第20 高效液相色譜法

第二十章高效液相色譜法HPLC第一節(jié)概述highperformanceliquidchromatography一、HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別二、HPLC與GC差別三、高效液相色譜儀流程圖四、特點(diǎn)以氣相色譜理論為基礎(chǔ)，在經(jīng)典液相色譜實(shí)驗(yàn)和技術(shù)基礎(chǔ)上建立的一種液相色譜法（一）HPLC與經(jīng)典LC區(qū)別主要區(qū)別：固定相差別，輸液設(shè)備和檢測手段1．經(jīng)典LC：僅做為一種分離手段柱內(nèi)徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻常壓輸送流動(dòng)相；分析周期長；柱效低（H↑，n↓）；無法在線檢測，靈敏度差2．HPLC：分離和分析柱內(nèi)徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）高壓輸送流動(dòng)相；分析時(shí)間大大縮短；柱效高（H↓，n↑）；可以在線檢測，靈敏度高

表20-1HPLC法與經(jīng)典LC法性能對(duì)比

經(jīng)典LC

HPLC固定相一般規(guī)格特殊規(guī)格固定相粒度(μm)75～5003～10粒度分布(RSD)20～30％＜5％柱長（cm）10～1003～25（分析型）柱內(nèi)徑（cm）2～50.3～0.46柱入口壓強(qiáng)(MPa)0.001～0.12～40柱效（理論塔片數(shù)/m）10～1003×104～8×104樣品用量(g)1～1010-6～10-4分析所需時(shí)間(h)1～200.05～0.5裝置非儀器化儀器化2/5/2023二、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別1．分析對(duì)象

GC：能氣化、熱穩(wěn)定性好、且沸點(diǎn)較低的樣品，高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、離子型等樣品不可檢測占有機(jī)物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制分子量大、難氣化、熱穩(wěn)定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機(jī)物的80%2．流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。┤⒏咝б合嗌V儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置續(xù)前四、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠(yuǎn)高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）第二節(jié)基本理論和條件選擇熱力學(xué)理論：塔板理論——平衡理論動(dòng)力學(xué)理論：速率理論——Vander方程一、塔板理論二、速率理論三、HPLC法中分離條件的選擇基礎(chǔ)一、塔板理論二、速率理論（與GC對(duì)比）

1.2）渦流擴(kuò)散項(xiàng)A及其影響2.討論：

1）流動(dòng)相流速對(duì)HPLC板高的影響（與GC對(duì)比）next圖示back續(xù)前3）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響

固定相傳質(zhì)阻抗CS：因固定液膜厚度df極小，固定相傳質(zhì)阻抗CS可以忽略流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗Cm：靜態(tài)流動(dòng)相傳質(zhì)阻抗CSm：在固定相微孔內(nèi)的滯留的流動(dòng)相產(chǎn)生的傳質(zhì)阻抗傳質(zhì)阻抗項(xiàng)與流動(dòng)相的粘度及柱溫有關(guān)圖示降低板高的途徑有：（1）小粒度（dp?。?、均勻的球形化學(xué)鍵合相（A、C?。?，勻漿法裝柱（2）低粘度流動(dòng)相（C?。缂状迹ㄒ掖寂c甲醇的理化性質(zhì)相似卻無毒,但25℃時(shí)粘度是甲醇的2倍）（3）流速不宜過快（1ml/min），（Cu?。?）增加柱長L，可增加n，但同時(shí)也增加tR,

增加分析時(shí)間，一般不可取的。

（5）柱溫適當(dāng)，如室溫25℃左右第三節(jié)各類高效液相色譜法

HPLC法分類：按固定相聚集狀態(tài)：液-液色譜法（LLC）液-固色譜法（LSC）按分離機(jī)理：分配色譜法（partitionchromatography）吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）

化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）親和色譜法（AC）膠束色譜法（MC）手性色譜法（CC）基本類型色譜法一、液固吸附色譜法（LSC）

liquid-solidadsorptionchromatography

流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑

1．分離機(jī)制：利用溶質(zhì)分子占據(jù)固定相表面吸附活性中心能力的差異分離前提：K不等或k不等2.影響容量因子k的因素

在色譜柱一定（S與Vm一定）及柱溫一定時(shí)，k與溶質(zhì)、溶劑的性質(zhì)有關(guān)。在吸附色譜法中，硅膠是最常用的吸附劑，故以硅膠為例討論

⑴硅膠與溶質(zhì)分子的親合力順序（容量因子序）：飽和烴＜芳烴＜有機(jī)鹵化物＜醚＜酯≈醛≈酮＜醇≈胺＜羧酸與硅膠親合力大的溶質(zhì)，k大，tR‘（或tR）大，晚出柱⑵流動(dòng)相的極性常用流動(dòng)相以烷烴為底劑，加入適當(dāng)極性調(diào)整劑組成二元或多元溶劑系統(tǒng)流動(dòng)相系統(tǒng)極性越大，洗脫力越強(qiáng)，容量因子ｋ越小，tR越小。調(diào)整溶劑的極性，可以控制組分的保留時(shí)間。2/5/2023續(xù)前（3）固定相硅膠的活性5.其他固定相：高分子多孔小球：YSG

原理：吸附+分配特點(diǎn)：柱選擇性好，峰形好，柱效低適用：分離弱極性化合物3.適用：分離極性化合物硅膠吸水量↑，LSC→LLC硅膠含水量較小，吸附色譜硅膠極性較大硅膠含水量>17%，硅膠失活→載體，吸附的水→固定液，分配色譜4．出柱順序：硅膠極性較大，強(qiáng)極性組分后出柱，弱極性組分先出柱二、液液分配色譜法（LLC）1．分離機(jī)制：利用組分在兩相中溶解度的差異2．固定相：載體+固定液（物理或機(jī)械涂漬法）缺點(diǎn)：系統(tǒng)內(nèi)部壓力大，易流失，不實(shí)用

3．正相色譜——固定液極性>流動(dòng)相極性（NLLC）

極性小的組分先出柱，極性大的組分后出柱適于分離極性組分4.反相色譜——固定液極性<流動(dòng)相極性（RLLC）

極性大的組分先出柱，極性小的組分后出柱適于分離非極性組分三、化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）（一）化學(xué)鍵合相（二）反相鍵合相色譜（reversedbondedphasechromatography,RBPC）（三）正相鍵合相色譜（normalbondedphasechromatography,NBPC）（四）離子對(duì)色譜（五）離子抑制色譜（了解）（一）化學(xué)鍵合相定義：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相1．分離機(jī)制：分配+吸附（以LLC為基礎(chǔ)）2．特點(diǎn)：

1）不易流失

2）熱穩(wěn)定性好

3）化學(xué)性能好，pH介于2~8范圍內(nèi)溶液中不變質(zhì)

4）載樣量大

5）適于梯度洗脫

6）應(yīng)用范圍廣（正相、反相、離子對(duì)色譜等）（二）反相鍵合相色譜法1、分離機(jī)理：疏溶劑理論為代表溶質(zhì)的保留機(jī)理是溶質(zhì)分子與極性溶劑分子間的排斥力，促使溶質(zhì)分子與鍵合相的烴基發(fā)生疏水締合。2、影響因素溶質(zhì)分子中非極性部分的總表面積，k，tR

鍵合相中烴基的總表面積，k，tR

洗脫液表面張力（含水量↑），k，tR

3.反相色譜中影響溶質(zhì)保留的因素：（1）反相鍵合的烴基鏈長；（2）有機(jī)溶劑的比例；（3）流動(dòng)相的pH；（4）流動(dòng)相的鹽濃度。續(xù)前4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↓，k↑，組分tR↑5．出柱順序：極性大的組分先出柱極性小的組分后出柱6．適用：非極性~中等極性組分（HPLC80%問題）（三）正相鍵合相色譜法

1、固定相：極性鍵合相如氰基（－CN）、氨基（－NH2）鍵合硅膠。（經(jīng)典：水飽和的硅膠）2、流動(dòng)相：類似與以硅膠為固定相的吸附色譜法非極性或弱極性溶劑加極性調(diào)整劑如烷烴加醇類。（與水不混溶的溶劑）3、分離機(jī)制：溶質(zhì)分子與固定相之間定向作用力、誘導(dǎo)力、或氫鍵作用力續(xù)前4．流動(dòng)相極性與k的關(guān)系：流動(dòng)相極性↑，洗脫能力↑，組分tR↓，k↓5．出柱順序：結(jié)構(gòu)相近組分，極性小的組分先出柱極性大的組分后出柱6．適用：氰基鍵合相與硅膠的柱選擇性相似（極性稍?。┓蛛x物質(zhì)也相似氨基鍵合相與硅膠性質(zhì)差別大，堿性分析極性大物質(zhì)、糖類等（四）反相離子對(duì)色譜法（IPC或PIC）反相色譜中，在極性流動(dòng)相中加入離子對(duì)試劑，使被測組分與其中的反離子形成中性離子對(duì)，增加k和tR，以改善分離模型1）離子對(duì)試劑：烷基磺酸鈉→分析堿四丁基季胺鹽→分析酸2）影響k的因素離子對(duì)試劑的種類：碳鏈長度增加，溶質(zhì)的k增大；流動(dòng)相的pH：有利于組分和離子對(duì)試劑離子化時(shí)（離子對(duì)的形成），組分的k值最大固定相、流動(dòng)相性質(zhì)（同一般RP-HPLC）。3）適用：較強(qiáng)的有機(jī)酸、堿反相離子對(duì)色譜法模型33++()+3s3(+固定相：弱極性+()+B)+B+H+BHRSONaRSO+Na+BHRSORSO)BH離子對(duì)mB+ABAmA(s流動(dòng)相：極性通式（五）反相離子抑制色譜在反相色譜中，通過加入緩沖溶液調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值，抑制組分解離，增加其k和tR，以達(dá)到改善分離的目的1）離子抑制劑：弱酸、弱堿性物質(zhì)或pH一定的緩沖溶液2）k的影響因素：選擇流動(dòng)相：應(yīng)同時(shí)考慮極性及pH值酸性物質(zhì)——加入酸HAc

tR↑，k↑

堿性物質(zhì)——加入堿NH3·H2OtR↑，k↑調(diào)節(jié)pH范圍：3.0~8.0

pH>8.0破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<3.0腐蝕柱子3）適用：弱酸、弱堿物質(zhì)

pH=3~7弱酸；pH=7~8弱堿；兩性化合物第四節(jié)固定相一、固定相——要求：顆粒細(xì)、均勻、球形、耐高壓

1.液-固色譜固定相硅膠：薄殼型；無定形全多孔硅膠(YWG)；

球形全多孔硅膠（

YQG）

2.化學(xué)鍵合相：利用化學(xué)反應(yīng)將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，而構(gòu)成化學(xué)鍵合相非極性鍵合相：十八烷基鍵合相（ODS或C18）是最常用的非極性鍵合相。中等極性鍵合相極性鍵合相正相色譜反相色譜吸附色譜

第五節(jié)流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）對(duì)流動(dòng)相的要求：與固定相不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。pH介于2~8范圍內(nèi)。對(duì)試樣有適宜的溶解度。使k在1~10范圍內(nèi)（可用范圍）或2~5（最佳范圍），

k小，tR??；k大，tR大，峰寬變大；與檢測器相適應(yīng)。例如用紫外檢測器時(shí)，選用截止波長小于檢測波長的溶劑。純度高，粘度小。低粘度流動(dòng)相如甲醇﹑乙腈等可以降低柱壓，提高柱效。

2/5/2023（一）流動(dòng)相對(duì)分離的影響（分離方程式）（二）流動(dòng)相的極性和選擇性流動(dòng)相的極性（強(qiáng)度）正相色譜：溶劑極性越強(qiáng)，洗脫能力越強(qiáng)反相色譜：極性弱的溶劑洗脫能力強(qiáng)流動(dòng)相的選擇性不同種類的溶劑，分子間的作用力不同，故選擇性不同吸附色譜：同經(jīng)典LC，二元或三元的有機(jī)溶劑，粘度小正相色譜：同吸附色譜法反相色譜：水-有機(jī)溶劑，粘度小，無UV吸收常用水-甲醇或水-乙腈續(xù)前

（三）洗脫方式1）等度洗脫（恒組成溶劑洗脫）——類似GC的等溫度洗脫以固定配比的溶劑系統(tǒng)洗脫組分（一個(gè)泵）具有方法簡便、重復(fù)性好、色譜柱易再生等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于成分復(fù)雜的樣品，往往不能兼顧某些性質(zhì)相差很大組分的分離要求2）梯度洗脫：——類似GC的程序升溫在一定分析周期內(nèi)不斷變換流動(dòng)相的種類和比例，即不斷改變其極性（兩個(gè)泵）。適于分析極性差別較大的復(fù)雜組分縮短分析周期；提高分離效果；改善峰形；增加檢測靈敏度有時(shí)引起基線漂移、重復(fù)性較差峰的鑒別：1．苯；2．氯苯；3．對(duì)二氯苯4．1，2，3三氯苯；

5．1，3，5三氯苯；6．1，2，4三氯苯；

7．1，2，3，4四氯苯；8．1，2，4，5四氯苯；

9．五氯苯；10.六氯苯（a）梯度洗脫兩種洗脫方式的比較（b）等度洗脫2/5/2023（四）溶劑系統(tǒng)選擇的一般原則RBPC流動(dòng)相極性越強(qiáng)，洗脫能力越弱，溶質(zhì)的k越大（1）溶劑種類：水+甲醇、水+乙腈（2）溶劑比例：水的比例增加，使k增大（3）溶劑pH：影響弱酸、弱減的離解流動(dòng)相的pH降低，弱酸k增大，tR增大；弱堿k變小選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題：（1）盡量使用高純度試劑（色譜純）作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。一、輸液系統(tǒng)高壓輸液泵恒壓泵：流量精度不穩(wěn)恒流泵（常用）：在輸送流動(dòng)相過程中流量恒定。常用柱塞往復(fù)泵雙泵：為了克服流量的脈動(dòng)。有串聯(lián)式和并聯(lián)式第七節(jié)高效液相色譜儀輸液泵應(yīng)具備的性能：流量精度高且穩(wěn)定流量范圍寬能在高壓下連續(xù)工作液缸容積小密封性能好，耐腐蝕2/5/2023二、色譜柱和進(jìn)樣系統(tǒng)

進(jìn)樣器注射器進(jìn)樣閥（六通閥，不停泵進(jìn)樣）、自動(dòng)進(jìn)樣裝置色譜柱（column）由柱管（不銹鋼管）和固定相組成分析柱（直徑4~6mm，柱長10~30cm）、制備柱柱效評(píng)價(jià)：色譜系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

R≥1.5，n（符合規(guī)定），fs（0.95~1.05）柱再生：維護(hù)、保養(yǎng)、柱子的沖洗（了解）2/5/2023三、檢測器

1、紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質(zhì)

檢測原理：朗伯－比爾(Lambert-Beer)定律，響應(yīng)信號(hào)（吸光度）與濃度成正比A=εCl特點(diǎn)：靈敏度較高（10-6—10-9g/ml），噪音低，線性范圍寬，穩(wěn)定性好，適于梯度，不破壞樣品，應(yīng)用廣（分析、制備）。局限：只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動(dòng)相的截止波長應(yīng)小于檢測波長。專屬型、濃度型檢測器續(xù)前紫外檢測器類型：1）固定波長檢測器：254nm2）可變波長檢測器：光源：氘燈（和鎢燈），200—400（800）nm，單色器，流通池（試樣），光電管光路系統(tǒng)和紫外分光光度計(jì)相似3）光電二極管陣列檢測器(DAD)：在獲得色譜圖的同時(shí)，還可以獲得個(gè)組分的光譜圖。即獲得三維光譜－色譜圖。用途：吸收