第20 高效液相色譜法

第二十章高效液相色譜法HPLC第一節(jié)概述highperformanceliquidchromatography一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜儀流程圖四、特點以氣相色譜理論為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實驗和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法（一）HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動相；分析周期長；柱效低（H↑，n↓）；無法在線檢測，靈敏度差2．HPLC：分離和分析柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動相；分析時間大大縮短；柱效高（H↓，n↑）；可以在線檢測，靈敏度高

表20-1HPLC法與經(jīng)典LC法性能對比

經(jīng)典LC

HPLC固定相一般規(guī)格特殊規(guī)格固定相粒度(μm)75～5003～10粒度分布(RSD)20～30％＜5％柱長（cm）10～1003～25（分析型）柱內(nèi)徑（cm）2～50.3～0.46柱入口壓強(MPa)0.001～0.12～40柱效（理論塔片數(shù)/m）10～1003×104～8×104樣品用量(g)1～1010-6～10-4分析所需時間(h)1～200.05～0.5裝置非儀器化儀器化2/5/2023二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、熱穩(wěn)定性差、離子型等樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤?、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置續(xù)前四、HPLC的特點和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）第二節(jié)基本理論和條件選擇熱力學理論：塔板理論——平衡理論動力學理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇基礎(chǔ)一、塔板理論二、速率理論（與GC對比）

1.2）渦流擴散項A及其影響2.討論：

1）流動相流速對HPLC板高的影響（與GC對比）next圖示back續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項及其影響

固定相傳質(zhì)阻抗CS：因固定液膜厚度df極小，固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略流動相傳質(zhì)阻抗Cm：靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗CSm：在固定相微孔內(nèi)的滯留的流動相產(chǎn)生的傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗項與流動相的粘度及柱溫有關(guān)圖示降低板高的途徑有：（1）小粒度（dp?。⒕鶆虻那蛐位瘜W鍵合相（A、C?。?，勻漿法裝柱（2）低粘度流動相（C?。?，如甲醇（乙醇與甲醇的理化性質(zhì)相似卻無毒,但25℃時粘度是甲醇的2倍）（3）流速不宜過快（1ml/min），（Cu?。?）增加柱長L，可增加n，但同時也增加tR,

增加分析時間，一般不可取的。

（5）柱溫適當，如室溫25℃左右第三節(jié)各類高效液相色譜法

HPLC法分類：按固定相聚集狀態(tài)：液-液色譜法（LLC）液-固色譜法（LSC）按分離機理：分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）

化學鍵合相色譜法（BPC）親和色譜法（AC）膠束色譜法（MC）手性色譜法（CC）基本類型色譜法一、液固吸附色譜法（LSC）

liquid-solidadsorptionchromatography

流動相為液體，固定相為固體吸附劑

1．分離機制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異分離前提：K不等或k不等2.影響容量因子k的因素

在色譜柱一定（S與Vm一定）及柱溫一定時，k與溶質(zhì)、溶劑的性質(zhì)有關(guān)。在吸附色譜法中，硅膠是最常用的吸附劑，故以硅膠為例討論

⑴硅膠與溶質(zhì)分子的親合力順序（容量因子序）：飽和烴＜芳烴＜有機鹵化物＜醚＜酯≈醛≈酮＜醇≈胺＜羧酸與硅膠親合力大的溶質(zhì)，k大，tR‘（或tR）大，晚出柱⑵流動相的極性常用流動相以烷烴為底劑，加入適當極性調(diào)整劑組成二元或多元溶劑系統(tǒng)流動相系統(tǒng)極性越大，洗脫力越強，容量因子ｋ越小，tR越小。調(diào)整溶劑的極性，可以控制組分的保留時間。2/5/2023續(xù)前（3）固定相硅膠的活性5.其他固定相：高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配特點：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物3.適用：分離極性化合物硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小，吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%，硅膠失活→載體，吸附的水→固定液，分配色譜4．出柱順序：硅膠極性較大，強極性組分后出柱，弱極性組分先出柱二、液液分配色譜法（LLC）1．分離機制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機械涂漬法）缺點：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實用

3．正相色譜——固定液極性>流動相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分4.反相色譜——固定液極性<流動相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分三、化學鍵合相色譜法（BPC）（一）化學鍵合相（二）反相鍵合相色譜（reversedbondedphasechromatography,RBPC）（三）正相鍵合相色譜（normalbondedphasechromatography,NBPC）（四）離子對色譜（五）離子抑制色譜（了解）（一）化學鍵合相定義：利用化學反應(yīng)將固定液的官能團鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學鍵合相1．分離機制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）2．特點：

1）不易流失

2）熱穩(wěn)定性好

3）化學性能好，pH介于2~8范圍內(nèi)溶液中不變質(zhì)

4）載樣量大

5）適于梯度洗脫

6）應(yīng)用范圍廣（正相、反相、離子對色譜等）（二）反相鍵合相色譜法1、分離機理：疏溶劑理論為代表溶質(zhì)的保留機理是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。2、影響因素溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積，k，tR

鍵合相中烴基的總表面積，k，tR

洗脫液表面張力（含水量↑），k，tR

3.反相色譜中影響溶質(zhì)保留的因素：（1）反相鍵合的烴基鏈長；（2）有機溶劑的比例；（3）流動相的pH；（4）流動相的鹽濃度。續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜法

1、固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）2、流動相：類似與以硅膠為固定相的吸附色譜法非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）3、分離機制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導力、或氫鍵作用力續(xù)前4．流動相極性與k的關(guān)系：流動相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等（四）反相離子對色譜法（IPC或PIC）反相色譜中，在極性流動相中加入離子對試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對，增加k和tR，以改善分離模型1）離子對試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2）影響k的因素離子對試劑的種類：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；流動相的pH：有利于組分和離子對試劑離子化時（離子對的形成），組分的k值最大固定相、流動相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。3）適用：較強的有機酸、堿反相離子對色譜法模型33++()+3s3(+固定相：弱極性+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對mB+ABAmA(s流動相：極性通式（五）反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達到改善分離的目的1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)或pH一定的緩沖溶液2）k的影響因素：選擇流動相：應(yīng)同時考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HAc

tR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0

pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<3.0腐蝕柱子3）適用：弱酸、弱堿物質(zhì)

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物第四節(jié)固定相一、固定相——要求：顆粒細、均勻、球形、耐高壓

1.液-固色譜固定相硅膠：薄殼型；無定形全多孔硅膠(YWG)；

球形全多孔硅膠（

YQG）

2.化學鍵合相：利用化學反應(yīng)將固定液的官能團鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學鍵合相非極性鍵合相：十八烷基鍵合相（ODS或C18）是最常用的非極性鍵合相。中等極性鍵合相極性鍵合相正相色譜反相色譜吸附色譜

第五節(jié)流動相（溶劑系統(tǒng)）對流動相的要求：與固定相不發(fā)生化學反應(yīng)。pH介于2~8范圍內(nèi)。對試樣有適宜的溶解度。使k在1~10范圍內(nèi)（可用范圍）或2~5（最佳范圍），

k小，tR小；k大，tR大，峰寬變大；與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。

2/5/2023（一）流動相對分離的影響（分離方程式）（二）流動相的極性和選擇性流動相的極性（強度）正相色譜：溶劑極性越強，洗脫能力越強反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強流動相的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同吸附色譜：同經(jīng)典LC，二元或三元的有機溶劑，粘度小正相色譜：同吸附色譜法反相色譜：水-有機溶劑，粘度小，無UV吸收常用水-甲醇或水-乙腈續(xù)前

（三）洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）——類似GC的等溫度洗脫以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個泵）具有方法簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生等優(yōu)點。對于成分復(fù)雜的樣品，往往不能兼顧某些性質(zhì)相差很大組分的分離要求2）梯度洗脫：——類似GC的程序升溫在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個泵）。適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度有時引起基線漂移、重復(fù)性較差峰的鑒別：1．苯；2．氯苯；3．對二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脫兩種洗脫方式的比較（b）等度洗脫2/5/2023（四）溶劑系統(tǒng)選擇的一般原則RBPC流動相極性越強，洗脫能力越弱，溶質(zhì)的k越大（1）溶劑種類：水+甲醇、水+乙腈（2）溶劑比例：水的比例增加，使k增大（3）溶劑pH：影響弱酸、弱減的離解流動相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題：（1）盡量使用高純度試劑（色譜純）作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子（3）試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵（常用）：在輸送流動相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動。有串聯(lián)式和并聯(lián)式第七節(jié)高效液相色譜儀輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕2/5/2023二、色譜柱和進樣系統(tǒng)

進樣器注射器進樣閥（六通閥，不停泵進樣）、自動進樣裝置色譜柱（column）由柱管（不銹鋼管）和固定相組成分析柱（直徑4~6mm，柱長10~30cm）、制備柱柱效評價：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

R≥1.5，n（符合規(guī)定），fs（0.95~1.05）柱再生：維護、保養(yǎng)、柱子的沖洗（了解）2/5/2023三、檢測器

1、紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì)

檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器續(xù)前紫外檢測器類型：1）固定波長檢測器：254nm2）可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計相似3）光電二極管陣列檢測器(DAD)：在獲得色譜圖的同時，還可以獲得個組分的光譜圖。即獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收