焦磷酸光化測序技術的基本原理及運用,人類學論文

焦磷酸光化測序技術的基本原理及運用,人類學論文摘要：人類基因組計劃〔HumanGenomeProject,HGP〕不僅極大地提高了人類對基因組和相關遺傳信息的認識水平，而且促進了生命科學研究技術的發(fā)展和應用。正是在這樣的歷史背景下，焦磷酸光化測序技術〔pyrosequencing〕由瑞典研究人員發(fā)明。焦磷酸光化測序技術的基礎原理是基于通過合成測序原理進行酶促反響的DNA測序方式方法，通過基于釋放焦磷酸鹽時的鏈式反響的可見光檢測，即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低和相匹配的堿基數(shù)成正比。該技術可應用于DNA核苷酸序列和突變的檢測、單核苷酸多態(tài)性的基因型的鑒定，以及DNA甲基化水平變化的分析等。近年來，隨著攝影器材和成像技術的快速發(fā)展，這項技術的原理是基于通過酶促反響而實時檢測可見光，因而，有望在檢測的敏感性方面得到更進一步的發(fā)展。該文根據(jù)筆者在瑞典近三十年的工作經(jīng)歷體驗和積累的文獻，首先說明焦磷酸光化測序的基本原理，然后介紹該技術的應用，最后討論其發(fā)展前景。本文關鍵詞語：人類基因組計劃;焦磷酸光化測序;基因變異;基因型;DNA甲基化;Abstract：TheHumanGenomeProject〔HGP〕notonlygreatlyimprovedtheunderstandingofhumangenomeandrelatedgeneticinformation,butalsopromotedthedevelopmentoftechnologiesinlifescienceresearch.ItwasunderthishistoricalcontextthatpyrosequencingwasinventedbySwedishresearchers.PyrosequencingisamethodofDNAsequencingbasedonthesequencingbysynthesisprinciplewithenzymaticreactions,andreliesonlightdetectionbaseduponachainreactionwhenpyrophosphateisreleased.TheapplicationofthistechnologyinvolvedthedetectionofDNAnucleotidesequencesandmutations,theidentificationofgenotypesofsinglenucleotidepolymorphisms,theanalysisofchangesinDNAmethylationlevelsetc.Withtherecentrapiddevelopmentofphotographicequipmentandimagingtechnology,thistechnologyisexpectedtohaveanincreasingsensitivityinsignaldetection.BasedupontheworkingexperiencesinSwedenfornearly30yearsandaccumulatedliterature,thisreviewfirstclarifiedthebasicprinciplesofpyrosequencing,thenintroducedtheapplicationsofthistechnology,andfinallydiscusseditsdevelopmentprospectsinthenearfuture.Keyword：HumanGenomeProject;pyrosequencing;geneticvariation;genotype;DNAmethylation;1、引言本世紀是生命科學的世紀。生命科學是研究生命現(xiàn)象，揭示生命活動規(guī)律和本質的一門學科。在本世紀所有的生命科學研究活動中，規(guī)模最大、發(fā)展最快和影響最廣的科研項目是人類基因組計劃(HumanGenomeProject,HGP)。HGP旨在測定人類染色體(指單倍體)中所包含的60億(3000厘摩根，cM,centi-Morgen，參見講明)對核苷酸序列，繪制出載有完好基因及其序列生物學信息的人類基因組圖譜，為破譯人類遺傳信息，深切進入開展疾病分子病理學研究和提高人類健康水平服務[1]。人類基因圖譜早期包括物理圖譜和遺傳圖譜，前者主要將序列標簽位點在染色體的絕對位置上進行線性排列，而后者主要根據(jù)遺傳學連鎖和重組的關系確定序列標簽位點在染色體的相對位置。HGP于1990年正式啟動，作為人類基因組組織(HumanGenomeOrganisation,HUGO)成員之一，作者有幸參加了早期基因圖譜制備的科研工作。至1994年9月，物理圖譜和遺傳圖譜已經(jīng)完成，基因組標簽分辨率為1cM(即1%重組率)，為全基因組測序奠定了基礎，從此HGP進入了大規(guī)模測序階段。1953年，英國劍橋大學科研技術工程師FrancisCrick和來自美國的JamesWaston博士共同發(fā)現(xiàn)了DNA雙螺旋構造以及相關基本特性[2]，鑒于他們在生命科學研究中的重大奉獻，這兩位科學家共享了1962年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。DNA堿基排列順序中存在生物的遺傳信息，測定其序列尤為重要。1977年，英國的生化學家FrederickSanger發(fā)明了雙脫氧鏈終止法測定DNA核苷酸序列，這項技術的原理是通過使用類似于正常dNTP的2,3-雙脫氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，將延伸的DNA鏈特異性地終止。整個反響體系包括單鏈模板、引物、DNA聚合酶和4種dNTP。待測定樣本共分四組，每組按一定比例參加一種ddNTP，在引物與模板互補和延伸的經(jīng)過中，它能隨機摻入合成的DNA鏈，一旦摻入合成即終止，于是構成各種不同大小的片段，其末端核苷酸必定為該種核苷酸，再通過電泳分離能夠讀取DNA的核苷酸序列。這項技術以其姓氏Sanger命名而沿用至今，盡管DNA片段的分離方式方法已改良為毛細管電泳法，標記系統(tǒng)也從放射自顯影轉化為熒光素標記，人工讀序的實驗程序已成為全自動測序技術，但基本原理沒有改變[3]。Sanger博士在1958年因發(fā)現(xiàn)胰島素的氨基酸序列而獲得諾貝爾化學獎，而于1980年因發(fā)明雙脫氧鏈終止法測定DNA核苷酸序列的技術而再次獲得諾貝爾化學獎。因而，他像居里夫人那樣，成為兩次獲得諾貝爾獎的科學家。1994年，HGP進入了大規(guī)模測序階段的關鍵時刻，迫切需要速度更快、原理更先進的測定DNA核苷酸序列的技術。正是在這樣的歷史背景下，瑞典烏普薩拉大學和斯德哥爾摩皇家理工學院兩個科研小組分別開場研發(fā)DNA核苷酸序列測定自動化和新型DNA焦磷酸光化測序法，其目的是為人類基因組DNA大規(guī)模序列檢測服務。然而，科學研究有時會出現(xiàn)正打歪著的現(xiàn)象，這兩個科研小組最終都沒有到達預期的目的。但是，前者相繼開發(fā)出墊鎖式探針(padlockprobe)[4]、滾環(huán)DNA擴增技術(rollingcircleamplification)[5]、鄰位接合技術(proximityligationassay,PLA)[6]和鄰位接合延伸(proximityextensionassay,PEA)[7]等一系列先進的核苷酸和蛋白質檢測技術,而后者發(fā)明了焦磷酸光化測序技術(pyrosequencing)。本文首先介紹焦磷酸光化測序技術的基本原理，然后說明這項技術的應用范疇，最后討論其發(fā)展前景。2、焦磷酸光化測序技術的基本原理1993年，瑞典科研人員BertilPettersson、MathiasUhle和P?lNyren根據(jù)固相測序的基本方式方法，使用鏈霉抗生物素蛋白(strepavidin)包被的磁珠黏附待測序的生物素(biontin)標記的單鏈DNA，然后添加三種酶(DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和熒光素酶)和核苷酸(dNTP)的混合物，通過摻入核苷酸產(chǎn)生的焦磷酸來測量發(fā)射的光。光的強度決定能否已摻入一個或更多個核苷酸，因而，能夠檢測模板鏈上存在多少個互補核苷酸以及哪一種核苷酸。把四種核苷酸逐一參加重復該經(jīng)過，就能夠確定單鏈模板的DNA序列，這是焦磷酸光化測序法發(fā)展的初級階段[8]。1998年，MostafaRonaghi、MathiasUhle和P?lNyren通過參加腺苷三磷酸雙磷酸酶(Apyrase)去除未被DNA聚合酶摻入的核苷酸和殘留的少量ATP，使得整個技術程序愈加完善，四種酶即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶的混合物在整個經(jīng)過中保持化學反響，進而合適于儀器自動化檢測。他們的科研論文在Science上發(fā)表，標志著pyrosequencing正式進入實際應用階段[9]。次年，德國凱基(Qiagen)公司基于這項技術的原理將焦磷酸光化測序儀推向市場。當前，在中國無論是在百度等網(wǎng)絡上，還是科研論文中，關于pyrose-quencing的中文翻譯主要是焦磷酸測序，這個專有名詞的中文翻譯既不全面也不準確，不符合信達雅的要求。因而，根據(jù)這項實驗技術的基本原理，作者建議pyrosequencing正確的中文譯名應當為焦磷酸光化測序法，由于焦磷酸發(fā)出的可見光才是這項技術的本質和亮點。焦磷酸光化測序法主要基于四種酶的酶促反響。根據(jù)圖1所示，pyrosequencing的基本原理是以單鏈DNA(ssDNA)為模板，首先與以待測DNA核苷酸序列而設計的特異性引物雜交，并與DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和腺苷三磷酸雙磷酸酶以及底物腺苷5-磷酰硫酸鹽(adenosine-5-phosphosulfat,APS)一起孵育。分別添加四種脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)(注意不是雙脫氧的ddNTPs，與FrederickSanger博士發(fā)明了雙脫氧鏈終止法有根本的區(qū)別)。DNA聚合酶每將正確互補的一個dNTP整合到模板上，摻入互補的新鏈就釋放一個焦磷酸鹽(PPi)。未摻入的核苷酸和ATP被腺苷三磷酸雙磷酸酶降解，并且反響能夠用另一種核苷酸重新開場。ATP硫酸化酶在腺苷5磷酸硫酸鹽存在下將PPi轉化為ATP。該ATP充當熒光素酶介導熒光素轉化為氧化熒光素的底物，進而產(chǎn)生可見光。這個光的強度與ATP的量成比例，通過照相機檢測熒光素酶催化的反響中產(chǎn)生的光測定在程序中分析相對應的DNA核苷酸序列。該技術不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行標記和染色，具有大通量、低成本、快速、直觀的特點。與Sanger測序法相比，焦磷酸光化測序技術有其特定的優(yōu)勢，已經(jīng)成為DNA分析研究的重要手段。圖1焦磷酸光化測序法的基本原理焦磷酸光化測序公司(PyrosequencingAB)位于瑞典烏普薩拉市，由HealthCap風險投資公司支持而成立，目的是使焦磷酸光化測序技術的儀器和實驗試劑盒商業(yè)化。1999年，該公司在斯德哥爾摩證券交易所上市，2003年更名為Biotage公司。焦磷酸光化測序業(yè)務線于2008年被德國凱基(Qiagen)收購。該公司先后推出PyroQ96、Pyro24h和Pyro48儀器，當前，在中國市場上可購買到Pyro48儀器。焦磷酸光化測序法已經(jīng)在基因組學、分子遺傳學、表觀遺傳學、臨床分子診斷、細菌與病毒分型及法醫(yī)鑒定等方面得到廣泛的應用。近年來，焦磷酸光化測序技術進一步被受權給454生命科學公司，旨在開發(fā)基于陣列的焦磷酸測序技術，該技術作為大規(guī)模DNA測序的平臺出現(xiàn)，包括基因組測序和宏基因組學[10]。3、焦磷酸光化測序技術的應用開發(fā)焦磷酸光化測序技術的初衷是為了大規(guī)模測定DNA核苷酸序列而服務的，但是，令人尷尬的是由于這項技術的基本原理是通過酶化學反響而產(chǎn)生可見光來檢測實時互補的核苷酸，而酶化學反響的代謝產(chǎn)物不可避免地會改變反響條件，因而，當焦磷酸光化測序反響到達150～400個堿基，整個實驗由于準確性和敏感性的要求不得不停止。除此之外，該技術檢測三個或者三個以上重復序列有困難，譬如根據(jù)光的峰值難以鑒別是GG，還是GGG，或者是AAA，還是AAAA。正當焦磷酸光化測序技術應可用之處于困惑的困難時刻，HGP開場施行單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)圖譜研究，SNP分析并不需要很長的序列，能夠采用焦磷酸光化測序法技術來檢測基因型。更為重要的是，2006年，AndrewZ.Fire和CraigC.Mello因發(fā)現(xiàn)小RNA干擾和基因沉默技術而獲得了諾貝爾生理學或醫(yī)學獎，極大地促進了與小RNA，如RNAi和miRNA等相關的研究[11]。小RNA片段的序列僅有20多個核苷酸，而焦磷酸光化測序法技術完全能夠知足小RNA序列的檢測。因而，能夠講小RNA的科研工作給了焦磷酸光化測序技術起死回生的發(fā)展時機。焦磷酸光化測序技術的應用主要牽涉分子遺傳學和表觀遺傳學領域，下面就焦磷酸光化測序技術的應用問題分三個方面敘述。3.1、遺傳基因突變的檢測基因突變(genemutation)是指基因在構造上發(fā)生堿基對組成或者排列的改變。基因突變可分為兩種主要方式：一種是遺傳性突變，是從父母遺傳的，并且在人的一生中幾乎存在于身體的每個細胞中。另一種是獲得性(或體細胞)突變，發(fā)生在人的一生中的某個時間，并且僅存在于某些細胞中，而不存在于身體的每個細胞中。這些變化可能是由環(huán)境因素引起的，例如來自太陽的紫外線輻射，或者由于DNA在細胞分裂經(jīng)過中本身復制發(fā)生錯誤而發(fā)生的。體細胞獲得的突變一般不能傳遞給下一代。人體具有DNA損傷修復等機制，可通過將突變序列恢復到原始狀態(tài)來預防或糾正突變。但是，假如沒有能夠修復，就會導致人體機能發(fā)生障礙，產(chǎn)生疾病。所有的癌癥都是由于癌細胞基因組DNA序列發(fā)生改變而產(chǎn)生的。過去我們已經(jīng)對基因突變在癌癥的病理發(fā)生中的作用有所了解。然而，我們如今正進入一個能夠獲得大量癌癥基因組的完好DNA序列的時代。這些研究將為我們提供一個具體和全面的視角，了解個體癌癥是怎樣發(fā)展的[12]。譬如，現(xiàn)有的研究資料表示清楚，人群中約有12%的女性在其一生中的某個時候會患上乳腺癌。攜帶有BRCA1或BRCA2基因突變的女性，患乳腺癌的風險大大增加，可達70%[13,14]。盡管每年進行磁共振成像(MRI)和乳腺X線攝影篩查有助于早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌，但通過檢測基因突變能夠早期和準確地診斷乳腺癌，為提高人民的健康水平服務。檢測基因突變的最直接有效的方式方法就是DNA序列檢測。我們知道當前有很多種分析DNA序列的技術，譬如前面所提及的Sanger雙脫氧鏈終止法就是最常用的DNA序列檢測技術的基本原理。盡管獲得了相當大的進展，DNA測序仍然有些耗時和昂貴，需要三個獨立的步驟從模板生成測序產(chǎn)物：擴增目的序列、純化擴增產(chǎn)物，以及測序反響。常規(guī)的方式方法是將PCR擴增和循環(huán)測序結合成一個單一的反響，進而實現(xiàn)基因組DNA的直接測序。以大染料測序試劑(應用生物系統(tǒng))為載體，參加不同量的正、反向引物、脫氧核苷酸三磷酸(dNTPs)和輸入DNA，建立了聯(lián)合擴增和測序反響。反響被熱循環(huán)35～45個周期，然后用毛細管電泳對產(chǎn)物進行分析，以檢測測序產(chǎn)物。人們利用這項技術進行了多種測序應用，包括鑒定基因的種系突變/多態(tài)性，對腫瘤DNA進行測序以鑒定靶基因的體細胞突變等[15]。與常規(guī)的Sanger測序技術相比，焦磷酸光化測序法盡管在測序閱讀長度具有約400個堿基的上限，但它更具有定量優(yōu)異的檢測限，能夠快速準確定量地檢測小片段DNA序列變異，假如揚長避短地采用焦磷酸光化測序法技術，能夠使得整個實驗具有很高的性價比。3.2、SNP等位基因分型的簽定單核苷酸多態(tài)性(SNP)是在DNA特定位置發(fā)生的單個核苷酸置換，是最常見的遺傳變異類型。在人類基因組中，每1000個核苷酸能夠出現(xiàn)一次或者屢次，這意味著一個人的基因組中大約有400萬～500萬個SNP。這些遺傳變異具有特異性，在世界各地的人群中已發(fā)現(xiàn)超過1億個SNP。更重要的是，SNP能夠作為生物標志物，有助于科學家找到與復雜性疾病，如高血壓、糖尿病和腫瘤等相關的易感基因或者拮抗基因。當SNP發(fā)生在基因內或基因附近的調控區(qū)域內時，它們可能通過影響基因的功能在疾病中發(fā)揮病理性作用，可以能引起個體對某些藥物或者環(huán)境的不同反響。因而，鑒定SNP等位基因型是分子遺傳學、遺傳病理學和遺傳藥理學等學科最常用的實驗技術。SNP通常由兩個等位基因組成，可以能由三個等位基因組成。圖2表示清楚在人類基因組中可能出現(xiàn)的各種SNP，圖中歸納了所有SNP的代碼均是由美國生物化學學會設計和命名的，最常見的SNP是Y=C/T。全世界科學家發(fā)現(xiàn)的人類基因組中所有的SNP圖譜都匯總記錄在SNP數(shù)據(jù)庫，如dbSNP()，這些數(shù)據(jù)庫作為人類的共同信息資料，可公開免費使用。當前，世界上有很多種技術能夠用于SNP基因型等位基因分型，這些技術的設計一般是為了分析SNP兩個等位基因特有的核苷酸。但是，焦磷酸光化測序法與它們不同，具有獨特的技術原理和優(yōu)勢，不僅能夠分析由兩個等位基因組成的SNP，而且能夠鑒定用其他技術無法分析的由三個等位基因組成的SNP，還能夠發(fā)現(xiàn)已鑒定SNP的周邊有沒有其他DNA變異。作者所在的實驗室曾用動態(tài)等位基因特異性雜交技術(dynamicallelespecifichybridisation,DASH)研究ICAM-1(intercellularcelladhesionmolecule-1,即細胞間黏附分子-1)基因與糖尿病和糖尿病腎病的關聯(lián)性[16,17]。該基因有一個非同義的單核苷酸多態(tài)性，由19號染色體10285007位的E(Glu)密碼子GAG和K(Lys)密碼子AAG之間的替換引起(ContigIDNT＿011295.12,GRCCH38.p7)。結果表示清楚，在瑞典人群體，這個SNP多態(tài)性基因型分布中的雜合子頻率很高，Kristiansen等[18]和Nishimura等[19]兩個科研小組盡管都發(fā)表了這個SNP丹麥與和日本人1型糖尿病相關聯(lián)的文章，但是前者在論文中沒有表示清楚其基因型的分布結果。通過與作者溝通原始實驗結果，這個SNP多態(tài)性基因型分布中的雜合子頻率在所研究的人群中都很高。一般來講，基因型分布中的高雜合子頻率可能是由于基因分型的技術限制或基因組重復(genomeduplicon)所造成[20]。為了驗證實驗的準確性，避免錯誤結果的發(fā)生，我們有必要用另一種基因分型原理不同的技術，即焦磷酸光化測序法重復基因分型實驗。最終的實驗結果表示清楚，這個SNP高雜合子頻率的現(xiàn)象在瑞典、丹麥、日本和馬來西亞的人群體中存在[18,19,21,22,23]。這個詳細的實驗充分講明焦磷酸光化測序法獨特的技術原理能夠用于基因分型驗證等類似的實驗研究。圖2人類基因組中單核苷酸多態(tài)性的類型和代碼3.3、DNA甲基化水平的分析表觀遺傳學(epigenetics)主要研究基于DNA序列未發(fā)生改變而基因的功能和特性發(fā)生異常變化，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑和非編碼RNA調控等。在人類基因組中，DNA甲基化發(fā)生在體細胞中DNA兩條鏈上的胞嘧啶(5mecytosine)環(huán)的5-位(CpG)，通常DNA甲基化以CpG島的形式在基因的啟動子或者其他區(qū)域出現(xiàn)?，F(xiàn)有的資料表示清楚，DNA甲基化的異常變化形式與生長發(fā)育、環(huán)境影響以及腫瘤等復雜性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關。因而，分析DNA甲基化水平的變化已經(jīng)成為表觀遺傳學實驗研究的主要內容之一。近年來，已經(jīng)開發(fā)了多種用于DNA甲基化研究的技術。但是，相比擬而言，焦磷酸光化測序法是一種實時DNA合成測序方式方法，通過酶促級聯(lián)反響能夠定量將核苷酸摻入時釋放的焦磷酸轉化為光信號，因而非常適用于亞硫酸氫鹽(bisulfite)處理后的DNA甲基化分析。如此圖3所示，應用焦磷酸光化測序法進行DNA甲基化分析的整個實驗程序包括兩個部分。第一部分，將待檢測的DNA樣本用亞硫酸氫鹽處理，使得未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶(uracil)，而待檢測甲基化的胞嘧啶(5mecytosine)保持原樣不變。第二部分，通過特異性引物和PCR擴增制備DNA模板，在亞硫酸氫鹽處理和PCR之后，DNA模板序列中每個CpG位置的每個甲基化程度由T和C的比率確定，此刻用焦磷酸光化測序法就完全能夠量化分析發(fā)生甲基化的胞嘧啶水平。作者所在實驗室的工作實踐表示清楚，無論某基因DNA甲基化水平較低還是很高,采用焦磷酸光化測序法分析這些靶基因DNA甲基化水平的變化，都能夠獲得很好的結果。譬如，近期的研究表示清楚，溶質載體家族30成員8(solutecarrierfamily30member8,SLC30A8)是2型糖尿病易感基因[24,25]，我們用焦磷酸光化測序法研究馬來西亞2型糖尿病患者中該基因DNA甲基化水平的變化，結果表示清楚SLC30A8基因啟動子上六個CpG位點平均基因甲基化水平高達約80%，顯著高于非糖尿病對照組[26]。胰島素樣生長因子結合蛋白7(insulin-likegrowthfactor-bindingprotein7,IGFBP7)基因DNA甲基化水平較低(約15%)。我們分析該基因DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)該基因甲基化水平在男性2型糖尿病患者中明顯高于非糖尿病對照組，但在女性2型糖尿病和非糖尿病人群中未發(fā)現(xiàn)顯著性差異。IGFBP7在胰島素抵抗的表觀遺傳學作用方面具有性別差異[27]。在人類基因組中，LINE-1(longinterspersednucleotideelement-1)在人類基因組中廣泛分布，近期，我們采用PyroQ96儀和焦磷酸光化測序法分析了英國2型糖尿病患者在14年隨訪期間基因組DNA中LINE-1DNA上4個CpG的變化，結果表示清楚整個基因組DNALINE-1甲基化平均水平為76%，在女性2型糖尿病患者中，LINE-1DNA甲基化水平的變化與舒張壓、腎小球濾過率和膽固醇高密度脂蛋白比值等代謝標記物之間顯著負相關[28]。圖3焦磷酸光化測序法DNA甲基化水平的實驗程序把上述三個研究實例總結起來能夠表示清楚，用焦磷酸光化測序法分析DNA甲基化水平具有下面優(yōu)點：(1)該技術能夠直接定量測定甲基化的胞嘧啶；(2)通過DNA樣本亞硫酸氫鹽的處理，能夠使所有檢測DNA甲基化統(tǒng)一定量而保證準確性；(3)將與甲基化的胞嘧啶互相補的核苷酸摻入時釋放的焦磷酸轉化為光信號檢測，具有較高的敏感性。因而，焦磷酸光化測序法已經(jīng)被以為是DNA甲基化分析的金標準實驗方式方法。4、焦磷酸光化測序技術的發(fā)展前景生命科學研究技術的發(fā)展不是孤立的，而是與工業(yè)革命帶來的新技術相鋪相成共同發(fā)展的。從過去的幾十年到將來的十年，工業(yè)革命在計算機技術、數(shù)字化照相和成像技術以及5-G通訊技術等方面，肯定會給當代人類生活和生命科學研究帶來很大的改變。正如前面所言，焦磷酸光化測序法技術的本質和亮點是產(chǎn)生焦磷酸而發(fā)出的可見光。因而，數(shù)字化照相和成像的進步，計算機分析能力的提高，5-G通訊技術的快速，都有可能促進焦磷酸光化測序技術的改良和新的發(fā)展。作者以為主要有兩個可能性：第一個是通過檢測系統(tǒng)的敏感性的提高，極大地提高對焦磷酸所產(chǎn)生的可見光的捕獲和量化分析，這樣就有可能只要少量的DNA模板，甚至不需要PCR擴增而直接對于DNA樣本進行焦磷酸光化測序法測序。假如能夠到達這個水平，那整個實驗流程不僅能夠節(jié)約至少一半的費用，而且可能避免由于PCR擴增出現(xiàn)的誤差和人工合成DNA對環(huán)境的污染。第二個是通過檢測系統(tǒng)敏感性和分辨率的提高，使得焦磷酸光化測序法能夠分析模板DNA序列中三個或者三個以上重復序列，譬如GGG或者AAAA等，進而克制了該技術原有的缺陷?？傊?，在不久的將來，焦磷酸光化測序法很可能從諸多的DNA檢測技術中脫穎而出，成為一機多用、快速簡便和準確有效的生命科學技術。講明：厘摩根cM(centi-Morgan)是遺傳學上確定基因重組頻率的測量單位,是由美國遺傳學家AlfredHenrySturtevant為了紀念他的教師，著名的遺傳學家ThomasHuntMorgan而建立的。1個cM定義為重組頻率100次中發(fā)生1次。假如兩個基因間相距1個cM，那么其后代與父母相比，有1%的個體具有不同的等位基因頻率。假如相距50cM，就意味著這兩個基因是不連鎖的，很有可能是位于不同的染色體上。對于人類基因組而言，1cM平均代表7.5105bp的距離。以下為參考文獻[1]GreenED,WatsonJD,CollinsFS.HumanGenomeProject:twenty-fiveyearsofbigbiology.Nature,2021,526:29-31[2]WatsonJD,CrickFH.Molecularstructureofnucleicacids:astructurefordeoxyribosenucleicacid.AmJPsychiatry,2003,160:623-4[3]SangerF.DeterminationofnucleotidesequencesinDNA.BiosciRep,2004,24:237-53[4]NilssonM,MalmgrenH,SamiotakiM,etal.Padlockprobes:circularizingoligonucleotidesforlocalizedDNAdetection.Science,1994,265:2085-8[5]LarssonC,KochJ,NygrenA,etal.InsitugenotypingindividualDNAmoleculesbytarget-primedrolling-circleamplificationofpadlockprobes.NatMethods,2004,1:227-32[6]FredrikssonS,GullbergM,JarviusJ,etal.Proteindetectionusingproximity-dependentDNAligationassays.NatBiotechnol,2002,20:473-7[7]AssarssonE,LundbergM,HolmquistG,etal.Homogenous96-plexPEAimmunoassayexhibitinghighsensitivity,specificity,andexcellentscalability.PLoSOne,2020,9:e95192[8]NyrnP,PetterssonB,UhlnM.SolidphaseDNAminisequencingbyanenzymaticluminometricinorganicpyrophosphatedetectionassay.AnalBiochem,1993,208:171-5[9]RonaghiM,UhlnM,NyrnP.Asequencingmethodbasedonreal-timepyrophosphate.Science,1998,281:363,365[10]MarguliesM,EgholmM,AltmanWE,etal.Genomesequencinginmicrofabricatedhigh-densitypicolitrereactors.Nature,2005,437:376-80[11]FireAZ.Genesilencingbydouble-strandedRNA.CellDeathDiffer,2007,14:1998-2020[12]StrattonMR,CampbellPJ,FutrealPA.Thecancergenome.Nature,2018,458:719-24[13]KotsopoulosJ.BRCAmutationsandbreastcancerprevention.Cancers(Basel),2021,10:E524[14]NarodSA,SalmenaL.BRCA1andBRCA2mutationsandbreastcancer.DiscovMed,2018,12:445-53[15]MurphyKM,BergKD,EshlemanJR.SequencingofgenomicDNAbycombinedamplificationandcyclesequencingreaction.ClinChem,2005,51:35-9[16]HowellWM,JobsM,GyllenstenU,etal.Dynamicallelespecifichybridization.Anewmethodforscoringsinglenucleotidepolymorphisms.NatBiotechnol,1999,17:87-8[17]PrinceJA,FeukL,HowellWM,etal.Robustandaccuratesinglenucleotidepolymorphismgenotypingbydynamicallele-specifichybridization(DASH):designcriteriaandassayvalidation.GenomeRes,2001,11:152-6[18]KristiansenOP,Nols?eRL,HolstH,etal.Theintercellularadhesionmolecule-1K469Epolymorphismintype1diabetes.Immunogenetics,2000,52:107-11[19]NishimuraM,ObayashiH,MaruyaE,etal.Associationbetweentype1diabetesage-at-onsetandintercellularadhesionmolecule-1(ICAM-1)genepolymorphism.HumImmunol,2000,61:507-10[20]Marques-BonetT,EichlerEE.Theevolutionofhumansegmentalduplicationsandthecoredupliconhypothesis.ColdSpringHarbSympQuantBiol,2018,74:355-62[21]MaJ,M?llstenA,PrznyM,etal.Geneticin?uenceso