生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1實(shí)驗(yàn)02-1油菜籽中不飽和脂肪酸的分離

(反相紙層析法)2棕櫚、大豆、油菜和向日葵是世界范圍內(nèi)最重要的四大油料作物。脂肪酸分為飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，其中不飽和脂肪酸又分成單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸兩種。哺乳動(dòng)物本身不能合成亞油酸（18:2

）、亞麻酸（18:3

）和花生四烯酸（20:4），必須從食物中獲得，因此也稱為“必須脂肪酸”。3乙酰CoA脂肪酸合成16:0逐級(jí)羧化18:0軟脂酸硬脂酸18:0硬脂酸20:022:0花生酸22:1Δ13山崳酸24:0木蠟酸芥酸18:1Δ9油酸18:2Δ9,12亞油酸18:3Δ9,12,15α—亞麻酸18:3Δ6,9,12γ—亞麻酸20:4Δ5,8,11,14廿碳烯酸（花生四烯酸，ARA）雙低油菜：低芥酸和低硫甙×4一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康某醪秸莆沼眉垖游龇y(cè)定油菜籽中脂肪酸的組成的方法二、原理在紙層析中，通常支持相是含水的，移動(dòng)相是有機(jī)溶劑。脂肪酸用有機(jī)介質(zhì)為支持相，以含水溶劑為移動(dòng)相，也就是所謂“反相紙層析法”。5由于不同的脂肪酸在兩相中的分配系數(shù)不同，在層析濾紙上移動(dòng)速率就有差異，最后使混合脂肪酸的各組分被分開(kāi)。然后用醋酸銅處理，將脂肪酸轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的銅鹽，再用紅氨酸顯色，即可得到藍(lán)灰色點(diǎn)狀層析圖譜。6藍(lán)灰色復(fù)合物7三、材料、設(shè)備與試劑（一）實(shí)驗(yàn)材料：油菜籽（二）設(shè)備：1.層析紙；2.層析缸；3.層析架；4.顯色盤(pán)；5.電吹風(fēng)；6.微量進(jìn)樣器或毛細(xì)管。8（三）試劑5%KOH-CH3OH溶液2.10%液體石蠟-石油醚溶液3.95%醋酸溶液4.1%醋酸銅溶液5.0.03%紅氨酸(二硫代草酰胺)溶液6.1mol/LHCl7.石油醚9四、實(shí)驗(yàn)步驟(一)樣品制備磨樣：將1克干燥的油菜種子放在研缽中研磨成粉狀，倒入磨口試管中加入1mLKOH-CH3OH溶液，25℃～30℃條件下放置6～8小時(shí)（酯化）。加入1mL1mol/LHCl及1mL石油醚。10(二)點(diǎn)樣在經(jīng)石臘油處理并晾干的層析紙一端1.5～

2cm處用鉛筆輕輕劃一直線，每隔3cm用鉛筆輕輕點(diǎn)一記號(hào)并編號(hào)。在層析紙各編號(hào)處，用毛細(xì)管取樣品上清液0.01mL，按編號(hào)順序滴入點(diǎn)樣處（每個(gè)點(diǎn)重復(fù)點(diǎn)樣2～

3）。11(三)展開(kāi)溶劑系統(tǒng)與條件將點(diǎn)好樣的層析紙固定，編號(hào)端朝下放入盛有醋酸溶液的層析缸中，醋酸溶液的多少以能浸泡層析紙但液面低于點(diǎn)樣處為宜。至展層劑上升到距濾紙頂端2/3處為止，取出層析紙，吹干。12(四)顯色將吹干的層析紙放入醋酸銅溶液中浸泡約20-30秒，使之生成脂肪酸銅鹽。用清水沖洗，再放入潔凈的瓷盤(pán)中，用流水漂洗20分鐘以上。將層析紙小心取出，放置在潔凈的吸水紙上，用電吹風(fēng)吹干。將吹干的層析紙?jiān)诩t氨酸溶液中一帶而過(guò)，層析分離后的脂肪酸立即顯出藍(lán)灰色的斑點(diǎn)。13五.結(jié)果分析根據(jù)紙層析色譜上的斑點(diǎn)位置標(biāo)出5種不飽和脂肪酸。圖譜中的順序由下而上為：芥酸、廿碳烯酸、油酸、亞油酸、亞麻酸。六、分析討論根據(jù)結(jié)果比較不同油菜種子中芥酸含量的高低。14亞麻酸亞油酸油酸廿碳烯酸芥酸15實(shí)驗(yàn)02-2油菜籽中硫代葡萄糖甙總量的快速測(cè)定(葡萄糖試紙法)

硫代葡萄糖甙（簡(jiǎn)稱硫甙）是廣泛存在于十字花科植物中的一種含硫化合物，其結(jié)構(gòu)同時(shí)如下：16

在植物體內(nèi)硫代葡萄糖甙葡萄糖水解酶的作用下，會(huì)分解產(chǎn)生異硫氰酸酯、噁唑烷硫酮、腈等劇毒物質(zhì)，是影響油菜籽綜合利用的重要限制因素?！半p低油菜”指的就是“低芥酸、低硫甙”?？焖贉y(cè)定油菜籽中硫代葡萄糖甙的含量，對(duì)于選育、篩選“雙低”油菜具有重要意義。17一實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆湛焖贉y(cè)定油菜籽中硫甙的總量原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理十字花科植物種子種含有硫甙和分解硫甙的硫甙酶，將油料種子經(jīng)破碎后，加入適量的水，硫甙酶便可促使硫甙水解，每分子的硫甙經(jīng)水解后產(chǎn)生一分子的葡萄糖，用葡萄糖試紙便可快速檢測(cè)水解液中葡萄糖的含量，根據(jù)葡萄糖與硫甙的定量關(guān)系便可知待測(cè)樣品中硫甙總量的高低。18固定化酶：尿糖試紙：葡萄糖在葡萄糖氧化酶的催化作用下形成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，過(guò)氧化氫在過(guò)氧化氫酶的催化作用下形成水和原子氧，原子氧可以將某種無(wú)色的化合物氧化成有色的化合物，將上述兩種酶和無(wú)色化合物固定在紙條上，制成測(cè)試尿糖含量的酶試紙。19三、材料、儀器設(shè)備及試劑（一）材料油菜種子（高硫甙、低硫甙品種）（二）儀器設(shè)備

1.點(diǎn)滴板2.玻棒3.滴管（三）試劑1.蒸餾水2.葡萄糖試紙20四、實(shí)驗(yàn)步驟分別取高硫苷、低硫苷油菜種子5-10粒放入點(diǎn)滴板中，用滴管各加入3～5滴蒸餾水，用玻棒搗碎后攪勻，將葡萄糖試紙浸入被測(cè)液中，3～

5min后，將試紙取出并與標(biāo)準(zhǔn)色階進(jìn)行比較。21五、結(jié)果分析記錄不同油菜種子中試紙與標(biāo)準(zhǔn)色階進(jìn)行比較的結(jié)果。六、分析討論根據(jù)結(jié)果，比較不同油菜種子中硫甙含量的高低。22實(shí)驗(yàn)03

植物組織中還原糖含量的測(cè)定

（斐林試劑比色法）23脫色的程度與溶液中還原性糖含量成正比關(guān)系。在590nm波長(zhǎng)下比色測(cè)定吸光度，根據(jù)吸光度的減少值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出所測(cè)樣品中還原糖的含量。一、原理植物組織中的可溶性糖可分為還原糖（主要是葡萄糖和果糖）和非還原糖（主要是蔗糖）兩類。還原糖具有自由的醛基和酮基，具有還原性。在堿性、加熱條件下，還原基團(tuán)能把斐林試劑中CuSO4的Cu2＋還原成Cu＋，生成Cu2O紅色沉淀，藍(lán)色的斐林試劑溶液因失出部分Cu2＋而脫色。24

材料：新鮮植物葉片

儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、分析天平、低速離心機(jī)、水浴鍋等

試劑：

1.斐林試劑A液：40gCuSO4·5H2O溶解于蒸餾水定容至1.0L。

2.斐林試劑B液：200g酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·5H2O）與150gNaOH溶于蒸餾水中，并定容至1.0L。

A、B兩液分別貯存，使用前按1：1體積混合。

（已配好）二、材料、儀器設(shè)備及試劑

25

0.1％葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液

烘干的純葡萄糖100.00mg，加蒸餾水溶解定容至100ml

濃度：1.00mg/ml

（已配好）斐林試劑（藍(lán)色）Cu2O磚紅色不溶于水26三、實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取5支試管編號(hào)，按下表分別加入各試劑。項(xiàng)目123451.標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（ml）0.002.004.006.00樣品液

6ml2.H2O(ml)6.004.002.000.000.00每管葡萄糖含量(mg)0.002.004.006.00

待測(cè)3.斐林試劑量(ml)4.004.004.004.004.00

A590值A(chǔ)1A2A3A4A5

吸光值差值(ΔA590

)A1-A1A1-A2A1-A3A1-A4A1-A527處理方法：

加斐林試劑后搖勻，加蓋沸水浴中15min，自然冷卻轉(zhuǎn)入離心管，平衡后放入離心機(jī)??！離心：2500r/min5min

小心取出，取上清液測(cè)吸光值28標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：以葡萄糖量(mg)為橫座標(biāo)，吸光度差值(ΔA590

）為縱座標(biāo)，在座標(biāo)紙上繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。比色測(cè)定：

用H2O作調(diào)0空白參比液！

在590nm波長(zhǎng)下測(cè)定各管的吸光度。

ΔA590葡萄糖mg0292.0～3.0g樣品—→加水研磨成勻漿后無(wú)損轉(zhuǎn)入50ml大試管（25ml左右）—→80℃水浴20-30min（間歇震蕩）—→冷卻后轉(zhuǎn)入100ml容量瓶定容、過(guò)濾后得到待測(cè)溶液。

取待測(cè)液6.0ml進(jìn)行測(cè)定（按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟）。2樣品還原糖提取與測(cè)定30W=g；VT=100ml;Vs=6ml;A590及ΔA590填入工作曲線表作式作曲線圖由工作曲線查得樣品的還原糖含量為C=?mg四、數(shù)據(jù)記錄31樣品還原糖的含量（%）＝五、結(jié)果計(jì)算

（X：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的糖質(zhì)量mg；VT：提取液總體積（mL）；W：樣品鮮質(zhì)量（g）；Vs：測(cè)定時(shí)取用的樣品體積（mL）；N：樣品稀釋倍數(shù)）322種溫度水浴處理，不可弄混離心機(jī)使用注意安全。思考：比較雙縮脲試劑與斐林試劑的差異？思考：比較本實(shí)驗(yàn)與蛋白質(zhì)測(cè)定實(shí)驗(yàn)中的化學(xué)原理差異？注意事項(xiàng)與思考：淀粉酶活性的測(cè)定（P174）實(shí)驗(yàn)04一、目的二、原理淀粉α-淀粉酶（內(nèi)切酶）β-淀粉酶（外切酶）麥芽糖等寡聚糖麥芽糖3，5-二硝基水楊酸3-氨基-5-硝基水楊酸（棕紅色）淀粉酶的作用機(jī)制及產(chǎn)物顯色原理：540nm比色測(cè)定淀粉酶活性大小的表示方法：淀粉酶活性的大小與產(chǎn)生的還原糖的量成正比。以單位質(zhì)量樣品單位時(shí)間生成的還原糖的量表示。測(cè)定α-淀粉酶和β-淀粉酶：α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐熱，本實(shí)驗(yàn)采用70。C保溫15min鈍化β-淀粉酶而測(cè)出α-淀粉酶?？偦盍p去α-淀粉酶活力則為β-淀粉酶活力。三、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)1cm）儀器設(shè)備：分光光度計(jì)、恒溫水浴、刻度試管、容量瓶試劑：

1、標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液（1mg/mL）

2、3，5-二硝基水楊酸（含NaOH）

3、1%淀粉溶液四、實(shí)驗(yàn)步驟2、酶液制備稱取1g萌發(fā)的小麥種子加少量蒸餾水研磨

轉(zhuǎn)入100mL容量瓶定容放置15min

過(guò)濾淀粉酶原液（酶液Ⅰ）

取酶液Ⅰ10mL于50mL容量瓶，用蒸餾水定容

至刻度，搖勻，即為淀粉酶稀釋液（酶液Ⅱ）1、麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

A540=0.264x-0.052(x為mg麥芽糖）3、酶活力的測(cè)定取4支干凈的具塞刻度試管，編號(hào)，按下表操作：搖勻，沸水浴中5min，取出流水冷卻，加蒸餾水至20mL。搖勻，540nm比色測(cè)定。操作項(xiàng)目管號(hào)

Ⅰ-1Ⅰ-2Ⅱ-1Ⅱ-2淀粉酶原液（酶液Ⅰ）/mL1.01.000鈍化β-淀粉酶置70。C水浴中15min，取出后流水冷卻淀粉酶稀釋液（酶液Ⅱ）/mL001.01.03，5-二硝基水楊酸/mL2.002.00預(yù)保溫40。C恒溫水浴中保溫10min1%淀粉溶液/mL（40。C）1.01.01.01.0保溫40。C恒溫水浴中保溫5min3，5-二硝基水楊酸/mL02.002.0空白管：2mL蒸餾水+2mL3，5-二硝基水楊酸，沸水浴5min，定容至20mL五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)VT=VS=W=N=5AⅠ-1=AⅠ-2=△A1=AⅠ-2-AⅠ-1x1=AⅡ-1=AⅡ-2=△A2=AⅡ-2-AⅡ-1x2=六、結(jié)果計(jì)算X1×VTα-淀粉酶活力[mg/(g.min)]=

W×VS×tX2×VT×N(α+β)-淀粉酶活力[mg/(g.min)]=

W×VS×tβ-淀粉酶活力=(α+β)-淀粉酶活力-α-淀粉酶活力七、分析討論注意事項(xiàng)：1、三個(gè)水浴溫度的不同，不能混淆。2、實(shí)驗(yàn)步驟較復(fù)雜，理解之后動(dòng)手操作。43實(shí)驗(yàn)06

植物組織中總氮含量的測(cè)定

（微量凱氏定氮法）44

氮素代謝在植物新陳代謝中占有重要地位。測(cè)定氮素含量對(duì)于研究植物的營(yíng)養(yǎng)生理，以及確定農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等均具有重要意義。動(dòng)植物組織中的氮包括蛋白氮和非蛋白氮兩大類，主要以有機(jī)氮形式存在。由于蛋白質(zhì)的含氮量相對(duì)穩(wěn)定，測(cè)定出樣品中總氮含量，再乘上一個(gè)系數(shù)即可得出樣品中粗蛋白含量。如要準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)含量，則需利用三氯乙酸將樣品中蛋白質(zhì)沉淀出來(lái)，再分別測(cè)定蛋白氮和非蛋白氮。組織中含氮量常用凱氏定氮法測(cè)定。45一、原理在催化劑（如CuSO4、K2SO4、硒粉等）存在的條件下，將植物材料與濃硫酸共熱，有機(jī)物氧化分解成CO2和H2O，其中的氮轉(zhuǎn)變?yōu)榘保⑦M(jìn)一步生成(NH4)2SO4，這個(gè)過(guò)程稱為消化。在消化后的樣品中加入過(guò)量的NaOH，經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解釋放出NH3，通過(guò)蒸餾借蒸汽將NH3導(dǎo)入過(guò)量的硼酸溶液中生成四硼酸銨；再用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定，直到硼酸溶液恢復(fù)到原來(lái)的H+濃度，根據(jù)鹽酸的用量即可計(jì)算出樣品中總氮的含量。46一、原理

以甘氨酸為例的化學(xué)反應(yīng)式：消化：CH2NH2COOH+3H2SO4→2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4蒸餾:(NH4)2SO4+2NaOH→2H2O+Na2SO4+2NH3↑2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O滴定：(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO347材料：面粉

儀器設(shè)備：消煮爐、海能K9840型自動(dòng)凱氏定氮儀、Titrette滴定計(jì)、分析天平、消化管、蒸餾管、容量瓶、三角瓶、移液管等。

試劑：

1.濃硫酸（AR級(jí)）；2.30-40%（W/V）NaOH；

3.2%硼酸溶液；4.0.01mol/LHCl標(biāo)準(zhǔn)溶液；

5.混合催化劑；6.混合指示劑；

7.30%H2O2;8.標(biāo)準(zhǔn)(NH4)2SO4溶液二、材料、儀器設(shè)備及試劑48簡(jiǎn)易凱氏定氮蒸餾裝置海能K9840型全自動(dòng)凱氏定氮儀49三、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品消化（已完成）準(zhǔn)確稱取0.1-0.2g樣品（依其含氮量而定）至消化管中，加入5mL濃硫酸和0.3-0.5g混合催化劑，浸泡數(shù)小時(shí)后在管口蓋一小漏斗，放在消煮爐上加熱消化。開(kāi)始時(shí)溫度可稍低，加熱至管口不再產(chǎn)生泡沫時(shí)可逐漸升溫，使消化管內(nèi)液體達(dá)到微沸，直到消化液褐色消失并全部變?yōu)榍宄和该鳛橹?。在消化過(guò)程中，可分?jǐn)?shù)次加入少許H2O2以加速有機(jī)物氧化。如發(fā)現(xiàn)在消化管上部有黑色顆粒，應(yīng)小心轉(zhuǎn)動(dòng)消化管，用消化液將其沖洗下來(lái)。整個(gè)過(guò)程一般需3-4小時(shí)，均應(yīng)在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。502.定容：

消化液冷卻后，沿管壁仔細(xì)加入10mL左右無(wú)氨蒸餾水以沖洗管壁→冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶，再用少量無(wú)氨蒸餾水沖洗消化管數(shù)次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶→冷卻后用無(wú)氨蒸餾水定容至刻度，混勻后備用。513.蒸餾

（1）使用前儀器檢查：檢查無(wú)氨蒸餾水（藍(lán)色標(biāo)簽）、NaOH（30-40%、黃色標(biāo)簽）、H3BO3（2%、紅色標(biāo)簽）三個(gè)試劑瓶是否裝有規(guī)定的試劑、瓶蓋是否蓋緊（切忌漏氣）；電源插頭是否接通；冷卻水源是否接牢。

（2）加樣：取10mL樣品消化液轉(zhuǎn)入蒸餾樣品管中，安裝在定氮儀蒸餾管接口上（注意密接好）；安放承接蒸餾液的三角瓶（集液瓶）。523.蒸餾

（3）開(kāi)機(jī)：打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，儀器自動(dòng)進(jìn)入“自動(dòng)、手動(dòng)可選界面”。

（4）參數(shù)設(shè)置：按“確認(rèn)”鍵上、下箭頭調(diào)光標(biāo)于自動(dòng)處，按下確認(rèn)鍵，進(jìn)入“當(dāng)前參數(shù)”界面。

參數(shù)值常規(guī)設(shè)置：稀釋水量5mL、硼酸體積10mL、加堿體積10mL、蒸餾時(shí)間4-5min（第1個(gè)樣品5min，以后樣品4min）、淋洗水量5mL。533.蒸餾

（4）工作：儀器自動(dòng)顯示“集液瓶是否放置到位”。確認(rèn)放置到位后按確認(rèn)鍵，儀器按設(shè)定的程序和參數(shù)值進(jìn)行自動(dòng)蒸餾，蒸餾中顯示順計(jì)時(shí)工作狀態(tài)。

蒸餾到預(yù)定時(shí)間，儀器停止工作且自動(dòng)回復(fù)到“自動(dòng)、手動(dòng)”可選界面。

取下樣品管和蒸餾液瓶用于滴定。（5）再次蒸餾：裝上下一個(gè)待測(cè)樣品管和集液三角瓶，按確認(rèn)鍵3次后，儀器開(kāi)始自動(dòng)再次蒸餾。543.蒸餾

（6）空白蒸餾

用未加植物樣品的消化液（其余試劑都加入并按同樣方法進(jìn)行消化）為空白液，按樣品消化液的蒸餾方法進(jìn)行蒸餾。

注意事項(xiàng)：

（1）參數(shù)修改：按“修改”鍵→使用“確認(rèn)”鍵周?chē)纳稀⑾?、左、右箭頭鍵選擇修改指標(biāo)→輸入設(shè)定指標(biāo)值→設(shè)定完畢按確認(rèn)鍵；

（2）從蒸餾儀上取樣品管時(shí)，應(yīng)戴上手套或用干抹布包裹操作，以防高溫灼傷；

（3）杜絕用化學(xué)污染的手在界面上操作；

（4）當(dāng)操作失誤或出現(xiàn)異常情況時(shí)，按“急?！辨I停止工作；排除故障后，按“返回”鍵重新操作。554.樣品及空白滴定

樣品和空白蒸餾完畢后，分別用0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直到硼酸-指示劑混合液變回淡紫紅色即為滴定終點(diǎn)，記錄滴定樣品和空白蒸餾液的鹽酸用量。

（滴定空白蒸餾液的鹽酸用量一般為0.2mL）56滴定計(jì)操作

（1）打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，將滴定閥旋至“循環(huán)”檔；

（2）旋轉(zhuǎn)操作手輪，排出汲筒管中空氣，再反向旋轉(zhuǎn)操作手輪至活塞和溶液上升到約一半位置；如此反復(fù)數(shù)次，直到汲筒管溶液中無(wú)大氣泡；

（3）旋下滴定管保護(hù)螺帽，將滴定閥旋至滴定檔，逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)操作手輪，排出滴定管中氣泡；

（4）按下清零按鈕，逆時(shí)針緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)操作手輪進(jìn)行滴定。

（5）滴定完成后，記錄滴定體積。按下清零按鈕，進(jìn)行下一輪滴定。數(shù)值清零按鈕液晶顯示屏計(jì)數(shù)暫停鍵操作手輪滴定閥電源開(kāi)關(guān)保護(hù)螺帽汲筒管注意事項(xiàng)：（1）儀器昂貴，小心拿放；（2）滴定前確保接口密封；（3）各項(xiàng)操作不可用力過(guò)猛。57W=g（根據(jù)樣品管編號(hào)在講臺(tái)上查表獲得）；VT=mL;Vs=mL;A=mL；B=0.2mL四、數(shù)據(jù)記錄五、結(jié)果計(jì)算樣品總氮含量（%）=

面粉粗蛋白含量（%）=樣品含氮量（%）×5.70（C：滴定時(shí)標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液濃度（0.0100mol/L

）；VT：消化液定容總體積（mL）；W：樣品質(zhì)量（g）；Vs：蒸餾時(shí)取樣體積（mL）；A：滴定樣品所用鹽酸體積（mL）；B：滴定空白所用鹽酸體積（0.2mL）

）六、分析討論58為了熟悉蒸餾和滴定的操作技術(shù)和檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及誤差，常用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)硫酸銨溶液測(cè)試3次；定氮儀的樣品管連接處不能漏氣；取樣品管時(shí)，小心避免強(qiáng)堿濺在身上引起灼傷或腐蝕衣物等；使用完畢，切記關(guān)好電源和冷卻水源。注意事項(xiàng)：59實(shí)驗(yàn)07

抗壞血酸（Vc）含量的測(cè)定

（滴定法）60一、原理Vc具有很強(qiáng)的還原性，染料2,6-二氯酚靛酚具有較強(qiáng)的氧化性，且在酸性溶液中呈紅色，在中性或堿性溶液中呈藍(lán)色。用草酸提取Vc，然后用藍(lán)色的堿性2,6-二氯酚靛酚溶液對(duì)其進(jìn)行滴定時(shí)，Vc可將2,6-二氯酚靛酚還原成無(wú)色。但當(dāng)Vc被消耗完后，再滴入少許2,6-二氯酚靛酚就會(huì)使溶液呈現(xiàn)紅色，借此可指示滴定終點(diǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)2,6-二氯酚靛酚的用量，可以計(jì)算出被測(cè)樣品中Vc的含量。

抗壞血酸又稱為維生素c（Vc），在一般水果、果蔬中含量較高。測(cè)定Vc含量，可作為衡量果蔬品質(zhì)指標(biāo)之一。61材料：苞菜或其他果蔬

儀器設(shè)備：蒸發(fā)皿、天平、容量瓶、研缽、堿式滴定管、漏斗、移液管等

試劑：

1.2%草酸；

2.堿性2,6-二氯酚靛酚溶液（藍(lán)色）；

3.0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液（用草酸配制）二、材料、儀器設(shè)備及試劑2,6-二氯酚靛酚溶液（堿性、藍(lán)色）62三、實(shí)驗(yàn)步驟1.樣品提取

準(zhǔn)確稱取3g左右樣品放入研缽中，加入2%草酸溶液約5mL研磨→勻漿液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶，用草酸洗滌研缽3次，洗滌液一并轉(zhuǎn)入容量瓶中→用草酸定容至刻度→過(guò)濾，收集濾液，備用。2.空白滴定取2%草酸10mL至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)，記錄染料用量。63三、實(shí)驗(yàn)步驟4.樣品滴定取樣品濾液10mL至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為止。記錄染料用量。3.染料標(biāo)定取10mL標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液至蒸發(fā)皿中，用2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉紅色，并在30s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)。計(jì)算1mL染料相當(dāng)于Vc的mg數(shù)，即滴定度（A）。64W=g；V1=mL;V0=mL；VT=mL;Vs=mL四、數(shù)據(jù)記錄五、結(jié)果計(jì)算樣品Vc含量（mg/100g）=（A：滴定度（mg/mL）；V標(biāo)：染料標(biāo)定所用染料體積（mL）；V1：滴定樣品所用染料的mL數(shù)；V0：滴定空白所用染料的mL數(shù)；

VT：樣品液定容總體積（mL）；Vs：滴定時(shí)取樣品溶液的體積（mL）；W：樣品質(zhì)量（g））滴定度（mg/mL）A=六、分析討論65樣品Vc的提取和定容、標(biāo)準(zhǔn)Vc溶液的配制都要用2%草酸為溶劑；滴定時(shí)要邊滴邊攪拌蒸發(fā)皿中溶液。注意事項(xiàng)：實(shí)驗(yàn)06植物組織中DNA的提取與測(cè)定（P226）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1、提取DNA用于PCR等實(shí)驗(yàn)

2、了解核酸提取的原理、各試劑的用途等二、原理——鹽溶法

1.鹽溶法：DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶

2.

破碎細(xì)胞：機(jī)械處理：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；化學(xué)處理：用SDS處理細(xì)胞。

3.

去除RNA：

DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；

DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶；

RNA酶，酶解RNA

4.

去除蛋白質(zhì)：加入SDS、高溫變性、有機(jī)溶劑（氯仿＋異戊醇）變性、檸檬酸、高氯酸等。

用高氯酸除去磷蛋白、糖類、磷脂、核苷酸類輔酶和游離核苷酸、酸溶性小分子物質(zhì)等雜質(zhì)。

氯仿除脂類分子5.

DNA酶失活：

DNA酶需二價(jià)離子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合二價(jià)陽(yáng)離子，基本可抑制DNA酶活性。

6.

DNA提?。翰蝗苡谝话阌袡C(jī)溶劑，在乙醇中不溶形成沉淀。

7.

測(cè)定與含量計(jì)算：DNA在260nm處對(duì)紫外光吸收最大。對(duì)純DNA樣品來(lái)說(shuō)，濃度為1

μg/ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD260＝0.02。即當(dāng)A260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50

μg/ml。三、材料、儀器、試劑

1.

材料：花棷菜、小麥芽等細(xì)胞分裂、DNA合成較旺盛的幼嫩組織器官。

2.

儀器：紫外分光光度計(jì)等。

3.

試劑：研磨緩沖液、10×SSC等、氯仿－異戊醇、高氯酸鈉、SDS等。四、實(shí)驗(yàn)步驟1.

取花菜2－3g,剪碎置研缽中，加10ml預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。