電化學(xué)生物傳感器

指導(dǎo)老師：顧婷婷制作人：李霞電化學(xué)生物傳感器基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器DNA電化學(xué)傳感器原理及結(jié)構(gòu)DNA生物傳感器基本的原理是DNA堿基的互補(bǔ)配對(duì)，通過電極表面固定的已知捕獲DNA序列與檢測(cè)樣本中DNA的互補(bǔ)配對(duì)作用形成可傳遞電子的雙鏈DNA，從電極上電信號(hào)的變化來對(duì)樣本中的DNA進(jìn)行定性檢測(cè)，當(dāng)加入樣本中的DNA序列與捕獲探針上的序列存在非配對(duì)現(xiàn)象，則電子傳遞鏈斷開，產(chǎn)生的電信號(hào)就很微弱，因此通過電信號(hào)變化就可以檢測(cè)出樣本中是否存在突變。DNA電化學(xué)傳感器一般是由敏感元件即生物敏感膜、轉(zhuǎn)換元件即轉(zhuǎn)換器、信號(hào)輸出三個(gè)部分組成。其中敏感元件和轉(zhuǎn)換元件是生物傳感器最主要的兩個(gè)部分。DNA電化學(xué)傳感器特點(diǎn)成本低設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單設(shè)備小巧能耗低靈敏度高靈敏度更高納米材料特點(diǎn)比表面積大表面反應(yīng)活性高活性位點(diǎn)豐富催化效率高吸附能力強(qiáng)易于微型化特異性更強(qiáng)單壁碳納米管(SWNTs)作為一種新型的碳納米材料，其高的長(zhǎng)徑比、大的比表面積有利于負(fù)載大量的探針分子，且其超高的導(dǎo)電性能，能在電化學(xué)傳感檢測(cè)中起到催化作用，從而提高分析靈敏度。但由于

SWNTs本身是非水溶性碳材料，且缺乏功能基團(tuán)，其應(yīng)用受到了限制。以有機(jī)小分子通過共價(jià)或非共價(jià)模式對(duì)

SWNTs進(jìn)行修飾，是提高其溶解性和功能性的重要途徑。單壁碳納米管(SWNTs)基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器十二醛(DA)月桂醛LauraldehydeCH3(CH2)10CHO學(xué)名十二醛。無色液體。冷時(shí)凝成白色蠟燭固體。有不愉快的氣味，在高度稀釋時(shí)有像紫羅蘭的香氣。密度0.828~0.836.熔點(diǎn)44℃。沸點(diǎn)227~235℃。折射率1.433~1.440。溶于乙醇，不溶于水。暴露空氣中聚合成二聚體，有微量無機(jī)酸存在時(shí)更快。氧化時(shí)生成月桂酸。用于配置多種花香型香精。由月桂醇經(jīng)氧化，或十二（烷）酸和甲酸的鋇鹽經(jīng)蒸餾，或十二（烷）酸和甲酸的蒸汽通過催化劑而制的。

DA分子的長(zhǎng)脂肪鏈通過疏水性作用纏繞在

SWNTs外圍，減弱了碳管外壁之間的

π－π堆積和范德華力，從而起到穩(wěn)定劑的作用?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器六氰合鐵絡(luò)合離子[Fe(CN)6]3-/4-[Fe(CN)6]3-六氰合鐵絡(luò)合離子，F(xiàn)e是+3價(jià)

[Fe(CN)6]4-六氰合亞鐵絡(luò)合離子，F(xiàn)e是+2價(jià)由于DNA雜交產(chǎn)生的電流信號(hào)比較微弱，因而需要加入一些具有電活性的物質(zhì)來提高儀器的敏感性。指示劑是一類可以與ssDNA或者dsDNA以不同方式相互作用的電活性物質(zhì)，其電活性可以使檢測(cè)物質(zhì)的電信號(hào)增大，提高檢測(cè)靈敏度。六氰合鐵絡(luò)合離子[Fe(CN)6]3-/4-

可作電活性探針?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器亞甲基藍(lán)(MB)亞甲藍(lán)（Methyleneblue），又稱亞甲基藍(lán)、次甲基藍(lán)、次甲藍(lán)、美藍(lán)、品藍(lán)、甲烯藍(lán)、瑞士藍(lán)（Swissblue），國(guó)際非專利藥品名稱(INN)為methylthioniniumchloride。是一種芳香雜環(huán)化合物。MB是一種水溶性多核芳烴染料(典型的服用吩噻嗪染料),它在不同電極表面上電催化活性都很高。常被用作化學(xué)指示劑、染料、生物染色劑和藥物使用。MB作為蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑應(yīng)用于電化學(xué)作為雜交指示劑?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器將單壁碳納米管(SWNTs)和十二醛(DA)混合超聲分散，得到均勻、穩(wěn)定的無機(jī)－有機(jī)納米復(fù)合材料(SWNTs－DA)。將其滴涂在玻碳電極表面晾干得到復(fù)合材料修飾電極(SWNTs－DA/GCE)，再通過胺醛縮合反應(yīng)將末端修飾氨基的單鏈DNA探針共價(jià)固定在SWNTs－DA/GCE表面，構(gòu)建了一種新型的DNA電化學(xué)傳感器。以六氰合鐵絡(luò)合離子[Fe(CN)6]3-/4-為電活性探針，采用循環(huán)伏安法和電化學(xué)阻抗法對(duì)傳感器的層層組裝過程進(jìn)行表征。以亞甲基藍(lán)(MB)作為雜交指示劑，考察了傳感器分析性能

SWNTs－DA復(fù)合物的制備(A)及

DNA電化學(xué)傳感器的檢測(cè)示意圖(B)如下：實(shí)驗(yàn)原理基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器實(shí)驗(yàn)部分三電極系統(tǒng)：玻碳電極或各修飾電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。實(shí)驗(yàn)步驟：1、SWNTs-DA復(fù)合材料的制備2、修飾電極的制備3、DNA探針的固定及雜交4、MB的富集及檢測(cè)基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器1、SWNTs-DA復(fù)合材料的制備取

0.5mgSWNTs加入至1mL無水乙醇中超聲分散得到

0.5g/LSWNTs分散液;另取100μL(4.6mol/L)十二醛(DA)與

100μL無水乙醇混合得

2.3mol/LDA溶液。取

50μL0.5g/LSWNTs分散液與50μL2.3mol/LDA溶液混合，搖勻后，超聲分散

3h，得到黑色均勻的

SWNTs－

DA復(fù)合材料分散液，備用?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器2、修飾電極的制備將玻碳電極依次用粒徑為1.0、0.3和

0.05μm的

α-Al2O3拋光粉打磨成鏡面，每次拋光后先用DDW（二次蒸餾水）洗去表面污物，再依次用HNO3溶液、乙醇溶液、DDW超聲清洗，得到活化干凈的裸

GCE。在預(yù)處理好的裸GCE上滴加

10μLSWNTs－DA分散液，自然晾干，用水淋洗表面未固定的復(fù)合材料，自然晾干后即制得修飾玻碳電極(SWNTs－DA/GCE)。采用相似方法制備了

SWNTs和

DA單成分修飾電極，分別記為

SWNTs/GCE和

DA/GCE?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器3、DNA探針的固定及雜交將修飾好的SWNTs－DA/GCE電極浸泡在100μL1.0×10-7mol/L探針

DNA(S1)中

12h，使修飾電極表面的醛基和

S1末端的氨基發(fā)生胺醛縮合反應(yīng)，隨后將該電極浸入1.0×10-7mol/L的

NaBH4中1h，除去未固定的S1，得到S1/SWNTs－DA/GCE探針

DNA修飾電極。將

S1/SWNTs－DA/GCE浸入不同濃度的互補(bǔ)鏈

DNA(S2)雜交液中于42℃下反應(yīng)40min，取出后用

TE洗去未雜交的S2，得到雜交電極(S2－S1/SWNTs－DA/GCE)?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器4、MB的富集及檢測(cè)將

S1/SWNTs－DA/GCE放5.0×10-5mol/LMB溶液中，富集

45min，取出用

pH6.86的

PBS（磷酸鹽緩沖溶液）空白溶液淋洗，再將電極置于空白

PBS緩沖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)和電化學(xué)阻抗法(DPV)測(cè)定?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器結(jié)果與討論SWNTs－DA的分散性及形貌表征不同修飾電極的電化學(xué)表征探針

DNA的固定及表征傳感分析：（1）MB的電化學(xué)行為（2）富集時(shí)間的影響（3）不同序列

DNA的電化學(xué)檢測(cè)（4）目標(biāo)序列的定量檢測(cè)基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器SWNTs－DA的分散性及形貌表征結(jié)果表明DA能作為一種很好的分散劑用于SWNTs的分散，且能保持很好的穩(wěn)定性。這是由于DA分子的長(zhǎng)脂肪鏈通過疏水性作用纏繞在SWNTs外圍，減弱了碳管外壁之間的π－π堆積和范德華力，從而起到穩(wěn)定劑的作用?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器不同修飾電極的電化學(xué)表征全抑制了[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子傳遞過程。相反地，在SWNTs－DA復(fù)合材料修飾電極上，背景信號(hào)較DA/GCE有了很大提高(曲線d)，同時(shí)氧化還原電流明顯增大，說明由于SWNTs的高導(dǎo)電性，使得復(fù)合物修飾電極的表面電子傳導(dǎo)能力顯著增強(qiáng)。采用循環(huán)伏安法(CV)對(duì)電極的修飾過程進(jìn)行表征a.GCE；b.SWNTs/GCE；c.DA/GCE；d.SWNTs－DA/GCE基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器[Fe(CN)6]3-/4-在SWNTs/GCE上的氧化還原峰電流值明顯增大，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是由于SWNTs的電化學(xué)催化活性高，有效地提高了[Fe(CN)6]3-/4-在電極表面的電子傳導(dǎo)速率。而當(dāng)裸

GCE電極表面修飾上DA后(曲線c)，未觀察到[Fe(CN)6]3-/4-在DA/GCE電極上產(chǎn)生任何氧化還原信號(hào)，表明由于DA的非導(dǎo)電性完探針

DNA的固定及表征[Fe(CN)6]3-/4-在

SWNTs－DA/GCE(a)和S1/SWNTs－DA/GCE(b)上的循環(huán)伏安圖基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器Fe(CN)6]3-/4-在S1/SWNTs－DA/GCE的電化學(xué)響應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)電極表面的-CHO與DNA探針末端的-NH2發(fā)生胺醛縮合，并被還原成-CH2-NH-單鍵基團(tuán)后，電極表面空隙增大，有利于Fe(CN)6]3-/4-通過空隙與電極表面接觸，從而導(dǎo)致電化學(xué)信號(hào)增強(qiáng)。該結(jié)果也說明，通過復(fù)合物上DA末端醛基與DNA末端的修飾氨基之間的胺醛縮合反應(yīng)已成功將探針DNA固定在電極表面。傳感分析MB的電化學(xué)行為不同掃速下

5.0×10-5mol/LMB溶液在S1/SWNTs－DA/GCE上的循環(huán)伏安圖由圖可知，MB在探針

DNA修飾電極上具有

1對(duì)明顯的氧化還原信號(hào)，表明

MB在傳感器表面具有良好的電化學(xué)響應(yīng)。隨著掃速增大，氧化還原峰電流值逐漸增大。這是因?yàn)閽咚僭酱?，達(dá)到相同電位所需的時(shí)間越短，擴(kuò)散層越薄，擴(kuò)散流量越大，所獲得的電流也越大?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器隨著富集時(shí)間的增加，氧化峰電流值逐漸增大，但在富集一定時(shí)間后，氧化峰電流基本穩(wěn)定，說明

MB在

S1/SWNTs－DA/GCE上已經(jīng)富集飽和?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器傳感分析富集時(shí)間的影響不同富集時(shí)間下

5.0×10-5mol/LMB溶液在S1/SWNTs－DA/GCE上的

DPV圖b所得的電化學(xué)信號(hào)與探針DNA修飾電極(a)幾乎一致，表明無雜交反應(yīng)發(fā)生。而當(dāng)傳感器與三堿基錯(cuò)配序列(c)和完全互補(bǔ)序列(d)雜交后，隨著目標(biāo)DNA與探針DNA發(fā)生雜交程度的增大，DNA雙鏈骨架逐漸形成，其嵌插

MB的作用越大，峰電流值也依次增大。表明制備的

DNA電化學(xué)探針能有效識(shí)別完全互補(bǔ)和非互補(bǔ)

DNA序列，顯示了很好的選擇性。S1/SWNTs－DA/GCE與互補(bǔ)序列S2(b)、非互補(bǔ)序列S3(c)和三堿基錯(cuò)配序列S4(d)雜交的差示脈沖伏安圖傳感分析不同序列

DNA的電化學(xué)檢測(cè)基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器隨著S2濃度的升高，氧化峰電流值逐漸增大，說明MB在電極表面的吸附量越來越大。這是因?yàn)殡S著S2雜交濃度的提高，電極表面形成的雙螺旋DNA量增大，通過嵌插作用和靜電作用結(jié)合了更多MB分子。氧化峰電流Ip與濃度對(duì)數(shù)lgcS2作圖，表明該傳感器能在寬濃度范圍內(nèi)對(duì)互補(bǔ)序列進(jìn)行定量分析，且具有較高的靈敏度?；趩伪谔技{米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器傳感分析目標(biāo)序列的定量檢測(cè)為MB在不同濃度互補(bǔ)序列(S2)雜交電極上的差示脈沖伏安圖氧化峰電流Ip與濃度對(duì)數(shù)

lgcS2作圖（插圖）通過超聲分散制備了一種新型的SWNTs－DA復(fù)合材料，DA的存在能夠顯著提高SWNTs的分散性和穩(wěn)定性。將SWNTs－DA修飾于玻碳電極表面，并利用DA末端醛基與DNA末端修飾氨基之間的縮合反應(yīng)制備了一種新型的DNA電化學(xué)傳感器。該固定方法直接、高效、條件溫和且不需要其它活化劑對(duì)功能基團(tuán)進(jìn)行預(yù)活化，為電化學(xué)傳感器的制備提供了新思路。以亞甲基藍(lán)(MB)為雜交指示劑，采用差示脈沖伏安法(DPV)考察了傳感器的雜交性能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明傳感器能在1.0×10-15～1.0×10-10mol/L濃度范圍內(nèi)對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行檢測(cè)，檢出限為2.0×10-16mol/L。此外，選擇性實(shí)驗(yàn)表明該傳感器可有效地用于區(qū)分三堿基錯(cuò)配、互補(bǔ)與非互補(bǔ)序列。結(jié)論基于單壁碳納米管--十二醛復(fù)合材料的DNA電化學(xué)傳感器參考文獻(xiàn)［1］

LiYQ，GuoYJ,LiXF,PanJH．Talanta,2007,71(1):123－128．［2］

FengMJ,LeiY,WangK,ChenYZ,LiGW,LuoHB,LinXH.J.Instrum.Anal.(馮美娟,雷云,王昆,陳元仲,李光文,羅紅斌,林新華,分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2011,30(5):

492－497．［3］

CaiP,HuangQY,LiM,LiangW．

ColloidsSurf.:B,2008,62(2):299－306．［4］

GorodetskyAA,BuzzeoMC,BartonJK.BioconjugateChem.,2008,19(12):2285

－2296．［5］

PheeneyCG,BartonJK．Langmuir,2012,28(17):7063－7070．［6］

SuniII．

TrendsAnal.Chem．,2008,27(7):604－611．［7］

WangRY,JiaDZ,ChaoYL．Electrochim.Acta,2012,72:101－107．［8］

LiYJ,HuangFY,LuoZX,XuB,WangXX,WangF,LiYC.Electrochem.Acta

,2012,74:280－286．［9］

XueR,KangTP,LuLP.J.Instrum.Anal.(薛瑞,康天放,魯理平.分析測(cè)試學(xué)報(bào))

,2012,31(8):940－944．［10］

HoangPH,ParkH,KimDP.J.Am.Chem.Soc.,2011,133(37):14765－14770．［11］

WangH,YangRH,YangL,TanWH.ACSNano,2009,3(9):2451－2460．［12］

HongT,ZhouQ,DuanDL,WuY,CaoQE,DingZT.J.Instrum.Anal.(洪濤,周

群,段德良,武云,曹秋娥,丁中濤.分析測(cè)試學(xué)報(bào)),2011,30(9):976－982．參考文獻(xiàn)［13］

ZhuQ,WeiY,WuXQ.Chem.Res.Appl.(朱瓊,魏雅,吳霞琴.化學(xué)研究與應(yīng)用)

,2011,23(4):413－417．［14］

CaiZ,MoLJ,DuLW,MoCR,LiangXY,MoLS,HuangFRChem.Res.Appl.

(蔡卓