第三章紫外-可見分光光度分析法

第三章紫外-可見分光光度法顏色的產(chǎn)生白光(太陽光)：由各種單色光組成的復(fù)合光

單色光：單波長的光(由具有相同能量的光子組成)

可見光區(qū)：400-750nm

紫外光區(qū)：近紫外區(qū)200-400nm遠紫外區(qū)10-200nm（真空紫外區(qū)）

有色物質(zhì)的不同顏色是由于吸收了不同波長的光所致。溶液能選擇性地吸收某些波長的光，而讓其他波長的光透過，這時溶液呈現(xiàn)出透過光的顏色。透過光的顏色是溶液吸收光的互補色。

在光譜分析中，依據(jù)物質(zhì)對光的選擇性吸收而建立起來的分析方法稱為吸光光度法,主要有:

紅外吸收光譜：分子振動光譜，吸收光波長范圍2.51000m，主要用于有機化合物結(jié)構(gòu)鑒定。

紫外吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍200400nm（近紫外區(qū)），可用于結(jié)構(gòu)鑒定和定量分析。

可見吸收光譜：電子躍遷光譜，吸收光波長范圍400750nm，主要用于有色物質(zhì)的定量分析。紫外—可見光分光光度法是利用某些物質(zhì)的分子吸收200-800nm光譜區(qū)的輻射來進行分析測定的方法。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級間的躍遷，廣泛用于無機和有機物質(zhì)的定性和定量測定。

1、物質(zhì)內(nèi)部三種運動形式（1）電子相對于原子核的運動（2）原子核在其平衡位置附近的相對振動（3）分子本身繞其重心的轉(zhuǎn)動3.1基本原理3.1.1分子吸收光譜的形成分子三種不同能級：電子能級、振動能級和轉(zhuǎn)動能級三種能級都是量子化的，且各自具有相應(yīng)的能量分子內(nèi)能：電子能量Ee、振動能量Ev、轉(zhuǎn)動能量Er即E＝Ee+Ev+ErΔΕe>ΔΕv>ΔΕr2、能級躍遷

紫外-可見光譜屬于電子躍遷光譜。

電子能級間躍遷的同時總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)寬譜帶。（1）電子能級的能量差ΔEe較大1～20eV。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外—可見光區(qū)，紫外—可見光譜或分子的電子光譜；（2）分子振動能級的能量差（能級間隔）ΔEv約為：0.05～１eV，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；（3）轉(zhuǎn)動能級間的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠紅外區(qū)。遠紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜（4）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，是物質(zhì)定性的依據(jù)。（5）物質(zhì)對不同波長的光線具有不同的吸收能力，物質(zhì)也只能選擇吸收那些能量相當(dāng)于該分子能量（ΔΕe、ΔΕv、ΔΕr

）總和的輻射；（6）吸收譜帶強度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。3．有機化合物的紫外—可見光譜

有機化合物的紫外—可見吸收光譜，是其分子中外層價電子躍遷的結(jié)果（三種）：σ電子、π電子、n電子。

分子軌道理論：一個成鍵軌道必定有一個相應(yīng)的反鍵軌道。通常外層電子均處于分子軌道的基態(tài)，即成鍵軌道或非鍵軌道上。

外層電子吸收紫外或可見輻射后，就從基態(tài)向激發(fā)態(tài)(反鍵軌道)躍遷。主要有四種躍遷所需能量ΔΕ大小順序為：

n→π＊<π→π＊<n→σ＊<σ→σ＊

⑴σ→σ＊躍遷

所需能量最大，σ電子只有吸收遠紫外光的能量才能發(fā)生躍遷。飽和烷烴的分子吸收光譜出現(xiàn)在遠紫外區(qū)(吸收波長λ<200nm，只能被真空紫外分光光度計檢測到)。如甲烷的λ為125nm,乙烷λmax為135nm⑵n→σ＊躍遷

所需能量較大。吸收波長為150～250nm，大部分在遠紫外區(qū)，近紫外區(qū)仍不易觀察到。含非鍵電子的飽和烴衍生物(含N、O、S和鹵素等雜原子)均呈現(xiàn)n→σ*躍遷。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*躍遷的λ分別為173nm、183nm和227nm。⑶π→π＊躍遷

所需能量較小，吸收波長處于遠紫外區(qū)的近紫外端或近紫外區(qū)。孤立的π→π*躍遷一般在200nm左右，但具有共軛雙鍵的化合物，隨著共軛體系的延長，π→π＊躍遷的吸收帶將明顯向長波長方向移動，吸收強度也隨之增強。如乙烯的λ為162nm。⑷n→π＊躍遷

需能量最低，吸收波長λ>200nm。一般發(fā)生在近紫外區(qū)，吸收強度弱。分子中孤對電子和π鍵同時存在時發(fā)生n→π＊

躍遷。丙酮n→π＊躍遷的λ為275nm.4.常用術(shù)語（1）生色團：

最有用的紫外—可見光譜是由π→π＊和n→π＊躍遷產(chǎn)生的、能在紫外可見光范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收的集團。這兩種躍遷均要求有機物分子中含有不飽和基團。這類含有π鍵的不飽和基團稱為生色團。簡單的生色團由雙鍵或叁鍵體系組成，如乙烯基、羰基、亞硝基、偶氮基—N＝N—。（2）助色團：

有一些含有n電子的基團(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它們本身沒有生色功能(不能吸收λ>200nm的光)，但當(dāng)它們與生色團相連時，就會發(fā)生n—π共軛作用，增強生色團的生色能力(吸收波長向長波方向移動，且吸收強度增加)，這樣的基團稱為助色團。（3）紅移與藍移λmax向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為藍移(或紫移)。（4）增色效應(yīng)和減色效應(yīng)由于化合物結(jié)構(gòu)改變或其他原因，使吸收強度（摩爾吸光系數(shù)ε）增強，稱增色效應(yīng)；使吸收強度減弱，稱為減色效應(yīng)。有機化合物的吸收譜帶常常因引入取代基或改變?nèi)軇┦棺畲笪詹ㄩLλmax和吸收強度發(fā)生變化:3.1.2光吸收基本定律一、透射比和吸光度

當(dāng)一束平行的單色光照射均勻的有色溶液時，光的一部分被吸收，一部分透過溶液，一部分被比色皿的表面反射。如果入射光的強度為I0，吸收光的強度為Ia，透過光的強度為It，反射光的強度為Ir則:I0＝Ia＋It＋Ir

在吸光光度法中，由于采用同樣質(zhì)料的比色皿進行測量，反射光的強度基本上相同，其影響可以相互抵消，上式可簡化為:I0＝Ia＋It

透過光的強度It與入射光的強度Io之比稱為透光度或透光率，用T表示。

T＝It/Io溶液的透射比越大，表示它對光的吸收越?。环粗?，透射比越小，表示它對光的吸收越大。常用吸光度來表示物質(zhì)對光的吸收程度，吸光度A與透光度T的關(guān)系:A＝lg1/T=－lgT=lgIo/It二、朗伯—比耳定律1、朗伯定律布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。當(dāng)用適當(dāng)波長的單色光照射一固定濃度的溶液時，其吸光度與光透過的液層厚度呈正比，此即朗伯定律，其數(shù)學(xué)表達式為：A=k′lk′為比例系數(shù)，l為液層厚度（即樣品的光程長度）

朗伯定律適用于任何非散射的均勻介質(zhì)，但它不能闡明吸光度與溶液濃度的關(guān)系。例1.有一單色光通過厚度為1cm的有色溶液,其強度減弱20%。若通過5cm厚度的相同溶液,其強度減弱百分之幾?解：lgT1

l1

─────=───lgT25l1

lgT2=5lgT1=5×lg0.80=-0.485T2=32.7%,即減弱67.3%

2、比耳定律1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。當(dāng)用一適當(dāng)波長的單色光照射厚度一定的均勻溶液時，吸光度與溶液濃度呈正比，即：A=k″c式中：c為溶液濃度，k″為比例系數(shù)。例2.一符合比爾定律的有色溶液，當(dāng)濃度為c時，透射比為T，若其它條件不變，濃度為c/3時，T為_________，濃度為2c時，T為__________。

解:T1/3T2這說明濃度與透射比T

的是指數(shù)關(guān)系。

A＝lg（I0/It)=εbc

式中A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；

b：液層厚度(光程長度)，通常以cm為單位；

c：溶液的摩爾濃度，單位mol·L－１；

ε：摩爾吸光系數(shù)，單位L·mol－１·cm－１；

或:A＝lg（I0/It)=abc

c：溶液的濃度，單位g·L－１

a：吸光系數(shù)，單位L·g－１·cm－１

a與ε的關(guān)系為：

a=ε/M（M為摩爾質(zhì)量）3、朗伯—比耳定律透光度(透光率)T透過度T:描述入射光透過溶液的程度:

T=It/I0吸光度A與透光度T的關(guān)系:

A＝－lgT

朗伯—比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量；

摩爾吸光系數(shù)ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；吸光系數(shù)a(L·g-1·cm-1）相當(dāng)于濃度為1g/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。4、摩爾吸光系數(shù)ε的特征

（1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)；

（2）不隨濃度c和光程長度b的改變而改變。在溫度和波長等條件一定時，ε僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；

（3）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的ε值是不同的。在最大吸收波長λmax處的摩爾吸光系數(shù)，常以εmax表示。εmax表明了該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達到的最大靈敏度。

（4）可作為定性鑒定的參數(shù)；（5）εmax越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。ε>105：超高靈敏；

ε=(6～10）×104：高靈敏；

ε<2×104

：不靈敏。（6）ε在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。三、偏離朗伯—比耳定律的原因標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯—比耳定律的偏離。引起這種偏離的因素（兩大類）：（1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；（2）化學(xué)性因素，與樣品溶液有關(guān)。（1）物理性因素——難以獲得真正的純單色光

朗—比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯—比耳定律的正或負(fù)偏離。

為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸收曲線較平坦處。(2)化學(xué)性因素

朗伯—比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(c<10-2mol/L)時才基本符合。①朗伯—比耳定律只適用于稀溶液。②試液中各組分之間的相互作用。③試劑對吸收光譜的影響。④試樣為膠體、乳狀液或有懸浮物質(zhì)時的影響。

6.2紫外-可見分光光度計可見分光光度計紫外-可見分光光度計一、基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1.光源

在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。

可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范圍在320～2500nm。

紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射185～400nm的連續(xù)光譜。

2、單色器

將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。①入射狹縫：光源的光由此進入單色器；②準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；③色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵；

④聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至出射狹縫；⑤出射狹縫。光柵和棱鏡分光原理3.樣品室

樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。4.檢測器

利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。5.結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)數(shù)字顯示、微機進行儀器自動控制和結(jié)果處理。二、分光光度計的類型1.單光束經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶液，以進行吸光度的測定。適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描。2.雙光束雙光束分光光度計經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡分解為相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品池，還能自動消除光源強度變化所引起的誤差。3.雙波長雙波長分光光度計是由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光；利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值。對于多組分混合物、渾濁試樣分析，以及存在背景干擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。6.3顯色與測量條件的選擇

一、顯色反應(yīng)的選擇1.顯色反應(yīng)在無機分析中，很少利用金屬離子本身的顏色進行光度分析，因為它們的吸光系數(shù)值都比較小。一般都要選用適當(dāng)?shù)脑噭?，與待測離子反應(yīng)生成對紫外或可見光有較大吸收的物質(zhì)再進行測定。這種反應(yīng)稱為顯色反應(yīng)，所用的試劑稱為顯色劑。

①反應(yīng)的生成物必須在紫外，可見光區(qū)有較強的吸光能力，即摩爾吸光系數(shù)較大，反應(yīng)有較高的選擇性；②反應(yīng)生成物應(yīng)當(dāng)組成恒定、穩(wěn)定性好，顯色條件易于控制等，這樣才能保證測量結(jié)果有良好的重現(xiàn)性；③顯色劑在測定波長處無明顯吸收，顯色劑與有色配合物的最大吸收波長之差（對比度），要求△>60nm。2.選擇顯色反應(yīng)時，應(yīng)考慮的因素某些元素的氧化態(tài)，如Mn（Ⅶ）、Cr（Ⅵ）在紫外或可見光區(qū)能強烈吸收，可利用氧化還原反應(yīng)對待測離子進行顯色后測定。

例如：鋼中微量錳的測定，Mn2＋不能直接進行光度測定

2Mn2＋＋5S2O82-＋8H2O=2MnO4＋+10SO42-＋16H+將Mn2＋

氧化成紫紅色的MnO4＋后，在525nm處進行測定3.氧化還原顯色反應(yīng)4.顯色劑

無機顯色劑：硫氰酸鹽、鉬酸銨、過氧化氫等幾種。

有機顯色劑：種類繁多偶氮類顯色劑：本身是有色物質(zhì)，生成配合物后，顏色發(fā)生明顯變化；具有性質(zhì)穩(wěn)定、顯色反應(yīng)靈敏度高、選擇性好、對比度大等優(yōu)點，應(yīng)用最廣泛。偶氮胂Ⅲ、PAR三苯甲烷類：鉻天青S、二甲酚橙等1.顯色劑用量

吸光度A與顯色劑用量CR的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。2.顯色時間與溫度