呈色反應及等電點測定

生物化學實驗蛋白質及氨基酸的呈色反應蛋白質等電點的測定

蛋白質及氨基酸的呈色反應1.學習蛋白質的鑒定方法并了解其原理;2.學習氨基酸的鑒定方法并了解其原理.目的要求實驗內(nèi)容雙縮脲反應（尿素和蛋白液）黃色反應（頭發(fā)，指甲，蛋白液）茚三酮反應（氨基酸，蛋白質）原理

雙縮脲反應

雙縮脲雙縮脲絡合物雙縮脲4個肽鍵的氨基與銅離子形成絡合物多肽鏈雙縮脲似絡合物原理實驗內(nèi)容1.加熱尿素生成雙縮脲,觀察雙縮脲反應的顏色變化;2.觀察透析蛋白液的雙縮脲反應的顏色變化.

雙縮脲反應尿素(晶體)10%氫氧化鈉溶液1%硫酸銅溶液蛋白液（取雞蛋清，加6-10倍水混勻，過濾）

雙縮脲反應實驗試劑試管及試管架試管夾酒精燈實驗器材

雙縮脲反應實驗操作見教材注意事項選用干燥的試管,尿素加熱時間不能過長(1分鐘以內(nèi));避免加入過量CuSO4,否則生成蘭色的Cu(OH)2能掩蓋紫紅色.

雙縮脲反應黃色反應酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸硝酸對苯環(huán)發(fā)生硝化作用，生成黃色的芳香硝基化合物，使蛋白質發(fā)生變性反應原理硝基酚（黃色）鄰硝醌酸鈉（橙黃色）實驗試劑與器材見教材實驗操作見教材原理茚三酮反應實驗內(nèi)容1.蛋白質(蛋白液)的茚三酮反應;2.氨基酸的茚三酮反應.茚三酮反應0.5%茚三酮乙醇溶液透析蛋白液0.5%甘氨酸溶液茚三酮反應實驗試劑試管試管架酒精燈電吹風茚三酮反應實驗器材注意事項在濾紙上觀察茚三酮反應時,濾紙應該跟火焰保持一定距離.茚三酮反應思考題1.如果蛋白質水解作用一直進行到雙縮脲反應呈陰性結果,可對水解作用作出什么結論?2.能否利用茚三酮反應可靠的鑒定蛋白質的存在?茚三酮反應蛋白質含量測定

（設計性實驗）2010.4蛋白質的濃度測定方法根據(jù)它們的物理性質，如折射率、比重、吸光值來測定，如蛋白質的紫外吸收法；利用蛋白質的化學性質，用化學反應的方法測定，如凱氏定氮法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法測定；還可用染色法，如用氨基黑、考馬斯亮藍-G250測定；另外還可用螢光激發(fā)、放射性同位素計數(shù)等靈敏度較高的方法測定。上述方法中，紫外吸收法、雙縮脲法、Folin－酚試劑法、凱氏定氮法、考馬斯亮藍染色法最為常用，它們操作相對簡單，不需要昂貴的設備。以下主要介紹這幾種方法。雙縮脲法測定蛋白質含量

原理：在堿性溶液中蛋白質與銅離予形成紫紅色絡合物，可在540nm比色測定，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸組成無關，該法測定的蛋白質濃度范圍為1-10g/l。器材試劑雙縮脲試劑標準蛋白液（牛血清白蛋白）分光光度計離心機實驗操作盡量詳細，涉及計算的最好提前計算好；提前掌握相關儀器設備的使用紫外吸收法測定蛋白質含量由干蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在280nm處有一個紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi)，蛋白質溶液在280nm的光吸收值與其濃度成正比，因此可作定量測定，該法測定蛋白質的濃度范圍為0．l～1g/L。器材試劑分光光度計離心機實驗操作標準曲線制備考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量原理：考馬斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色．當它與蛋白質結合后，變?yōu)樗{色，可在590nm處比色測定，該法反應快、操作簡便，消耗樣品最少。缺點：不同蛋白質之間差異大（why?），且標準曲線線性較差。測定蛋白質的濃度范圍為0.01-1.0g/l。器材試劑考馬斯亮藍G-250染色液配制實驗操作標準曲線制備待測樣品測定重點難點測定方法的選擇；待測蛋白質的選材（蛋白質的含量；蛋白質種類；干擾因素）；制備蛋白質溶液（盡可能多的含有目標蛋白，澄清，無沉淀）；標準曲線制備（待測蛋白液濃度在標準曲線中間）。蛋白質等電點的測定原理測定白明膠的等電點:配置不同PH值的緩沖液,加入白明膠后,再加入脫水劑,觀察溶液的渾濁程度,指出等電點蛋白質等電點的測定實驗內(nèi)容0.1mol/l醋酸鈉溶液0.1mol/l醋酸溶液95%乙醇1%白明膠溶液1mol/l醋酸溶液蛋白質等電點的測定實驗試劑試管4支(大)試管架吸量量管(5毫升2支,2毫升3支,1毫升1支)蛋白質等電點的測定實驗器材試劑(毫升)試

管號

碼12340.1mol/l醋酸鈉溶液

2.0

2.02.02.00.1mol/l醋酸0.250.502.0/1mol/l醋酸///0.8蒸餾水3.753.502.02.01%白明膠溶液2.02.02.02.0PH值5.65.34.74.1蛋白質等電點的測定白明膠應先在水浴鍋加熱,攪拌并溶解,待完全溶解才能使用;滴加乙醇時應邊加邊振蕩.蛋白質等電點的測定注意事項什么是蛋白質的等電點?蛋白質在等電點溶液中必然沉淀,請結合蛋白質的膠體性質說明以上結論對嗎?蛋白質等電點的測定思考題氨基酸的甲醛滴定2011.3實驗目的掌握甲醛滴定法測量氨基酸含量的原理和方法實驗原理氨基酸是兩性電解質，在水溶液中達水解平衡是弱酸，完全解離時pH為11―12或更高；一般指示劑變色域小于10，很難準確指示終點。指示劑名稱低pH值時顏色過渡、轉變顏色的pH范圍高pH值時顏色石蕊紅4.5-8.3藍酚酞無色8.2-10.0粉紅酚紅黃6.6-8.0紅甲基橙紅3.1-4.4黃甲基紫黃0.0-1.6紫藍甲基黃紅2.9-4.0黃甲基紅紅4.2-6.3黃剛果紅藍3.0-5.2紅百里酚藍黃8.0-9.6藍孔雀石綠黃0.2-1.8藍綠溴甲酚綠黃3.8-5.4藍綠溴甲酚紫黃5.2-6.8紫溴酚藍黃3.0-4.6紫溴百里酚藍黃6.0-7.6藍百里酚酞無色9.4-10.6藍實驗原理

R-CH-COOHR-CH-COOHNH2

甲醛

N(CH20H)2

(氨基酸)(二羥甲基氨基酸）PK:10-12PK:7

酚酞（PH9左右由無色變成粉紅色）

PK：氨基酸完全解離時的PH值實驗原理實驗試劑和器材三、器材1．錐形瓶

2．吸量管（2mL

、5mL

）3．堿式滴定管、滴定臺、蝴蝶夾四、試劑1．0．1m01／‘L標準甘氨酸溶液

2．0．1mol／L標準氫氧化鈉溶液

3.0.5％酚酞指示劑

4.中性甲醛溶液實驗操作1．取3個25mL的錐形瓶，編號。向第1、2號瓶內(nèi)各加入2mL0.01mol／L的標準甘氨酸溶液和1-2滴酚酞指示劑,向3號瓶內(nèi)加入2mL水1-2滴酚酞指示劑;然后向1號瓶中加入4mL甲醛溶液，混勻，再向1號瓶滴加0.01mol／L標準氫氧化鈉溶液至溶液顯微紅色。向2、3號瓶中各加入4mL甲醛溶液，混勻，再分別向2、3號瓶滴加0.01mol／L標準氫氧化鈉溶液至1號瓶顏色。

重復以上實驗2次，記錄每次每瓶消耗標準氫氧化鈉溶液的mL數(shù)。取平均值，計算甘氨酸氨基氮的回收率。氨基氮的實際測得量：氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）×0.14008/2

甘氨酸氨基氮回收率％=實際測得量/理論加入量×100%

實驗操作C2H2NO2

編號試劑1230.01mol／L標準甘氨酸溶液2ml2ml酚酞指示劑1-2滴1-2滴1-2滴中性甲醛4ml4ml蒸餾水2ml0.01mol／L標準氫氧化鈉溶液滴定至溶液粉紅色滴定至1號瓶顏色滴定至1號瓶顏色2.取未知濃度的甘氨酸溶液2ml，依上述方法進行測定，平行做2份，取平均值。計算每ml甘氨酸溶液中含有氨基氮的mg數(shù)。

氨基氮(mg/ml)=（V2-V3）×0.14008/2實驗操作編號試劑123未知濃度甘氨酸溶液2ml