食品理化檢驗 霉菌毒素檢驗

霉菌毒素的檢驗掌握：黃曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定黃曲霉毒素B1的原理和方法微柱篩選法測定AFTB1的原理及方法赭曲霉毒素的理化性質(zhì)和薄層色譜法測定的原理及方法熟悉：展青霉素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、玉米赤霉烯酮的測定方法了解：霉菌毒素的命名、分類、危害和污染來源概述黃曲霉毒素的檢驗赭zhě曲霉毒素

展青霉素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇

T-2毒素玉米赤霉烯酮的測定方法目錄霉菌及霉菌毒素霉菌：是絲狀真菌的俗稱，意即"發(fā)霉的真菌"，它們往往能形成分枝繁茂的菌絲體，但又不象蘑菇那樣產(chǎn)生大型的子實體。常見毒性大的霉菌毒素：黃曲霉毒素（AFT）、雜色曲霉素、赭曲霉毒素、伏馬菌素、展青霉素、桔青霉素、玉米赤霉烯酮霉菌毒素的命名與分類按照產(chǎn)生毒素的霉菌名稱來命名按毒作用部位分肝臟毒素腎臟毒素神經(jīng)毒素類似性激素作用物質(zhì)按毒素來源分曲霉毒素青霉毒素鐮刀菌毒素霉菌毒素的分類按毒作用機理抑制蛋白質(zhì)合成類作用于離子通道類作用于細胞骨架類作用于細胞突觸類霉菌毒素的分類按毒素結(jié)構(gòu)分二呋喃環(huán)內(nèi)酯環(huán)醌類霉菌毒素的產(chǎn)生條件水分

pH

溫度濕度氧氣霉菌毒性與危害肝、腎、神經(jīng)、生殖、消化系統(tǒng)的損害免疫抑制、細胞毒性致癌、致畸、致突變，如黃曲霉毒素能誘發(fā)人、猴、鼠、禽類發(fā)生肝癌，致癌所需時間最短為24周。第二節(jié)黃曲霉毒素的檢驗黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)

黃曲霉、寄生霉和溫特霉的代謝產(chǎn)物劇毒物，其毒性是氰化鉀的10倍，為砒霜的68倍，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的化學(xué)致癌物質(zhì)之一黃曲霉毒素B1最為多見，其毒性和致癌性也最強高溫高濕地區(qū)生產(chǎn)的花生、玉米、大米、棉籽等最容易被污染基本結(jié)構(gòu)：二呋喃環(huán)和香豆素產(chǎn)生熒光顏色不同，可分為B族（藍色）和G族（綠色）兩大類及其衍生物主要存在于牛奶中AFTB1及其衍生物AFTG2及其衍生物黃曲霉毒素的理化性質(zhì)耐熱，高于280℃裂解；耐光，不耐氧化劑難溶于水，乙醚、石油醚，易溶于甲醇和氯仿在堿性條件下，其結(jié)構(gòu)中的內(nèi)脂環(huán)可被破壞形成香豆素鈉鹽，該鹽能溶于水，無毒。在酸性條件下，能發(fā)生逆反應(yīng)，恢復(fù)其毒性。其反應(yīng)式為：黃曲霉毒素B1黃曲霉毒素的分析方法TLC酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）微柱篩選法HPLC國標(biāo)法薄層色譜法—單向展開法樣品中AFTB1經(jīng)甲醇-水溶液提取后，濃縮、定容、點樣于硅膠G薄層板上，經(jīng)展開分離后，在波長365nm紫外光下觀察藍紫色熒光，根據(jù)其在薄層板上顯示熒光的強度與標(biāo)準(zhǔn)比較來確定含量。樣品處理樣品→加正己烷（或石油醚）和甲醇-水溶液，震蕩→分層，取甲醇-水層→氯仿萃取→無水Na2SO4→過濾→濾液蒸干→苯-乙腈溶解→備用點樣

在距薄層板下端的2cm基線上用微量注射器滴加樣液，標(biāo)液，一塊板滴加4個點，點的直徑～3mm，大小一致，在一條直線上。滴加樣式如下：

第一點第二點第三點第四點樣液

—

20

20

20

μl淡標(biāo)

(0.04μg/ml)

10

—

10

—

μl濃標(biāo)

(0.2μg/ml)—

—

—

10

μl

（最低熒光點）（樣點）（熒光定位）預(yù)展及展開

預(yù)展，12cm無水乙醚展開10～12cm

丙酮：氯仿

8：92觀察及確證365nm若Rf=0.6附近有藍紫色熒光確證點樣后，在點樣處滴加三氟乙酸Rf=0.1附近有藍紫色熒光展開、紫外燈下觀察AFTB1→AFTB2a極性增大確證點樣操作第一點第二點第三點第四點樣液μl—20—20淡標(biāo)（0.04μg/ml）10—

10

—

三氟乙酸1小滴１小滴—

—

（反應(yīng)5min，熱風(fēng)吹2min，<40℃）

定量操作方法第一點第二點第三點第四點樣液

—101520μl淡標(biāo)

10—

—

—μl0.0004μg（0.04μg/ml）定量操作方法如樣點的熒光強度與淡標(biāo)點的熒光強度一致，則樣品中AFTB1含量為0.0004μg如樣點的熒光強度比最低檢出量強，則根據(jù)其強度估計減少滴加微升數(shù)或?qū)右合♂尯笤俚渭硬煌⑸敝翗狱c的熒光強度與最低檢出量的熒光強度一致。高效液相色譜法測定AFTB1樣品中的黃曲霉毒素經(jīng)C18柱分離，用帶熒光檢測器的高效液相色譜儀檢測，以保留時間定性，峰面積或峰高定量。樣品提取樣品粉碎加少量水氯仿提取無水Na2SO4脫水過濾提取液，待凈化樣品凈化和衍生物反應(yīng)硅鎂型吸附劑1.提取液2.氯仿-正己烷氯仿-甲醇3.丙酮-水洗脫洗脫液水浴蒸干氯仿溶解部分加入正己烷、三氟乙酸靜置30min氮氣吹干用流動相溶解進高效液相色譜儀高效液相測定參考條件檢測器：熒光檢測器激發(fā)波長：360nm

發(fā)射波長：425nm色譜柱：C18流動相：甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀（1+1）或乙腈-甲醇-水（50+150+300）流速：1.3ml/min微柱篩選法P130樣液中黃曲霉毒素被微柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層吸附后,在365nm紫外光燈下顯示藍紫色熒光環(huán)，其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的濃度范圍內(nèi)成正比例關(guān)系。由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,所以測得結(jié)果為總的黃曲霉毒素含量。

GB/T5009.23-2006玻璃微柱管：內(nèi)徑0.4cm，長12cm,為便于加液可在管的上部接一段粗的管口。

微柱層析架：附有接受洗脫廢液的容器，要盡可能密閉。

下層甲醇水提取液花生油振搖石油醚甲醇-水氯仿下層棄去水層，洗去殘留甲醇過濾備用無水硫酸鈉水黃曲霉毒素的提取—甲醇-水-石油醚提取法下層萃取液玉米磨碎潤濕氯仿過濾備用無水硫酸鈉黃曲霉毒素的提取—三氯甲烷水提取法甲醇-水微柱管制備脫脂棉（鋪頂層）3cm無水硫酸鈉（60～100目）1.5cm酸性氧化鋁1～2.5cm中性氧化鋁0.5cm無水硫酸鈉0.5cm硅鎂型吸附劑0.5cm無水硫酸鈉脫脂棉（作底層）

微柱層析1ml液體樣液0.0025μg/ml標(biāo)液0.005μg/ml標(biāo)液氯仿展開劑：丙酮－三氯甲烷（1:9）結(jié)果觀察與評定

365nm紫外光照射若樣品柱管內(nèi)硅鎂型吸附劑層只現(xiàn)微黃色熒光環(huán)，則樣品中黃曲霉毒素含量為未檢出(在5或10μg／kg以下)；若出現(xiàn)藍紫色熒光環(huán)，則需進一步通過薄層色譜測定法進行測定。

確證時，不需重新提取樣品其操作如下：準(zhǔn)確吸取原三氯甲烷提取液于小蒸發(fā)皿內(nèi)揮干，以少量苯－乙腈混合液(98＋2)分?jǐn)?shù)次轉(zhuǎn)入刻度小管中，定容至1.0mL，密塞，混勻，按薄層層析法確證，并測定黃曲霉毒素B1

、B2

、G1、G2

的含量。需要說明之處層析用的氧化鋁、硅鎂型吸附劑及無水硫酸鈉使用前應(yīng)在120℃活化2h，裝瓶蓋嚴(yán)于干燥器內(nèi)，可保存1周左右，超過1周需再次活化層析結(jié)束后，最好在2h內(nèi)觀察接受洗脫液的容器要密封第三節(jié)赭曲霉毒素A的檢驗赭曲霉毒素的理化性質(zhì)由曲霉菌，如赭曲霉、硫色曲霉、蜂蜜曲霉以及綠青霉等產(chǎn)生的一類毒素。赭曲霉毒素A（OTA）毒性最大，在霉變谷物、飼料等最常見。OTA微溶于水、石油醚，加堿成鹽，水溶解性增大酸性時，溶于苯、氯仿。對紫外線不穩(wěn)定，幾天即分解（應(yīng)避光）用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取樣品中的赭曲霉毒素A，樣品提取液經(jīng)液-液分配后，根據(jù)其在365nm紫外光燈下產(chǎn)生黃綠色熒光，在薄層色譜板上與標(biāo)準(zhǔn)比較測定含量。采用雙相展開法薄層色譜法GB/T5009.96-2003氯仿層樣品粉碎過濾氯仿磷酸NaHCO3水層氯仿層蒸干備用苯-乙腈鹽酸氯仿提?。追ǎ┘状?水層樣品粉碎過濾石油醚甲醇-水氯仿層震蕩氯仿層備用苯-乙腈NaCl飽和溶液提?。ㄒ曳ǎ┞确曼c樣、縱展展開劑：無水乙醚乙醚-甲醇-水縱展2～3cm

樣品+標(biāo)液橫展展開10～12cm樣品+標(biāo)液

樣液與標(biāo)品展開劑：無水乙醚乙醚-甲醇-水縱展展開劑：甲苯-乙酸乙酯-甲酸-水甲苯-乙酸乙酯-甲酸苯-冰乙酸縱展13～15cm

樣品+標(biāo)液觀察及確證365nm與標(biāo)準(zhǔn)點的相應(yīng)處有黃綠色熒光確證用碳酸氫鈉乙醇溶液噴灑色譜板，室溫下干燥紫外燈OTA熒光點應(yīng)由黃綠色變?yōu)樗{色稀釋定量比較樣液中OA與標(biāo)準(zhǔn)OA點的熒光強度，估計稀釋倍數(shù)。薄層板經(jīng)雙向展開后，當(dāng)樣品中OA含量高時，OA的熒光點會被橫向拉長，使點變扁，或分成兩個黃綠色熒光點。在橫展過程中，原點上OA的量超過了硅膠的吸附能力，原點上的雜質(zhì)和殘留溶劑在橫展中將OA點橫向拉長了。稀釋定量這時可根據(jù)OA黃綠色熒光的總強度與標(biāo)準(zhǔn)熒光強度比較，估計需減少的滴加微升數(shù)或所需稀釋倍數(shù)。經(jīng)稀釋后測定含量時，可在樣液點的左邊基線上滴加二個標(biāo)準(zhǔn)點，OA的量可為4ng、8ng，比較樣液與兩個標(biāo)準(zhǔn)OA熒光點的熒光強度，概略定量方法說明本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了谷物和大豆中OTA的薄層色譜測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于小麥、玉米和大豆中OTA的測定。薄層板上OTA的最低檢出量為4ng。本方法的最低檢測量為10μg/kg。標(biāo)準(zhǔn)使用液冰箱黑紙避光第四節(jié)展青霉素的檢驗一、展青霉素的理化性質(zhì)無色結(jié)晶，熔點110℃，在70-100℃可升華；溶于水和乙醇；在堿性條件下不穩(wěn)定，在酸性溶液中較穩(wěn)定，耐熱。二、食品中的來源主要存在于腐爛水果及其制品中展青霉素由蕁麻青霉、擴張青霉和棒曲霉等霉菌代謝產(chǎn)生的。三、毒性與危害四、衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)五、分析方法展青霉素的測定方法有氣相色譜法、高效液相色譜法和薄層色譜法。我國的標(biāo)準(zhǔn)分析方法為雙向薄層掃描定量測定法。雙相薄層掃描測定法用乙酸乙酯提取果汁，利用1.5%碳酸鈉凈化樣品，經(jīng)雙向薄層分離后，利用薄層掃描儀進行紫外反射光掃描定量。

本方法適合于蘋果、山楂制品及其半成品中展青霉素的測定GB/T5009.185-2003薄層掃描儀展青霉素的提取果汁：加乙酸乙酯，振搖2min，靜置分層。重復(fù)以上步驟兩次，合并有機相。有機相加碳酸鈉，振搖1min，靜置分層后，棄去碳酸鈉層，再用碳酸鈉重復(fù)處理一次。提取液濾真空減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷清洗瓶壁，濃縮干，加三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。展青霉素的提取鮮蘋果、果醬：蘋果洗凈、削皮、打碎置研缽中，加無水硫酸鈉研磨后轉(zhuǎn)至錐形瓶加乙酸乙酯浸泡、振蕩，過濾濾液減壓濃縮近干，用少許三氯甲烷清洗瓶壁，濃縮干，三氯甲烷定溶，供薄層色譜分析用。薄層分析點樣標(biāo)液與樣液相差3cm

在樣品點用一垂直線上，距頂端2cm處點20ng的標(biāo)準(zhǔn)液，為位置參考點。固定相：硅膠GF254

薄層分析雙向展開先橫向，排除雜質(zhì)的干擾，再縱向在波長254nm紫外燈下觀察，展青霉素Rf值約為0.35，若樣品點出現(xiàn)黑點，則樣品為陽性。根據(jù)樣液黑色吸收點的強度高低，稀釋不同倍數(shù)后，再點樣10μL，使每個樣品點展青霉素的絕對量在10~100ng之間，經(jīng)雙向展開后，進行掃描定量測定。

確證陽性樣品的驗證：將陽性樣品的薄層色譜板噴以MBTH顯色劑，130℃烘烤15min，冷卻至室溫后，于波長360nm紫外燈下觀察，展青霉素應(yīng)呈橙黃色點。定量測定波長270nm；參考波長310nm；反射光測定；掃描速度40nn/min；記錄儀紙速20nn/min；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)及樣品中展青霉素峰面積，按下式計算樣品中展青霉素含量。

X——果汁中展青霉素含量，μg/mL；

Y——鮮蘋果中展青霉素含，μg/g；

c——展青霉素標(biāo)準(zhǔn)液濃度，μg/mL；

A——樣液展青霉素峰面積；YS——展青霉素標(biāo)準(zhǔn)峰面積；

V——加三氯甲烷定容體積，mL；

D——樣液點稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g；

V1——液體樣品的體積，mL。第五節(jié)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的檢驗脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和雪腐鐮刀菌烯醇的測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）三羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮可溶于水、含水甲醇、含水乙醇、乙酸乙酯等紫外光下無熒光雪腐鐮刀菌烯醇（NIV）四羥基-12,13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮易溶于水、甲醇、乙醇等極性比DON大也稱嘔吐毒素分子結(jié)構(gòu)毒性與危害衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)主要來源：DON及NIV主要是雪腐鐮刀菌污染小麥、玉米、豆餅等糧食和飼料產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。分析方法：我國規(guī)定DON的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是薄層色譜法（第一法）和免疫測定法（第二法）。其他常用的方法有GC,HPLC及微柱法。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇-薄層色譜法測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇經(jīng)提取、凈化、濃縮和硅膠G薄層展開后，加熱薄層板。由于在制備薄層板時加入了三氯化鋁，使脫氧雪腐鐮刀菌烯醇在365nm紫外光燈下顯藍色熒光，與標(biāo)準(zhǔn)比較。

本標(biāo)準(zhǔn)適合于谷物及其制品GB/T5009.111-2003提取粉碎樣品加水、三氯甲烷-無水乙醇振蕩1h過濾濾液蒸干液液分配凈化石油醚溶解殘渣再用甲醇-水分次洗滌蒸發(fā)皿甲醇-水層過中性氧化鋁、活性炭柱甲醇-水淋洗柱子沸水浴濃縮至干乙酸乙酯溶解，濃縮，備用點樣、展開、測定先點樣液橫展：使DON偏離原點（雜質(zhì)）展開劑：乙醚-丙酮或無水乙醚

對于小麥制品，還須再用10mL石油醚橫展一次。加點標(biāo)準(zhǔn)液后縱展開展開劑：三氯甲烷-丙酮-異丙醇(8:1:1)

三氯甲烷-丙酮-異丙醇-水(7.5:1:1.5:0.1)薄層上端與樣品點相對應(yīng)的位置點一個DON標(biāo)準(zhǔn)點，作為定位參考觀察365nm雜質(zhì)有熒光DON無熒光而后薄層板在130℃加熱，冷卻后如DON處無熒光，則為陰性雜質(zhì)、DON均有熒光，但是剛好分開，為陽性定量陽性樣品與不同量的標(biāo)準(zhǔn)點一起進行薄層色譜分析，比較樣品與各標(biāo)準(zhǔn)點DON點熒光強度，進行概略定量。

薄層色譜法（DON，NIV）