生化20重組DNA技術(shù)

第二十章重組DNA技術(shù)recombinantDNAtechnique第一節(jié)

重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程重組DNA技術(shù)：又稱(chēng)DNA克隆或基因克隆應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將不同來(lái)源的特異基因或DNA片段插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)建重組DNA分子，然后將重組DNA導(dǎo)入到合適的受體細(xì)胞中，使其在細(xì)胞中擴(kuò)增和繁殖（稱(chēng)之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子?？寺?clone)：來(lái)自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』?cloning)：獲取這類(lèi)同一的DNA分子群體、細(xì)胞群體或個(gè)體群體的過(guò)程，即無(wú)性繁殖。重組DNA(recombinantDNA,或嵌合DNA,chimeraDNA)：采用克隆技術(shù)，把來(lái)自不同生物的外源DNA插入載體分子所形成的雜合DNA分子。重組DNA技術(shù)的基本過(guò)程

第二節(jié)重組DNA技術(shù)中常用工具酶

一、限制性核酸內(nèi)切酶二、DNA連接酶三、DNA聚合酶四、其它修飾酶

1.限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease)—基因工程的手術(shù)刀功能：

識(shí)別雙鏈DNA中特異序列，該序列的特征為4-6個(gè)核苷酸的回文結(jié)構(gòu)，并在識(shí)別序列內(nèi)或附近特異切割DNA，產(chǎn)生黏性末端或平末端。

根據(jù)需要在特定的位點(diǎn)精確切割雙鏈DNA分子。作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類(lèi)：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫(xiě)；第二、第三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫(xiě)；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名：HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類(lèi)酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)

(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG

作用模式圖：（1）產(chǎn)生5

突出黏性末端

(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—

作用模式圖：（2）產(chǎn)生3突出黏性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********

作用模式圖：（3）產(chǎn)生平末端

(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************同裂酶來(lái)源不同但能識(shí)別相同序列的酶，又稱(chēng)同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性?xún)?nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的黏性末端，稱(chēng)為同尾酶。這兩個(gè)相同的黏性末端稱(chēng)為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

可變酶

識(shí)別DNA序列中的一個(gè)或幾個(gè)堿基是可變的，并且識(shí)別序列往往超過(guò)6個(gè)核苷酸。此類(lèi)酶是Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC;

Bbl

ⅠGCC(N)4NGGC2.

DNA連接酶(DNAligase)

—基因工程的縫紉針

將兩條雙鏈DNA片段連接起來(lái)，實(shí)現(xiàn)DNA的體外重組。功能：

催化兩條雙鏈DNA分子的互補(bǔ)黏性末端或平末端的5磷酸基團(tuán)與3羥基形成磷酸酯鍵。

也可將雙鏈DNA分子內(nèi)部的單個(gè)切口(無(wú)核苷酸空缺)連接起來(lái)。還可作用于RNA，但效率很低。

DNA連接酶催化平末端連接要比黏性末端效率低得多。

DNA連接酶有T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶

DNA連接酶

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—DNA連接酶作用模式圖：（1）連接黏性末端

作用模式圖：（2）連接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************DNA連接酶

能夠把脫氧核糖核苷酸連續(xù)地添加到雙鏈DNA分子引物鏈的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用

類(lèi)型：

大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段

TaqDNA聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶

三、DNA聚合酶

四、其它修飾酶

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）

功能：催化脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3′突出末端的雙鏈DNA。OH5′3′Mg2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A、G、C、T)n末端轉(zhuǎn)移酶

(2)底物是平端或3′凹端的雙鏈DNA。5′3′Co2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′Co2+dNTPnppi5′3′OHOH(A、G、C、T)n

用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3′

末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）DNA3′末端的同位素標(biāo)記。

目的基因進(jìn)入原核或真核細(xì)胞并高效復(fù)制和表達(dá)蛋白質(zhì)，需要裝入載體才能實(shí)現(xiàn)。載體（vector）

指能攜帶外源DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具第三節(jié)重組DNA技術(shù)中常用載體

作為基因工程載體所需具備的基本條件能自主復(fù)制；具有兩個(gè)以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(diǎn)(外源DNA插入點(diǎn))，常具有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)，稱(chēng)為多克隆位點(diǎn)；分子量小，以容納較大的外源DNA；拷貝數(shù)高具有較高的遺傳穩(wěn)定性克隆載體(cloningvector)

為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體。表達(dá)載體(expressionvector)

為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體。

質(zhì)粒載體：最常用的對(duì)目的基因克隆

噬菌體：主要用于構(gòu)建基因組DNA或

cDNA文庫(kù)M13噬菌體：專(zhuān)用于Sanger雙脫氧DNA測(cè)序

粘粒：用于克隆大片段DNA

酵母質(zhì)粒：用于在酵母中表達(dá)目的蛋白病毒：包括人或哺乳動(dòng)物病毒、昆蟲(chóng)及植物毒，用于在真核細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白

基因工程載體的種類(lèi)和用途1.質(zhì)粒(plasmid)載體

細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒擴(kuò)增并表達(dá)蛋白質(zhì)大腸桿菌染色質(zhì)質(zhì)粒

細(xì)菌染色質(zhì)以外的雙鏈環(huán)狀DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。

AmprORITetrpBR322質(zhì)粒：一種克隆質(zhì)粒ORI：復(fù)制起始點(diǎn)，保證高拷貝自我復(fù)制。結(jié)構(gòu)與功能：Ampr,

Tetr：兩個(gè)抗性基因用于篩選陽(yáng)性克隆。PstI,BamHI：兩個(gè)單酶切位點(diǎn)用于插入目的基因分子量較小拷貝數(shù)較高pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSMCS：MultipleClonningSite提供多個(gè)單酶切位點(diǎn)用于克隆操作LacZ:藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆第四節(jié)目的基因的獲得和體外重組

一、目的基因的獲得

----分二、目的基因的體外重組

----切、接目的基因

(targetDNA)cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)目的:

分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列

獲得感興趣基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）種類(lèi)：（一）化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列（二）聚合酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction,PCR)（三）從基因文庫(kù)中篩選（一）目的基因的獲取—分*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測(cè)可能的DNA序列組織或細(xì)胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉(zhuǎn)化菌限制性?xún)?nèi)切酶受體菌基因組DNA文庫(kù)存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫(kù)

反轉(zhuǎn)錄酶

載體

受體菌

復(fù)制*從cDNA文庫(kù)獲取目的基因

反轉(zhuǎn)錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT

基因組文庫(kù)：G-文庫(kù)cDNA文庫(kù)：c-文庫(kù)

(常用)方法：基因文庫(kù)

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫(kù)中的DNA作核酸雜交，從基因文庫(kù)中“釣出”有目的基因的克隆。（三）外源基因與載體的連接—接1.黏性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接

(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接

配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連同一限制酶切位點(diǎn)連接不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。2.平末端連接適用于：限制性?xún)?nèi)切酶切割產(chǎn)生的粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端目的基因載體限制性?xún)?nèi)切酶限制性?xún)?nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn)生黏性末端，而進(jìn)行粘端連接。

人工接頭及其應(yīng)用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄4.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再進(jìn)行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機(jī)械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT

5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA