儀器分析+12+高效液相色譜法

第十二章高效液相色譜法

一、高效液相色譜法的特點(diǎn)

二、流程及主要部件

三、影響分離的因素

四、高效液相色譜法的主要分離類型2023/2/5概述

高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。2023/2/5一、液相色譜分離原理及分類

和氣相色譜一樣，液相色譜分離系統(tǒng)也由兩相——固定相和流動(dòng)相組成。液相色譜的固定相可以是吸附劑、化學(xué)鍵合固定相（或在惰性載體表面涂上一層液膜）、離子交換樹(shù)脂或多孔性凝膠；流動(dòng)相是各種溶劑。2023/2/5

被分離混合物由流動(dòng)相液體推動(dòng)進(jìn)入色譜柱。根據(jù)各組分在固定相及流動(dòng)相中的吸附能力、分配系數(shù)、離子交換作用或分子尺寸大小的差異進(jìn)行分離。

色譜分離的實(shí)質(zhì)是樣品分子（以下稱溶質(zhì)）與溶劑（即流動(dòng)相或洗脫液）以及固定相分子間的作用，作用力的大小，決定色譜過(guò)程的保留行為。2023/2/5

根據(jù)分離機(jī)制不同，液相色譜可分為：液固吸附色譜、液液分配色譜、化合鍵合色譜、離子交換色譜以及分子排阻色譜等類型。2023/2/5它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測(cè)器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動(dòng)化的特點(diǎn)。為了更好地了解高效液相色譜法優(yōu)越性，現(xiàn)從兩方面進(jìn)行比較：

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高效液相色譜法比起經(jīng)典液相色譜法的最大優(yōu)點(diǎn)在于高速、高效、高靈敏度、高自動(dòng)化。高速是指在分析速度上比經(jīng)典液相色譜法快數(shù)百倍。由于經(jīng)典色譜是重力加料，流出速度極慢；而高效液相色譜配備了高壓輸液設(shè)備，流速最高可達(dá)103cm·min-1。高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法2023/2/5

例如分離苯的羥基化合物，7個(gè)組分只需1min就可完成。對(duì)氨基酸分離，用經(jīng)典色譜法，柱長(zhǎng)約170cm，柱徑0.9cm，流動(dòng)相速度為30cm3·h-1，需用20多小時(shí)才能分離出20種氨基酸；而用高效液相色譜法，只需lh之內(nèi)即可完成。又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采用梯度洗脫，可在不到0.5h內(nèi)分離出尿中104個(gè)組分。2023/2/5

（l）氣相色譜法分析對(duì)象只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物，它們僅占有機(jī)物總數(shù)的20％。對(duì)于占有機(jī)物總數(shù)近80％的那些高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)，目前主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分離和分析。

高效液相色譜法與氣相色譜法2023/2/5（2）液相色譜能完成難度較高的分離工作，因?yàn)椋?/p>

①氣相色譜的流動(dòng)相載氣是色譜惰性的，不參與分配平衡過(guò)程，與樣品分子無(wú)親和作用，樣品分子只與固定相相互作用。而在液相色譜中，流動(dòng)相液體也與固定相爭(zhēng)奪樣品分子，為提高選擇性增加了一個(gè)因素。也可選用不同比例的兩種或兩種以上的液體作流動(dòng)相，增大分離的選擇性。2023/2/5

②液相色譜固定相類型多，如離子交換色譜和排阻色譜等。作為分析時(shí)選擇余地大；而氣相色譜不太可能的。③液相色譜通常在室溫下操作，較低的溫度，一般有利于色譜分離條件的選擇。2023/2/5（3）由于液體的擴(kuò)散性比氣體的小105倍，因此，溶質(zhì)在液相中的傳質(zhì)速率慢，柱外效應(yīng)就顯得特別重要；而在氣相色譜中，柱外區(qū)域擴(kuò)張可以忽略不計(jì)。（4）液相色譜中制備樣品簡(jiǎn)單，回收樣品也比較容易，而且回收是定量的，適合于大量制備。但液相色譜尚缺乏通用的檢測(cè)器，儀器比較復(fù)雜，價(jià)格昂貴。在實(shí)際應(yīng)用中，這兩種色譜技術(shù)是互相補(bǔ)充的。2023/2/5

目前高效液相色譜法已被廣泛應(yīng)用于分析對(duì)生物學(xué)和醫(yī)藥上有重大意義的大分子物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、多糖類、植物色素、高聚物、染料及藥物等物質(zhì)的分離和分析。高效液相色譜法的儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格，這是它的主要缺點(diǎn)。2023/2/5

高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)示意如下圖。一般可分為4個(gè)主要部分：高壓輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)和檢測(cè)系統(tǒng)。此外還配有輔助裝置：如梯度淋洗，自動(dòng)進(jìn)樣及數(shù)據(jù)處理等。高效液相色譜儀2023/2/52023/2/52023/2/5

其工作過(guò)程如下：首先高壓泵將貯液器中流動(dòng)相溶劑經(jīng)過(guò)進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時(shí)，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動(dòng)相將樣品同時(shí)帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測(cè)器，記錄儀將檢測(cè)器送出的信號(hào)記錄下來(lái)，由此得到液相色譜圖。2023/2/5高效液相色譜儀12023/2/5高效液相色譜儀22023/2/5高效液相色譜儀32023/2/5高效液相色譜儀42023/2/5一、高效液相色譜法的特點(diǎn)2023/2/51.流程二、流程及主要部件2023/2/52.主要部件：（1）高壓輸液泵：主要部件之一，壓力：150～350×105

Pa應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性。2023/2/5

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對(duì)流動(dòng)相阻力很大，為使流動(dòng)相較快流動(dòng)，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲(chǔ)液罐、高壓輸液泵、過(guò)濾器、壓力脈動(dòng)阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。2023/2/5對(duì)于一個(gè)好的高壓輸液泵應(yīng)符合密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等要求。常用的輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種。2023/2/5

恒流泵特點(diǎn)是在一定操作條件下，輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)；

恒壓泵是指能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差，它們各有優(yōu)缺點(diǎn)。目前恒流泵正逐漸取代恒壓泵。恒流泵又稱機(jī)械泵，它又分機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵兩種，應(yīng)用最多的是機(jī)械往復(fù)泵。2023/2/5

高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm），所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測(cè)器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起柱前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對(duì)進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。

（2）進(jìn)樣系統(tǒng)2023/2/5

流路中為高壓力工作狀態(tài)，通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置，其結(jié)構(gòu)如圖所示：

進(jìn)樣裝置2023/2/5

色譜柱是液相色譜的心臟部件，它包括柱管與固定相兩部分。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。一般色譜柱長(zhǎng)5～30cm，內(nèi)徑為4～5mm，凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備柱內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。（3）分離系統(tǒng)—色譜柱2023/2/5

一般在分離前備有一個(gè)前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑由于經(jīng)過(guò)前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過(guò)分離柱時(shí)不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。

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柱子裝填得好壞對(duì)柱效影響很大。對(duì)于細(xì)粒度的填料（＜20μm）一般采用勻漿填充法裝柱，先將填料調(diào)成勻漿，然后在高壓泵作用下，快速將其壓入裝有洗脫液的色譜柱內(nèi)，經(jīng)沖洗后，即可備用。2023/2/5

柱體為直型不銹鋼管，發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。高效分離柱2023/2/5

作用——用來(lái)連續(xù)監(jiān)測(cè)經(jīng)色譜柱分離后的流出物的組成和含量變化的裝置。

在液相色譜中，有兩種基本類型的檢測(cè)器。一類是溶質(zhì)性檢測(cè)器，它僅對(duì)被分離組分的物理或化學(xué)特性有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有紫外、熒光、電化學(xué)檢測(cè)器等。（4）檢測(cè)系統(tǒng)2023/2/5

另一類是總體檢測(cè)器，它對(duì)試樣和洗脫液總的物理或化學(xué)性質(zhì)有響應(yīng)，屬于這類檢測(cè)器的有示差折光，電導(dǎo)檢測(cè)器等?，F(xiàn)將常用的檢測(cè)器介紹如下:2023/2/5

目前最常用的檢測(cè)器主要有：紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器熒光檢測(cè)器電化學(xué)檢測(cè)器蒸發(fā)光散射檢測(cè)器質(zhì)譜檢測(cè)器2023/2/51.紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器檢測(cè)室光源光柵二極管陣列檢測(cè)器2023/2/5

紫外光度檢測(cè)器（UV）：最小檢測(cè)量10-9g·mL-1，對(duì)流量和溫度的波動(dòng)不敏感，可用于梯度洗脫。2023/2/52.熒光檢測(cè)器 許多有機(jī)化合物，特別是芳香族化合物、被一定強(qiáng)度和波長(zhǎng)的紫外光照射后，發(fā)射出較激發(fā)光波長(zhǎng)要長(zhǎng)的熒光。

特點(diǎn)：有非常高的靈敏度和良好的選擇性，靈敏度要比紫外檢測(cè)法高23個(gè)數(shù)量級(jí)，特別適合于藥物和生物化學(xué)樣品的分析。2023/2/5熒光檢測(cè)器結(jié)構(gòu)示意圖光源檢測(cè)器濾光片檢測(cè)室2023/2/53.蒸發(fā)光散射檢測(cè)器

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器適合于無(wú)紫外吸收、無(wú)電活性和不發(fā)熒光的樣品的檢測(cè)。2023/2/54.電化學(xué)檢測(cè)器（以電導(dǎo)檢測(cè)器為例）電導(dǎo)儀電極電極2023/2/5

5.示差折光率檢測(cè)器

幾乎所有物質(zhì)都有各自不同的折射率，因此差示折光檢測(cè)器是一種通用型檢測(cè)器。靈敏度可達(dá)10-7g·cm-3。主要缺點(diǎn)是對(duì)溫度變化敏感，并且不能用于梯度淋洗。

2023/2/52023/2/5

(5)附屬系統(tǒng)它包括脫氣、梯度淋洗、恒溫、自動(dòng)進(jìn)樣、餾分收集以及數(shù)據(jù)處理等裝置。其中梯度淋洗裝置是高壓液相色譜儀中尤為重要的附屬裝置。2023/2/5梯度洗脫裝置

梯度洗脫就是在分離過(guò)程中使兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，從而使流動(dòng)相的強(qiáng)度、極性、pH值或離子強(qiáng)度相應(yīng)地變化，達(dá)到提高分離效果，縮短分析時(shí)間的目的。

2023/2/5梯度洗脫裝置分為兩類：一類是外梯度裝置（又稱低壓梯度），流動(dòng)相在常溫常壓下混合，用高壓泵壓至柱系統(tǒng)，僅需一臺(tái)泵即可。另一類是內(nèi)梯度裝置（又稱高壓梯度），將兩種溶劑分別用泵增壓后，按電器部件設(shè)置的程序，注入梯度混合室混合，再輸至柱系統(tǒng)。2023/2/5流動(dòng)相中含有兩種或兩種以上的不同性極性的溶劑，在梯度過(guò)程連續(xù)或間斷改變流動(dòng)相的組成，以調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，使每個(gè)流出的組分有適當(dāng)?shù)娜萘恳蜃觡'，并將樣品中的所有組分可在最短的分析時(shí)間內(nèi)得到圓滿分離。

梯度洗脫目的：提高柱效、縮短分析時(shí)間、改善監(jiān)測(cè)器靈敏度。

2023/2/5

梯度洗脫的實(shí)質(zhì)是通過(guò)不斷地變化流動(dòng)相的強(qiáng)度，來(lái)調(diào)整混合樣品中各組分的k值，使所有譜帶都以最佳平均k值通過(guò)色譜柱。它在液相色譜中所起的作用相當(dāng)于氣相色譜中的程序升溫。所不同的是，在梯度洗脫中溶質(zhì)k值的變化是通過(guò)溶質(zhì)的極性、pH值和離子強(qiáng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而不是借改變溫度（溫度程序）來(lái)達(dá)到。2023/2/5在線脫氣裝置在線脫氣裝置用于脫去流動(dòng)相中的溶解氣體，流動(dòng)相先經(jīng)過(guò)脫氣裝置再輸送到色譜柱。除在線脫氣裝置外，目前也采用超聲脫氣、真空脫氣等方式。

脫氣不好時(shí)有氣泡，導(dǎo)致流動(dòng)相流速不穩(wěn)定，造成基線飄移，噪音增加。2023/2/5

在高效液相色譜中,速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，而只有渦流擴(kuò)散和傳質(zhì)阻力項(xiàng)兩項(xiàng)，即：

H=A+Cu

故液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：影響分離的主要因素有流動(dòng)相的流量、性質(zhì)和極性。三、影響分離的因素2023/2/52023/2/5流速：流速大于0.5cm/s時(shí),H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。影響分離的因素2023/2/5

固定相及分離柱：氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。

高效液相色譜的固定相和流動(dòng)相

2023/2/5（－）固定相

高效液相色譜固定相以承受高壓能力來(lái)分類，可分為剛性固體和硬膠兩大類。剛性固體以二氧化硅為基質(zhì)，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高壓，可制成直徑、形狀、孔隙度不同的顆粒。如果在二氧化硅表面鍵合各種官能團(tuán)，就是鍵合固定相，可擴(kuò)大應(yīng)用范圍，它是目前最廣泛使用的一種固定相。2023/2/5

硬膠主要用于離子交換和尺寸排阻色譜中，它由聚苯乙烯與二乙烯苯基交聯(lián)而成?？沙惺軌毫ι舷逓?.5×108Pa。固定相按孔隙深度分類，可分為表面多孔型和全多孔型固定相兩類。2023/2/51.表面多孔型固定相

它的基體是實(shí)心玻璃珠，在玻璃球外面覆蓋一層多孔活性材料，如硅膠、氧化鋁、離子交換劑、分子篩、聚酸胺等。

表面活性材料為氧化鋁的固定相，這類固定相的多孔層厚度小、孔淺，相對(duì)死體積小，出峰迅速、柱效亦高；顆粒較大，滲透性好，裝柱容易，梯度淋洗時(shí)能迅速達(dá)平衡，較適合做常規(guī)分析。由于多孔層厚度薄，最大允許量受限制。2023/2/52．全多孔型固定相

它由直徑為10nm的硅膠微粒凝聚而成。也可由氧化鋁微粒凝聚成全多孔型固定相，

這類固定相由于顆粒很細(xì)（5～10μm），孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析。2023/2/5

2023/2/5流動(dòng)相及流動(dòng)相的極性

（1）可顯著改變組分分離狀況的流動(dòng)相選擇在液相色譜中顯得特別重要。液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。（2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。

2023/2/5（3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/2/5流動(dòng)相組成流動(dòng)相按組成不同可分為單組分和多組分；按極性可分為極性、弱極性、非極性；按使用方式有固定組成淋洗和梯度淋洗。常用溶劑:烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。2023/2/5（二）流動(dòng)相

由于高效液相色譜中流動(dòng)相是液體，它對(duì)組分有親和力，并參與固定相對(duì)組分的競(jìng)爭(zhēng)。因此，正確選擇流動(dòng)相直接影響組分的分離度。對(duì)流動(dòng)相溶劑的要求是：

（1）溶劑對(duì)于待測(cè)樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性。

（2）溶劑要與檢測(cè)器匹配。

2023/2/5（3）高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長(zhǎng)值增加50～1OOnm。（4）化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑。（5）低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過(guò)于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測(cè)器內(nèi)形成氣泡，影響分離。2023/2/5

對(duì)于紫外吸收檢測(cè)器，應(yīng)注意選用檢測(cè)器波長(zhǎng)比溶劑的紫外截止波長(zhǎng)要長(zhǎng)。所謂溶劑的紫外截止波長(zhǎng)指當(dāng)小于截止波長(zhǎng)的輻射通過(guò)溶劑時(shí)，溶劑對(duì)此輻射產(chǎn)生強(qiáng)烈吸收，此時(shí)溶劑被看作是光學(xué)不透明的，它嚴(yán)重干擾組分的吸收測(cè)量。表12-2列出了一些常用溶劑的紫外截止波長(zhǎng)。對(duì)于折光率檢測(cè)器，要求選擇與組分折光率有較大差別的溶劑作流動(dòng)相，以達(dá)最高靈敏度。

2023/2/52023/2/5高效液相色譜法的主要分離類型1.吸附色譜（液-固吸附色譜）：以固體吸附劑為固定相，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑。流動(dòng)相可以是各種不同極性的一元或多元溶劑。2.分配色譜（液-液分配色譜）：早期通過(guò)在擔(dān)體上涂漬一薄層固定液制備固定相,現(xiàn)多為化學(xué)鍵合固定相，即用化學(xué)反應(yīng)的方法通過(guò)化學(xué)鍵將固定液結(jié)合在擔(dān)體表面。2023/2/53.離子交換色譜：固定相為離子交換樹(shù)脂，流動(dòng)相為無(wú)機(jī)酸或無(wú)機(jī)堿的水溶液。各種離子根據(jù)它們與樹(shù)脂上的交換基團(tuán)的交換能力的不同而得到分離。4.凝膠色譜（空間排阻色譜）：以凝膠為固定相。凝膠是一種經(jīng)過(guò)交聯(lián)的、具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和不同孔徑的多聚體的通稱。如葡聚糖凝膠、瓊脂糖等軟質(zhì)凝膠；多孔硅膠、聚苯乙烯凝膠等硬質(zhì)凝膠；2023/2/5高效液相色譜法的

主要類型及選擇（－）液一液分配色譜法（LLPC）

在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無(wú)論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物。2023/2/51.分離原理液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分。

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2.固定相由于液液色譜中流動(dòng)相參與選擇競(jìng)爭(zhēng)，因此，對(duì)固定相選擇較簡(jiǎn)單。只需使用幾種極性不同的固定液即可解決分離問(wèn)題。例如，最常用的強(qiáng)極性固定液β，β′一氧二丙睛，中等極性的聚乙二醇，非極性的角鯊?fù)榈取?/p>

2023/2/53.流動(dòng)相在液液色譜中為了避免固定液的流失。對(duì)流動(dòng)相的一個(gè)基本要求是流動(dòng)相盡可能不與固定相互溶，而且流動(dòng)相與固定相的極性差別越顯著越好。根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜。2023/2/5

如果采用流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相分配色譜，它適用于極性化合物的分離。其流出順序是極性小的先流出，極性大的后流出。如果采用流動(dòng)相的極性大于固定相的極性，稱為反相分配色譜。它適用于非極性化合物的分離，其流出順序與正相色譜恰好相反。

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為了更好解決固定液在載體上流失問(wèn)題。產(chǎn)生了化學(xué)鍵合固定相。它是將各種不同有機(jī)基團(tuán)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)鍵合到載體表面的一種方法。它代替了固定液的機(jī)械涂漬，因此它的產(chǎn)生對(duì)液相色譜法迅速發(fā)展起著重大作用，可以認(rèn)為它的出現(xiàn)是液相色譜法的一個(gè)重大突破。它是目前應(yīng)用最廣泛的一種固定相。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有3/4以上的分離問(wèn)題是在化學(xué)鍵合固定相上進(jìn)行的。2023/2/5（二）化學(xué)鍵合相色譜法（CBPC）

采用化學(xué)鍵合相的液相色譜稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜。由于鍵合固定相非常穩(wěn)定，在使用中不易流失，適用于梯度淋洗，特別適用于分離容量因子k值范圍寬的樣品。由于鍵合到載體表面的官能團(tuán)可以是各種極性的，因此它適用于種類繁多樣品的分離。2023/2/51.鍵合固定相類型用來(lái)制備鍵合固定相的載體，幾乎都用硅膠。利用硅膠表面的硅醇基(Si一OH)與有機(jī)分可成鍵,即可得到各種性能的固定相。一般可分三類（1）疏水基團(tuán)如不同鏈長(zhǎng)的烷烴（C8和C18）和苯基等；（2）極性基團(tuán)如氨丙基，氰乙基、醚和醇等；（3）離子交換基團(tuán)如作為陰離子交換基團(tuán)的胺基，季銨鹽；作為陽(yáng)離子交換基團(tuán)的磺酸等。2023/2/52.鍵合固定相的制備（l）硅酸酯（≡Si一OR）鍵合固定相,它是最先用于液相色譜的健合固定相。用醇與硅醇基發(fā)生酯化反應(yīng)：

≡Si－0H＋ROH→≡Si－OR＋H20

由于這類鍵合固定相的有機(jī)表面是一些單體，具有良好的傳質(zhì)特性,但這些酯化過(guò)的硅膠填料易水解且受熱不穩(wěn)定，因此僅適用于不含水或醇的流動(dòng)相。2023/2/5（2）≡Si－C或Si一N共價(jià)鍵合固定相制備反應(yīng)如下：

2023/2/5共價(jià)鍵健合固定相不易水解，并且熱穩(wěn)定較硅酸酯好。缺點(diǎn)是格氏反應(yīng)不方便；當(dāng)使用水溶液時(shí)，必須限制pH在4～8范圍內(nèi)。2023/2/5（3）硅烷化（≡Si—O－Si－C）鍵合固定相制備反應(yīng)如下：

這類鍵會(huì)固定相具有熱穩(wěn)定好，不易吸水，耐有機(jī)溶劑的優(yōu)點(diǎn)。能在70℃以下，pH=2～8范圍內(nèi)正常工作，應(yīng)用較廣泛。2023/2/53．反相鍵合相色譜法

此法的固定相是采用極性較小的鍵合固定相，如硅膠一C18H37、硅膠一苯基等；流動(dòng)相是采用極性較強(qiáng)的溶劑，如甲醇、乙睛一水、水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖溶液等。它多用于分離多環(huán)芳烴等低極性化合物；2023/2/5

若采用含一定比例的甲醇或乙睛的水溶液為流動(dòng)相，也可用于分離極性化合物；若采用水和無(wú)機(jī)鹽的緩沖液為流動(dòng)相，則可分離一些易離解的樣品，如有機(jī)酸、有機(jī)堿、酚類等。反相鍵合相色譜法具有柱效高，能獲得無(wú)拖尾色譜峰的優(yōu)點(diǎn)。

2023/2/5

關(guān)于反相鍵合相色譜的分離機(jī)理，可用所謂疏溶劑作用理論來(lái)解釋。這種理論把非極性的烷基鍵合相看作一層鍵合在硅膠表面上的十八烷基的“分子毛”，這種“分子毛”有較強(qiáng)的疏水特性。當(dāng)用極性溶劑為流動(dòng)相來(lái)分離含有極性官能團(tuán)的有機(jī)化合物時(shí)：

2023/2/5

一方面，分子中的非極性部分與固定相表面上的疏水烷基產(chǎn)生締合作用，使它保留在固定相中；而另一方面，被分離物的極性部分受到極性流動(dòng)相的作用，促使它離開(kāi)固定相，并減小其保留作用（見(jiàn)圖12-4）。顯然，兩種作用力之差，決定了分子在色譜中的保留行為。2023/2/52023/2/54.正相鍵合相色譜法

此法是以極性的有機(jī)基團(tuán)，CN、NH2。雙羥基等鍵合在硅膠表面，作為固定相；而以非極性或極性小的溶劑（如烴類）中加入適量的極性溶劑（如氯仿、醇、乙腈等）為流動(dòng)相，分離極性化合物。2023/2/5

此時(shí)，組分的分配比k值隨其極性的增加而增大，但隨流動(dòng)相極性的增加而降低。這種色譜方法主要用于分離異構(gòu)體、極性不同的化合物，特別適用于分離不同類型的化合物。2023/2/55.離子性鍵合相色譜法

當(dāng)以薄殼型或全多孔微粒型硅膠為基質(zhì)，化學(xué)鍵合各種離子交換基團(tuán)，如一SO3H一CH2NH2、－C00H、一CH2N（CH3）等時(shí)，就形成了離子性鍵合相色譜的固定相；流動(dòng)相一般采用緩沖溶液。其分離原理與離子交換色譜類同。

2023/2/5

以上討論了各種類型化學(xué)鍵合相色譜法，歸納鍵合相色譜的最大優(yōu)點(diǎn)是：通過(guò)改變流動(dòng)相的組成和種類，可有效地分離各種類型化合物（非極性、極性和離子型）。2023/2/5

此外，由于鍵合到載體上的基團(tuán)不易流失，特別適用于梯度淋洗。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在高效液相色譜法中，約有8O％的分離問(wèn)題是用鍵合相色譜法解決。此法的最大缺點(diǎn)是不能用于酸、堿度過(guò)大或存在氧化劑的緩沖溶液作流動(dòng)相的體系。如何根據(jù)樣品極性種類來(lái)選擇化學(xué)鍵合的固定相，請(qǐng)參看表12-3。2023/2/5

2023/2/5（三）液一固吸附色譜法(LSAC)

液一固吸附色譜是以固體吸附劑作為固定相，吸附劑通常是些多孔的固體顆粒物質(zhì)，在它們的表面存在吸附中心。液固色譜實(shí)質(zhì)是根據(jù)物質(zhì)在固定相上的吸附作用不同來(lái)進(jìn)行分離的。1．分離原理

2023/2/5

當(dāng)流動(dòng)相通過(guò)固定相（吸附劑）時(shí)，吸附劑表面的活性中心就要吸附流動(dòng)相分子。同時(shí)，當(dāng)試樣分子（X）被流動(dòng)相帶入柱內(nèi)，只要它們?cè)诠潭ㄏ嘤幸欢ǔ潭鹊谋Ａ艟鸵〈鷶?shù)目相當(dāng)?shù)囊驯晃降牧鲃?dòng)相溶劑分用）于是，在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附:

X+nSad=Xad+nS2023/2/5

達(dá)平衡時(shí),有

其中Kad為吸附平衡常數(shù)，值大表示組分在吸附劑上保留強(qiáng)，難于洗脫。Kad值小,則保留值弱，易于洗脫。試樣中各組分據(jù)此得以分離。Kad值可通過(guò)吸附等溫線數(shù)據(jù)求出。2023/2/52.固定相

吸附色譜所用固定相多是一些吸附活性強(qiáng)弱不等的吸附劑，如硅膠、氧化鋁、聚酸膠等。由于硅膠的優(yōu)點(diǎn)較多，如線性容量較高，機(jī)械性能好，不溶脹，與大多數(shù)試樣不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)等，因此，以硅膠用得最多。

2023/2/5

在高效液相色譜法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色譜中的固定相，它們具有填料均勻、粒度小?？籽\的優(yōu)點(diǎn)，能極大地提高柱效。但表面多孔型由于試樣容量較小，目前最廣泛使用的還是全多孔型微粒填料。2023/2/53流動(dòng)相

一般把吸附色譜中流動(dòng)相稱作洗脫劑。在吸附色譜中對(duì)極性大的試樣往往采用極性強(qiáng)的洗脫劑；對(duì)極性弱的試樣宜用極性弱的洗脫劑。洗脫劑的極性強(qiáng)弱可用溶劑強(qiáng)度參數(shù)（ε0）來(lái)衡量，ε0越大，表示洗脫劑的極性越強(qiáng)。2023/2/5下表列出一些常用溶劑在氧化鋁吸附劑中的ε0值。在硅膠吸附劑中ε0值的順序相同，數(shù)值可換算（ε0硅膠=0.77×ε0氧化鋁）。2023/2/5

液固色譜最適宜分離那些溶解在非極性溶劑中、具有中等相對(duì)分子質(zhì)量且為非離子型的試樣。特別適用于分離異構(gòu)體。2023/2/5(四）離子交換色譜法（IEC）

此法是利用離子交換原理和液相色譜技術(shù)的結(jié)合來(lái)測(cè)定溶液中陽(yáng)離子和陰離子的一種分離分析方法。凡在溶液中能夠電離的物質(zhì)，通常都可用離子交換色譜法進(jìn)行分離。它不僅適用無(wú)機(jī)離子混合物的分離，亦可用于有機(jī)物的分離，例如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子。因此，應(yīng)用范圍較廣。

2023/2/51．離子交換原理離子交換色譜法是利用不同待測(cè)離子對(duì)固定相親和力的差別來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。

其固定相采用離子交換樹(shù)脂，樹(shù)脂上分布有固定的帶電荷基團(tuán)和可游離的平衡離子。2023/2/5陽(yáng)離子交換：

當(dāng)待分析物質(zhì)電離后產(chǎn)生的離子可與樹(shù)脂上可游離的平衡離子進(jìn)行可逆交換，其交換反應(yīng)通式如下：2023/2/5一般形式：R一A＋B＝R－B＋A

達(dá)平衡時(shí)，以濃度表示的平衡常數(shù)（離子交換反應(yīng)的選擇系數(shù)）：

2023/2/5

式中[A]r，[B]r分別代表樹(shù)脂相中洗脫劑離子（A）和試樣離子（B）的濃度，[A]、[B]則代表它們?cè)谌芤褐械臐舛?。離子交換反應(yīng)的選擇性系數(shù)表示試樣離子B對(duì)于A型樹(shù)脂親和力的大小：KB/A越大，說(shuō)明B離子交換能力越大，越易保留而難于洗脫。一般說(shuō)來(lái)，B離子電荷越大，水合離子半徑越小，KB/A值就越大。2023/2/5

對(duì)于典型的磺酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，

一價(jià)離子的KB/A值按以下順序：

Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li+

二價(jià)離子的順序?yàn)椋?/p>

Ba2+＞Pb2+＞Sr2+＞Ca2+＞Cd2+＞Cu2+，Zn2+＞Mg2+2023/2/5

對(duì)于季銨型強(qiáng)堿陰離子交換樹(shù)指，各陰離子的選擇性順序?yàn)椋?/p>

ClO4-＞I-＞HS04-＞SCN-＞NO2-＞Br-＞CN-＞Cl-＞BrO3-＞OH-＞HCO3-＞H2P04-＞IO3-＞CH3COO－＞F－

2023/2/52.固定相

作為固定相的離子交換劑，其基質(zhì)大致有三大類：合成樹(shù)脂（聚苯乙烯）、纖維素和硅膠。而離子交換劑又有陽(yáng)離子和陰離子之分。再根據(jù)官能基的離解度大小還有強(qiáng)弱之分（見(jiàn)下表）。

2023/2/52023/2/5

常用的離子交換劑固定相大致可分以下幾種：

（l）多孔型離子交換樹(shù)脂---它主要是聚苯乙烯和二乙烯苯基的交聯(lián)聚合物，直徑約為5～20μm，有微孔型和大孔型之分；（2）薄膜型離子交換樹(shù)脂

---它是在直徑約為30μm的固體惰性核上，凝聚1～2μm厚的樹(shù)脂層；2023/2/5（3）表面多孔型離子交換樹(shù)脂---它是在固體惰性核上，覆蓋一層微球硅膠，再在上面涂一層很薄的離子交換樹(shù)脂；（4）離子交換鍵合固定相---它是用化學(xué)反應(yīng)將離子交換基團(tuán)鍵合到惰性載體表面。它也分為兩種類型：2023/2/5一種是鍵合薄殼型，其載體是薄殼玻珠。另一種是鍵合微粒載體型，它的載體是多孔微粒硅膠。后者是一種優(yōu)良的離子交換固定相，它的優(yōu)點(diǎn)是機(jī)械性能穩(wěn)定，可使用小粒度固定相和高柱壓來(lái)實(shí)現(xiàn)快速分離。2023/2/53．流動(dòng)相

離子交換色譜法所用流動(dòng)相大都是一定pH和鹽濃度（或離子強(qiáng)度）的緩沖溶液。

通過(guò)改變流動(dòng)相中鹽離子的種類、濃度和pH值可控制k值，改變選擇性。如果增加鹽離子的濃度，則可降低樣品離子的競(jìng)爭(zhēng)吸附能力，從而降低其在固定相上的保留值。2023/2/5一般，對(duì)于陰離子交換樹(shù)脂來(lái)說(shuō)陰離子的滯留次序?yàn)椋?/p>

檸檬酸離子＞SO42－＞C2O42-＞I-＞NO3-＞CrO42-＞Br-＞SCN-＞Cl-＞HCOO-＞CH3C00-＞OH-＞F-

所以用檸檬酸離子洗脫要比用氟離子快。陽(yáng)離子的滯留次序大為：

Ba2+＞Pb2+＞Ca2+＞Ni2+＞Cd2+＞Cu2+＞Co2+＞Zn2+＞Mg＞Ag+＞Cs+＞Rb+＞K+＞NH4+＞Na+＞H+＞Li十2023/2/5

但差別不如陰離子明顯。關(guān)于pH值的影響，要視不同情況而定。例如，分離有機(jī)酸和有機(jī)堿時(shí)，這些酸堿的離解程度可通過(guò)改變流動(dòng)相的pH值來(lái)控制。增大pH值會(huì)使酸的電離度增加，使堿的電離度減少；降低PH值，其結(jié)果相反。但無(wú)論屬于哪種情況，只要電離度增大，就會(huì)使樣品的保留增大。

2023/2/5（五）離子色譜法（IC）

離子色譜法是由離子交換色譜法派生出來(lái)的一種分離方法。由于離子交換色譜法在無(wú)機(jī)離子的分析和應(yīng)用受到限制。例如，對(duì)于那些不能采用紫外檢測(cè)器的被測(cè)離子，如采用電導(dǎo)檢測(cè)器，由于被測(cè)離子的電導(dǎo)信號(hào)被強(qiáng)電解質(zhì)流動(dòng)相的高背景電導(dǎo)信號(hào)掩沒(méi)而無(wú)法檢測(cè)。2023/2/5

為了解決這一問(wèn)題，1975年Small等人提出一種能同時(shí)測(cè)定多種無(wú)機(jī)和有機(jī)離子的新技術(shù)。他們?cè)陔x子交換分離柱后加一根抑制柱。

抑制柱中裝填與分離柱電荷相反的離子交換樹(shù)脂。通過(guò)分離柱后的樣品再經(jīng)過(guò)抑制柱，使具有高背景電導(dǎo)的流動(dòng)相轉(zhuǎn)變成低背景電導(dǎo)的流動(dòng)相，2023/2/5

從而用電導(dǎo)檢測(cè)器可直接檢測(cè)各種離子的含量。這種色譜技術(shù)稱為離子色譜。若樣品為陽(yáng)離子，用無(wú)機(jī)酸作流動(dòng)相，抑制柱為高容量的強(qiáng)堿性陰離子交換劑。當(dāng)試樣經(jīng)陽(yáng)離子交換劑的分離柱后，隨流動(dòng)相進(jìn)入抑制柱，在抑制柱中發(fā)生兩個(gè)重要反應(yīng)：2023/2/5

R+－OH＋H+Cl--→R+－Cl十H2OR+一OH-＋M+Cl--→M+OH－＋R+－Cl-

由反應(yīng)可見(jiàn)：經(jīng)抑制柱后，一方面將大量酸轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼?dǎo)很小的水，消除了流動(dòng)相本底電導(dǎo)的影響。同時(shí)，又將樣品陽(yáng)離子M+轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的堿，由于OH-離子的淌度為Cl-離子的2.6倍，提高了所測(cè)陽(yáng)離子電導(dǎo)的檢測(cè)靈敏度。對(duì)于陰離子樣品也有相似的作用機(jī)理。

2023/2/5

在分離柱后加一個(gè)抑制柱的離子色譜亦稱為抑制型離子色譜或稱雙柱離子色譜。由于抑制柱要定期再生，而且譜帶在通過(guò)抑制柱后會(huì)加寬，降低了分離度。后來(lái)，F(xiàn)rits等人提出采用非抑制柱的離子色譜體系，而采用了電導(dǎo)率極低的溶液，例如1×10-4～5×10-4mol·dm-3苯甲酸鹽或鄰苯二甲酸鹽的稀溶液作流動(dòng)相，稱為非抑制型離子色譜或單柱離子色譜。2023/2/5（六）離子對(duì)色譜法（IPC）

離子對(duì)色譜法是分離分析強(qiáng)極性有機(jī)酸和有機(jī)堿的極好方法。

它是離子對(duì)萃取技術(shù)與色譜法相結(jié)合的產(chǎn)物。在20世紀(jì)7O年代中期，Schill等人首先提出離子對(duì)色譜法，后來(lái)，這種方法得到十分迅速的發(fā)展。2023/2/51．離子對(duì)色譜法原理

離子對(duì)色譜法是將一種（或數(shù)種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（稱對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相或固定相中，使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成離子對(duì)，從而控制溶質(zhì)離子保留行為的一種色譜法。2023/2/5

關(guān)于離子對(duì)色譜機(jī)理，至今仍不十分明確，已提出三種機(jī)理：

1.離子對(duì)形成機(jī)理；2.離子交換機(jī)理；3.離子相互作用機(jī)理?，F(xiàn)以離子對(duì)形成機(jī)理說(shuō)明之。假如有一離子對(duì)色譜體系，固定相為非極性鍵合相，流動(dòng)相為水溶液，并在其中加入一種電荷與組分離子A-相反的離子B+，2023/2/5

B+離子由于靜電引力與帶負(fù)電的A組分離子生成離子對(duì)化合物A-B+。離子對(duì)生成反應(yīng)式

2023/2/5

由于離子對(duì)化合物A-B+具有疏水性，因而被非極性固定相（有機(jī)相）提取。組分離子的性質(zhì)不同，它與反離子形成離子對(duì)的能力大小不同以及形成的離子對(duì)疏水性質(zhì)不同，導(dǎo)致各組分離子在固定相中滯留時(shí)間不同，因而出峰先后不同。這就是離子對(duì)色譜法分離的基本原理。2023/2/5

2.鍵合相反相離子對(duì)色譜法離子對(duì)色譜法類型很多，根據(jù)流動(dòng)相和固定相的極性可分為反相離子對(duì)和正相離子對(duì)色譜法。其中以鍵合相離子對(duì)色譜法最重要。這種色譜法的固定相采用非極性的疏水鍵合相［如十八烷基鍵合相（ODS）等］，流動(dòng)相為加有平衡離子（反離子）的極性溶液（如甲醇一水或乙睛一水）。

2023/2/5根據(jù)離子對(duì)生成反應(yīng)式，平衡常數(shù)KAB可表示為

根據(jù)定義，溶質(zhì)的分配系數(shù)

2023/2/5根據(jù)上兩式，有

式中β為相比率。容量因子k隨KAB和[B+]水相的增大而增大。

2023/2/5

鍵合相反相離子對(duì)色譜法操作簡(jiǎn)便，只要改變流動(dòng)相的pH值、平衡離子的濃度和種類，就可在較大范圍內(nèi)改變分離的選擇性，能較好解決難分離混合物的分離問(wèn)題。此法發(fā)展迅速，應(yīng)用較廣泛。2023/2/5（七）尺寸排阻色譜法（SEC）

尺寸排阻色譜法又稱凝膠色譜法，主要用于較大分子的分離。與其他液相色譜方法原理不同，它不具有吸附、分配和離子交換作用機(jī)理，而是基于試樣分子的尺寸和形狀不同來(lái)實(shí)現(xiàn)分離的。2023/2/5尺寸排阻色譜被廣泛應(yīng)用于大分子的分級(jí)，即用來(lái)分析大分子物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的分布。它具有其他液相色譜所沒(méi)有的特點(diǎn)：（1）保留時(shí)間是分子尺寸的函數(shù)，有可能提供分子結(jié)構(gòu)的某些信息；（2）保留時(shí)間短，譜峰窄，易檢測(cè)，可采用靈敏度較低的檢測(cè)器；2023/2/5（3）固定相與分子間作用力極弱，趨于零。由于柱子不能很強(qiáng)保留分子，因此柱壽命長(zhǎng)；（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相對(duì)分子質(zhì)量差別必須大于10％才能得以分離。2023/2/5

1.分離原理尺寸排阻色譜是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。其固定相為化學(xué)情性多孔物質(zhì)——凝膠，它類似于分子篩，但孔徑比分子篩大。凝膠內(nèi)具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早地被淋洗出來(lái)；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。2023/2/5