素間比例適當(dāng)，離子平衡性好，具有較強(qiáng)的緩沖能力、穩(wěn)定性好、營(yíng)養(yǎng)豐富，一般培養(yǎng)時(shí)無(wú)需再加入有機(jī)成分。2、高硝態(tài)氮培養(yǎng)基代表性培養(yǎng)基有B5、N6、SH。特點(diǎn)是：硝酸鉀濃度高，氨態(tài)氮濃度低，含有較高濃度的硫胺素（VB1）。3、中鹽培養(yǎng)基代表性培養(yǎng)基有Nitsch、Miller、Blaydes、H。大多是在MS培養(yǎng)基基礎(chǔ)上進(jìn)行改良設(shè)計(jì)。特點(diǎn)是：大量元素?zé)o機(jī)鹽為MS的一半，微量元素種類(lèi)減少、含量增高。維生素種類(lèi)比MS增多，例如增加了生物素、葉酸等。4、低鹽培養(yǎng)基代表性培養(yǎng)基有White、WS、HE、HB。特點(diǎn)是：無(wú)機(jī)鹽有機(jī)成分含量濃度低多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)成分含量濃度低，多用作生根培養(yǎng)的培養(yǎng)基。1、加熱溶解；分別加入各種儲(chǔ)存液，包括生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他特殊補(bǔ)加物；2、稱(chēng)取規(guī)定數(shù)量的瓊脂和蔗糖，加水至培養(yǎng)基最終容積的3/4。3、加蒸餾水至培養(yǎng)基的最終容積；混合后調(diào)節(jié)ph；4、分裝培養(yǎng)基；用棉塞封口；5、高壓滅菌；培養(yǎng)基室溫冷卻，至4℃冰箱中保存。培養(yǎng)基制備過(guò)程實(shí)驗(yàn)材料必須嚴(yán)格清洗，清洗過(guò)程勿傷實(shí)驗(yàn)材料。對(duì)一些特殊的植物材料需要特殊的處理。表面具較厚蠟質(zhì)和角質(zhì)層的，滅菌劑不易粘著，可加入少量表面活性劑。外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格地滅菌。對(duì)器官外植體的滅菌，一般采用多種清洗藥劑配合使用的方法。清洗藥劑滅菌法適用于培養(yǎng)材料的表面消毒。選擇消毒劑，既要考慮具有良好的消毒殺菌作用，同時(shí)又易被蒸餾水沖洗掉或能自行分解的物質(zhì)，且不會(huì)損傷或只輕微損傷組織材料而不影響生長(zhǎng)。在使用不同的藥劑時(shí)，需要考慮使用濃度和處理時(shí)間。植物組織培養(yǎng)技術(shù)---滅菌技術(shù)不同器官的滅菌1、莖尖、莖段及葉片等的消毒：用清潔劑清洗70%酒精浸泡10-20min無(wú)菌水洗2-3次Naclo或升汞溶液泡10-15min無(wú)菌水洗3-4次。2、果實(shí)和種子的消毒：自來(lái)水沖洗10-30min70%酒精漂洗2%Naclo液浸10min無(wú)菌水2-3次取出種子培養(yǎng)。3、根及地下部器官的消毒：自來(lái)水沖洗純酒精漂洗升汞浸5-10min或2%Naclo液浸10-15min無(wú)菌水洗3次。4、花藥的消毒：70%酒精浸泡數(shù)秒鐘無(wú)菌水洗2-3次漂白粉上清液浸10min無(wú)菌水洗2-3次。接種是按照不同的要求將培養(yǎng)物移至滅菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過(guò)程。接種過(guò)程必須嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作一防止雜菌污染。接種的操作步驟1、玻璃瓶加消毒液消毒，搖動(dòng)玻璃瓶2-3次，后無(wú)菌蒸餾水清洗，3-4次2、消毒所有使用的器械，蘸入70%酒精，取出火焰灼燒，冷卻后可用，每次使用后消毒一次。3、用消毒后的器械切取適當(dāng)外植體，放置于無(wú)菌培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基上，移入培養(yǎng)室培養(yǎng)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)---接種技術(shù)切取接種愈傷組織的形成分化形成小芽或根試管苗的形成移栽經(jīng)典的植物人工繁殖過(guò)程消毒人工種子：又稱(chēng)合成種子或體細(xì)胞種子，是指將植物離體培養(yǎng)中的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功能的人工胚乳和人工種皮中形成的類(lèi)似種子的顆粒。結(jié)構(gòu)上從外向里包括三部分：（1）人工種皮外層：保護(hù)胚狀體中的水分免于喪失和防止外部力量沖擊；（2）人工胚乳：含有的水分免于喪失和防止外部力量沖擊；含有必需的營(yíng)養(yǎng)成分和某些植物激素；（3）胚狀體或芽。第二節(jié)人工種子植物外植體愈傷組織單細(xì)胞體細(xì)胞胚激素調(diào)控器官發(fā)生胚胎發(fā)育再生植株人工種子誘導(dǎo)植物愈傷組織↓體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)↓體細(xì)胞胚的成熟↓體細(xì)胞胚的機(jī)械化包裹↓貯藏或種植人工種子的優(yōu)點(diǎn)（1）便于運(yùn)輸和儲(chǔ)藏（相對(duì)于試管苗）。（2）人工胚乳可根據(jù)不同植物的要求配制，通過(guò)加入植物激素、有益微生物或抗病抗蟲(chóng)成分，使人工種子優(yōu)越于天然種子。（3）可以固定雜種優(yōu)勢(shì)，加速良種繁育。（4）可作為植物基因工程和遺傳工程的載體。（5）可保存珍貴稀有植物品種。（6）大規(guī)模繁殖植物（尤其是沒(méi)有種子和種子昂貴的植物）關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題1、胚狀體同步發(fā)育高質(zhì)量和高數(shù)量的胚狀體是大量制備人工種子的基礎(chǔ)。控制胚狀體發(fā)育的同步化是人工種子制備的核心技術(shù)之一，主要方法如下：（1）抑制劑法：在細(xì)胞培養(yǎng)初期加入細(xì)胞分裂抑制劑（如5-氨基尿嘧啶），一旦去除抑制劑后細(xì)胞可以同步發(fā)育。（2）低溫法：低溫處理抑制細(xì)胞分裂，再恢復(fù)正常溫度可以使細(xì)胞分裂同步化。（3）滲透壓法：不同發(fā)育時(shí)期的胚狀體對(duì)滲透壓的要求不同，用一定的滲透壓使胚狀體停止在某一階段，然后再使其同步發(fā)育。（4）通氣法：細(xì)胞分裂旺盛時(shí)有大量氣體（如乙烯等）生成?？梢酝ㄟ^(guò)在培養(yǎng)基中通入乙烯或氮?dú)饪刂萍?xì)胞同步分裂。（5）分離篩選法：用不同孔徑的篩網(wǎng)將不同發(fā)育時(shí)期的胚狀體分離開(kāi)來(lái)，也可以采用密度梯度離心法來(lái)選擇不同發(fā)育期的胚狀體。2、人工種皮制作理想的人工種皮應(yīng)該具有保護(hù)胚狀體的功能，并且具有無(wú)毒、良好的通氣性、抗污染、適合運(yùn)輸?shù)忍攸c(diǎn)。最早采用的材料是聚氧乙烯，但是具有定毒性、易溶解于水等不足。目前采用海藻酸鹽較多，其具有成膠容易、操作條件溫和、使用方便、毒性低、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。但是也存在一些缺點(diǎn)，如水性營(yíng)養(yǎng)成分易流失表面易結(jié)團(tuán)等。因此開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)理想的人工種皮材料仍是一個(gè)重要課題。3、人工胚乳配制人工胚乳主要包括無(wú)機(jī)鹽、碳水化合物、蛋白質(zhì)等（培養(yǎng)基組分）。人工胚乳是胚胎發(fā)育的營(yíng)養(yǎng)保證。由于糖等物質(zhì)的存在易導(dǎo)致微生物污染，所以要加入防腐劑、抗菌素、農(nóng)藥等成分。4、包埋包埋是人工種子制作的重要一環(huán)。方法主要有以下兩種下兩種：（1）干燥法：早期較古老的方法，將胚狀體置于23℃、70%左右相對(duì)濕度、黑暗條件下逐漸干燥，然后用聚氧乙烯等種皮材料包裹。（2）水凝膠法：目前比較常用的一種方法，用海藻酸鈉等水溶性凝膠與氯化鈣進(jìn)行離子交換后凝固的特點(diǎn)包埋單個(gè)胚狀體或芽。種子硬度由凝膠濃度與絡(luò)合時(shí)間控制。將成熟的體細(xì)胞胚胎與包被液相混合，然后將其滴入（只允許一個(gè)通過(guò)）適當(dāng)濃度的氯化鈣溶液中，經(jīng)過(guò)絡(luò)合作用（生成海藻酸鈣）的造形過(guò)程，在20-30分鐘內(nèi)形成內(nèi)含細(xì)胞胚并有一定硬度的雛形人工種子。1、人工種皮性能不盡人意。2、還沒(méi)有一種符合多數(shù)植物胚狀體需要的人工胚乳工胚乳。3、胚狀體儲(chǔ)藏階段的休眠控制；4、如何保證長(zhǎng)期儲(chǔ)藏而又不影響萌發(fā)率；5、制作流程較繁瑣、成本高。6、許多植物還不能成功地誘導(dǎo)出高質(zhì)量體細(xì)胞胚胞胚。存在的問(wèn)題1．植物組織培養(yǎng)的過(guò)程可以歸納為：―→④。對(duì)此敘述有錯(cuò)誤的是(

)A．②→③的再分化過(guò)程中，當(dāng)細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度比低時(shí)，有利于根的生成B．植物組織培養(yǎng)所依據(jù)的原理是植物細(xì)胞的全能性C．③→④過(guò)程包含了器官再生途徑和體細(xì)胞胚再生途徑D．②包裹上人造種皮可獲得人工種子2．下列有關(guān)植物體細(xì)胞雜交的敘述，不正確的是(

)A．用酶解法去掉細(xì)胞壁，分離出有活力的原生質(zhì)體B．誘導(dǎo)兩種植物的原生質(zhì)體融合，進(jìn)而形成雜種細(xì)胞C．植物體細(xì)胞雜交的最終目的是獲得細(xì)胞代謝產(chǎn)物D．植物體細(xì)胞雜交技術(shù)可以克服不同種間遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙3.下列屬于組織培養(yǎng)的是()A．花粉培育成單倍體植株B．芽發(fā)育成枝條C．根尖分生區(qū)發(fā)育成成熟區(qū)D．未受精的卵細(xì)胞發(fā)育成個(gè)體7.下面關(guān)于植物細(xì)胞工程的敘述，正確的是(多選)()A．葉肉細(xì)胞脫分化后可形成具有分裂能力的薄壁細(xì)胞B．葉肉細(xì)胞經(jīng)再分化過(guò)程可形成愈傷組織C．融合植物葉肉細(xì)胞時(shí)，應(yīng)先去掉細(xì)胞膜D．葉肉細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)，可以表現(xiàn)出全能性第三節(jié)植物胚胎培養(yǎng)植物胚胎培養(yǎng)（EmbryoCulture）概念：指對(duì)植物的胚、子房、胚珠和胚乳進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植物的技術(shù)。植物胚胎培養(yǎng)包括：1、胚培養(yǎng)（成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)）2、胚珠培養(yǎng)3、子房培養(yǎng)4、胚乳培養(yǎng)5、離體受精等胚胚芽胚軸胚根子葉種子胚珠胚培養(yǎng)：指在無(wú)菌條件下將胚從胚珠或種子中分離出來(lái)，置于培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)。胚的發(fā)育過(guò)程包括從合子分裂到幼胚形成直至發(fā)育為成熟胚的過(guò)程。植物胚胎發(fā)生過(guò)程：原胚球形胚心型胚魚(yú)雷胚子葉胚成熟胚球形胚前期球形胚心型胚前期魚(yú)雷胚1、胚培養(yǎng)球形胚前期球形胚心型胚魚(yú)雷胚成熟胚成熟胚培養(yǎng)(matureembryo)幼胚培養(yǎng)(immatureembryo)子葉形成之前子葉形成之后胚培養(yǎng)類(lèi)型（1）成熟胚培養(yǎng)：指子葉期至發(fā)育成熟的胚培養(yǎng)。成熟胚是自養(yǎng)的，培養(yǎng)基需要簡(jiǎn)單。僅提供一定的溫度、濕度就可以發(fā)芽生成植物體。如種子的發(fā)育。培養(yǎng)過(guò)程：種子——》95%酒精消毒——》選取完好種子——》70%酒精浸數(shù)秒——》0.1%升汞或10%次氯酸鈉浸泡——》無(wú)菌水沖洗——》種子培養(yǎng)幾天——》剝離種胚——》接種在培養(yǎng)基上。臺(tái)灣紅豆杉成熟胚培養(yǎng)牡丹成熟胚的離體培養(yǎng)與快速繁殖（2）幼胚培養(yǎng)：幼胚是指處于原胚期、球形期、心形期、魚(yú)雷期的胚培養(yǎng)；幼胚完全是異養(yǎng)的，離體條件下培養(yǎng)要求培養(yǎng)基成分復(fù)雜，培養(yǎng)不易成功。幼胚培養(yǎng)的生長(zhǎng)發(fā)育方式：胚性發(fā)育：胚只是在體積上增大甚至超過(guò)正常胚大小而不能萌發(fā)成苗。早熟萌發(fā)：幼胚不再發(fā)育，迅速萌發(fā)成幼苗。多數(shù)情況一個(gè)幼胚萌發(fā)成一個(gè)植株，有時(shí)因細(xì)胞分裂形成許多胚狀體，進(jìn)而形成許多植株，即叢生胚現(xiàn)象。愈傷組織：多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織。再分化成胚狀體或形成芽苗。影響幼胚培養(yǎng)的因素：A、天然提取物及某些蛋白制品；1934年銀杏幼胚培養(yǎng)中添加銀杏胚乳有促進(jìn)作用；1941年曼佗羅幼胚培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)添加椰子乳能很好的促進(jìn)幼胚的發(fā)育(200-500um的幼胚)。此外，大麥胚乳、麥芽提取物、酵母提取物、水解酪蛋白等都能促進(jìn)幼胚的發(fā)育。B、滲透壓的作用：胚發(fā)育早期要求較高的的滲透壓，而隨著胚的發(fā)育逐漸降低。C、植物激素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的作用：加入適當(dāng)濃度的生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)胚的發(fā)育，單一激素影響發(fā)育。D、其他因素：pH值以5.4-5.8適宜多數(shù)幼胚。溫度25-30oC適宜多數(shù)植物。2、胚珠培養(yǎng)及子房培養(yǎng)：胚珠培養(yǎng)包括授粉胚珠和未授粉胚珠的培養(yǎng)。1942年最早在蘭花上獲得成功，縮短了授粉到成熟的時(shí)間。1980年成功培養(yǎng)了未授粉的非洲菊、煙草的胚珠，獲得了單倍體植株。胚珠培養(yǎng)：將胚珠從母株中分離出來(lái)，放在無(wú)菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，以致形成幼苗的過(guò)程。根據(jù)胚珠是否受精分為兩類(lèi)：未受精胚珠的培養(yǎng)受精胚珠的培養(yǎng)胚珠培養(yǎng)技術(shù)大孢子或卵單倍體植株種子愈傷組織再生植株胚珠培養(yǎng)的方法子房表面滅菌剖開(kāi)子房壁取出胚珠接種培養(yǎng)如培養(yǎng)受精胚珠，摘取授粉時(shí)間合適的子房；如培養(yǎng)未受精胚珠，則在授粉前摘取子房胚珠或帶胚珠的胎座將子房從母株上摘下，放在無(wú)菌的人工環(huán)境條件下，讓其進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育，以至形成幼苗的過(guò)程。子房培養(yǎng)包括授粉子房和未授粉子房培養(yǎng)。1949年和1951年最早在黃瓜、番茄、菜豆、草莓、煙草等植物上獲得成功。授粉子房培養(yǎng)形成成熟果實(shí)和種子；未授粉子房培養(yǎng)形成小的無(wú)籽果實(shí)。受精后的子房仍需進(jìn)行表面消毒后再接種。而未受精子房可將花被表面消毒后，在無(wú)菌條件下直接剝?nèi)∽臃拷臃N。子房培養(yǎng)只需較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基即可形成果實(shí)，并含成熟種子。子房培養(yǎng)技術(shù)子房培養(yǎng)的方法授粉或授粉后的子房表面消毒接種培養(yǎng)影響胚珠培養(yǎng)的因素：（1）材料選擇：品種間的差異、胚囊發(fā)育時(shí)期（2）材料的消毒：污染、消毒劑（3）培養(yǎng)基：A.植物激素授粉胚珠：細(xì)胞分裂素對(duì)胚發(fā)育通常有促進(jìn)作用。未授粉胚珠：外源激素不利于向日葵孤雌生殖。矮牽牛未授粉胚珠培養(yǎng)不需激素，其他需要適當(dāng)添加。B.有機(jī)物：添加有機(jī)附加物可以促進(jìn)授粉胚珠的發(fā)育。C.蔗糖濃度：3-12%，通常5%，高濃度利于孤雌生殖。（4）胎座組織的影響：促進(jìn)胚的發(fā)育。3、胚乳培養(yǎng)胚乳培養(yǎng)：是指將胚乳組織從母體上分離出來(lái)，通過(guò)離體培養(yǎng)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。被子植物胚乳是由2個(gè)單倍的極核和1個(gè)單倍的精子結(jié)合而成的3倍體組織。由它可獲得無(wú)子結(jié)實(shí)的3倍體植株，進(jìn)而可將它加倍成6倍體植株。裸子植物很特殊，它的胚乳在受精前就已形成。裸子植物的胚乳為配子體的一部分，由大孢子直接分裂發(fā)育而成，因此是單倍體組織。胚乳培養(yǎng)過(guò)程含胚乳的果實(shí)或種子表面消毒無(wú)菌條件下胚乳的剝離接種培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)室溫度25-27℃，黑暗或弱光下胚乳培養(yǎng)應(yīng)注意的問(wèn)題：（1）確定適宜的發(fā)育時(shí)期（生長(zhǎng)旺盛期）；（2）嚴(yán)格區(qū)分胚乳和其他組織；（3）合理使用激素；（4）注意光、溫條件（24-280C；黑暗條件）。離體授粉技術(shù)：將未授粉的離體胚珠或子房接種在培養(yǎng)上，然后在試管內(nèi)撒播花粉。在離體的、受人工控制的環(huán)境下，通過(guò)技術(shù)操作來(lái)完成植物雌雄配子體的融合。受精后的胚珠進(jìn)一步發(fā)育成種子。根據(jù)授粉的部位可分為：（1）離體柱頭授粉：（2）離體子房授粉：（3）離體胚珠授粉：離體受精技術(shù)：在離體條件下完成被子植物精、卵融合，并將受精所所生的“人工合子”培養(yǎng)成再生植株。離體受精技術(shù)的突破的技術(shù)前提：（1）雌配子和雄配子分離技術(shù)（2）單對(duì)原生質(zhì)體(精卵)融合技術(shù)（3）微培養(yǎng)技術(shù)(合子培養(yǎng)與植株再生技術(shù))4、離體授粉與離體受精培養(yǎng)部位意義類(lèi)型外植體選取取材時(shí)間培養(yǎng)方法胚珠1.克服雜種胚敗育2.進(jìn)行試管受精3.用于單倍體育種1.受精胚珠培養(yǎng)2.未受精胚珠培養(yǎng)選取合適子房，表面消毒后取出胚珠球形胚長(zhǎng)大形成種子，繼而形成幼苗子房1.誘導(dǎo)單倍體植株2.進(jìn)行試管受精3.獲得雜種植株1.受精子房培養(yǎng)2.未受精子房培養(yǎng)選取合適子房，表面消毒后直接接種開(kāi)花前1～5d形成果實(shí)或形成胚狀體、愈傷組織胚乳1.獲得三倍體植株2.不同倍性胚乳植株1.核型胚乳培養(yǎng)2.細(xì)胞型胚乳培養(yǎng)幼嫩果實(shí)表面消毒后取出種子，分離出胚乳授粉后4～8d誘導(dǎo)形成愈傷組織，然后分化形成胚狀體或器官胚珠、子房和胚乳培養(yǎng)的對(duì)比1、植物胚胎培養(yǎng)分為哪些類(lèi)型？各有何特點(diǎn)和要求？2、胚胎培養(yǎng)有何重要意義？3、在進(jìn)行幼胚培養(yǎng)時(shí)，由于幼胚過(guò)小而分離困難，可采取什么途徑？4、為什么幼胚比成熟胚培養(yǎng)要求的培養(yǎng)基成分復(fù)雜？5、在植物組織培養(yǎng)中，通過(guò)哪些途徑可以得到完整的植株？思考題第四節(jié)脫毒植物培養(yǎng)植物組織中病毒的分布病毒在植物組織中分布不均勻：在頂端分生組織中含毒少，在老組織中病毒增加。（莖尖培養(yǎng)脫毒的理論依據(jù)）植物莖尖分生組織無(wú)病毒原理（原因）：(1)能量競(jìng)爭(zhēng)：病毒核酸和植物細(xì)胞分裂時(shí)DNA合成均需要消耗大量的能量，而病毒核酸的合成要靠植物提供能量來(lái)自我復(fù)制，因而就得不到足夠的能量，從而就抑制了病毒核酸的復(fù)制。(2)傳導(dǎo)抑制：病毒在植物體內(nèi)的傳播主要是通過(guò)維管束實(shí)現(xiàn)的，但在莖尖分生組織中，維管組織還不健全或不存在，從而抑制了病毒向分生組織的傳導(dǎo)。(3)激素抑制：在分生組織中，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素水平均很高，因而阻滯了病毒的侵入或者抑制病毒的合成。(4)酶缺乏：病毒的合成需要的酶系統(tǒng)在分生組織中缺乏或還沒(méi)建立，因而病毒無(wú)法在分生組織中復(fù)制。(5)抑制因子：在分生組織中存在有某種抑制因子，如“酶鈍化系統(tǒng)”。常用的植物脫毒方法生物方法：1.莖尖培養(yǎng)法：目前最常用的脫毒方法，其機(jī)理是病原體在植物體內(nèi)的分布是不均勻的，越靠近生長(zhǎng)點(diǎn)，病毒濃度越低。2.愈傷組織培養(yǎng)法：通過(guò)無(wú)毒的愈傷組織培養(yǎng)可以獲得無(wú)毒植株。珠心組織培養(yǎng)法：通過(guò)無(wú)毒的珠心組織培養(yǎng)可以獲得無(wú)毒植株。物理方法1.熱處理法：傳統(tǒng)的消毒方法，其基本原理是植物細(xì)胞比病毒耐高溫。用37℃溫度熱處理植物材料，在不損傷培養(yǎng)材料的前提下，抑制病毒的復(fù)制，鈍化病毒的活性。2.低溫冷凍法化學(xué)方法嘌呤、嘧啶類(lèi)似物，氨基酸，抗生素等處理患病植物，從而抑制植物體內(nèi)病毒的復(fù)制。一、莖尖培養(yǎng)脫毒

1、根據(jù)培養(yǎng)目的和取材大小可將莖尖培養(yǎng)分為:1）普通莖尖（Shoottip）培養(yǎng)。較大莖尖（幾毫米至幾十毫米的莖尖）培養(yǎng)技術(shù)。技術(shù)簡(jiǎn)單，操作方便，莖尖易成活，成苗所需時(shí)間短，能加速繁殖速度。2）莖尖分生組織(apicalmeristem)培養(yǎng)。僅限于幼齡葉原基頂端圓錐區(qū)，其直徑和長(zhǎng)度大約100～250μm，即小于0.3mm的莖尖為莖尖分生組織。馬鈴薯莖尖分生組織培養(yǎng)2、在莖尖培養(yǎng)中影響脫毒的因素1）培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)成分：MS培養(yǎng)基，K+NH4+含量生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：少量的生長(zhǎng)素（NAA,IAA)、細(xì)胞分裂素（6-BA）、GA32）外植體的大?。簺Q定存活率的大小

三個(gè)因素：根除病毒、可以發(fā)育為完整植株的能力、帶有葉原基。3）培養(yǎng)條件：光照4000lx（照光比暗培養(yǎng)效果好，但對(duì)于易褐化的材料需一段暗培養(yǎng)）

溫度：25±2℃（低溫會(huì)使莖尖休眠，不利于萌發(fā)）。4）外植體的生理狀態(tài)：頂芽莖尖比腋芽莖尖效果好。