第二章DNA的復(fù)制

DNA的復(fù)制DNA通過復(fù)制將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過轉(zhuǎn)錄和翻譯，將遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)分子，從而決定生物的表現(xiàn)型。DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過程就構(gòu)成了遺傳學(xué)的中心法則。

RNA病毒的遺傳信息貯存在RNA分子，遺傳信息的流向是RNA通過復(fù)制，將遺傳信息由親代傳遞給子代；通過反轉(zhuǎn)錄將遺傳信息傳遞給DNA，再由DNA通過轉(zhuǎn)錄和翻譯傳遞給蛋白質(zhì)，這種遺傳信息的流向就豐富了中心法則的內(nèi)容。

中心法則

Crick于1954年所提出的遺傳信息傳遞規(guī)律1954年首次提出的“中心法則”1970-1980年的“中心法則”21世紀(jì)后修正的“中心法則”一.DNA復(fù)制概況DNA在復(fù)制時(shí)，以親代DNA的每一條單鏈DNA作模板，合成完全相同的兩個(gè)雙鏈子代DNA，每個(gè)子代DNA中都含有一條親代DNA.這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)。

DNA以半保留方式進(jìn)行復(fù)制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的實(shí)驗(yàn)所證明。2、實(shí)驗(yàn)證據(jù)（1958Meselson和Stahl）：

MatthewMesselsonFranklinStahl復(fù)制叉與復(fù)制子DNA的復(fù)制是由固定的起始點(diǎn)開始的。一般把生物體的復(fù)制單位稱為復(fù)制子(replicon)。一個(gè)復(fù)制子只含一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制時(shí)，雙鏈DNA要解開成兩股鏈分別進(jìn)行，所以，復(fù)制起點(diǎn)呈叉子形式，被稱為復(fù)制叉(Replicationfork)。復(fù)制叉（Replicationfork）：DNA復(fù)制時(shí)在DNA鏈上通過解旋、解鏈和SSB蛋白的結(jié)合等過程形成的Y字型結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉.復(fù)制叉復(fù)制叉部分生物復(fù)制子的比較從復(fù)制原點(diǎn)到終點(diǎn)，組成一個(gè)能夠獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制的DNA復(fù)制單位叫復(fù)制子復(fù)制子（replicon）：原核生物只有一個(gè)復(fù)制原點(diǎn)，整個(gè)染色體只有一個(gè)復(fù)制單位。真核生物有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，因此是多復(fù)制子。每個(gè)復(fù)制子在每一次細(xì)胞循環(huán)中只啟動(dòng)一次。DNA復(fù)制是從DNA分子的特定位置開始的，這一位置叫復(fù)制原點(diǎn)（復(fù)制起始點(diǎn)）（大腸桿菌用ori表示，酵母ARS）。是由一些具有特定核苷酸排列順序的片段組成。富含A-T。在原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)通常為一個(gè)，而在真核生物中則為多個(gè)。

復(fù)制起點(diǎn)DNA復(fù)制時(shí)，以復(fù)制起始點(diǎn)為中心，向兩個(gè)方向進(jìn)行復(fù)制。但在低等生物中，也可進(jìn)行單向復(fù)制（如滾環(huán)復(fù)制）。雙向復(fù)制真核生物基因組可以同時(shí)在多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)上進(jìn)行復(fù)制，也就是說它們的基因組包含有多個(gè)復(fù)制子。細(xì)菌、病毒和線粒體的DNA分子都是作為單個(gè)復(fù)制子完成復(fù)制的；原核生物DNA的復(fù)制雙向復(fù)制(BidirectionalReplication)無論是原核生物還是真核生物，DNA的復(fù)制主要是從固定的起始點(diǎn)以雙向等速?gòu)?fù)制方式進(jìn)行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序?yàn)槠瘘c(diǎn)，向兩個(gè)方向等速生長(zhǎng)前進(jìn)。DNASynthesis由于DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模虼嗽趶?fù)制叉附近解開的DNA鏈一條是5’→3’方向，另一條是3’→5’方向，兩個(gè)模板極性不同。所有已知DNA聚合酶的合成方向都是5’→3’，為了解釋DNA的等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎（Okazaki）等提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制模型（semi-discontinuousreplication）。半不連續(xù)復(fù)制Semi-discontinuousreplication岡崎片段 前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為DNA的半不連續(xù)復(fù)制。

[3H]Thymidinepulse-chaselabelingandalkalinesucrosegradient:discoveryofsemi-discontinousreplication用3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記后提取DNA，得到不少平均長(zhǎng)度為2-3kbDNA片段。用DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度下，有大量小片段累積，說明復(fù)制過程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再生成大分子DNA。由于DNA聚合酶只能以5‘→3’方向聚合子代DNA鏈，即模板DNA鏈的方向必須為3'→5'。因此，分別以兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時(shí)的方式是不同的。DNA的半不連續(xù)復(fù)制以3′→5′方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)基本上是連續(xù)進(jìn)行的，其子代鏈的聚合方向?yàn)?′→3′，這一條鏈被稱為前導(dǎo)鏈(leadingstrand)。以5′→3′方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在復(fù)制時(shí)則是不連續(xù)的，其鏈的聚合方向也是5′→3′，這條鏈被稱為滯后鏈(laggingstrand)。由于親代DNA雙鏈在復(fù)制時(shí)是逐步解開的，因此，滯后鏈的合成也是一段一段的。DNA在復(fù)制時(shí)，由滯后鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段(Okazakifragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個(gè)核苷酸，而在真核生物中約為100個(gè)核苷酸。

二.參與DNA復(fù)制的酶雙螺旋DNA復(fù)制是DNA聚合酶催化的酶促反應(yīng)過程。DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已有的DNA或RNA引物鏈，不能從頭起始DNA鏈的合成；在復(fù)制叉結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)，DNA雙螺旋中的兩條鏈纏繞在一起，要拷貝每一條鏈都必須將雙螺旋DNA解旋并釋放或吸收由此產(chǎn)生的扭力，這就要求雙螺旋和超螺旋的解旋與重新形成，DNA聚合酶不能完成這一過程;在不連續(xù)合成中形成短的岡崎片段的連接也是DNA聚合酶無法完成的。①DNA旋轉(zhuǎn)酶(拓?fù)洚悩?gòu)酶）；②使DNA雙股鏈在復(fù)制叉解開的解旋酶；③在DNA復(fù)制前防止解開的DNA單鏈局部退火的DNA結(jié)合蛋白；④合成RNA引物的酶；⑤除去RNA引物的酶；⑥使岡崎片段共價(jià)連接的DNA連接酶1、DNA聚合酶

DNA聚合酶種類和生理功能：在原核生物中，已發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），DNA聚合酶Ⅳ（polⅣ），DNA聚合酶Ⅴ（polⅤ）。前三種酶都屬于具有多種酶活性的多功能酶。參與DNA復(fù)制的主要是polⅢ和polⅠ。

參與DNA復(fù)制的DNA聚合酶，必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物(primer)，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，通常為1－10個(gè)核苷酸。RNA引物的堿基順序，與其模板DNA的堿基順序相配對(duì)。

RNA引物polⅠ為單一肽鏈的大分子蛋白質(zhì),可被特異的蛋白酶水解為兩個(gè)片段，其中的大片段稱為Klenowfragment，具有5'→3‘DNA聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

Containstwocatalyticsites,oneforadditionofdNTPsandoneforremovalofthemispaired

dNTP.Thepolymerizationsite:(1)bindstotwometalionsthatalterthechemicalenvironmentaroundthecatalyticsiteandleadtothecatalysis.(2)Monitorstheaccuracyofbase-pairingforthemostrecentlyaddednucleotidesbyformingextensivehydrogenbondcontactswithminorgrooveofthenewlysynthesizedDNA.Exonuclease

site/proofreadingsiteDNAPolymerase-palmdomainBindstotheincoming

dNTP,enclosesthecorrectpaireddNTPtothepositionforcatalysisBendsthetemplatetoexposetheonlynucleotideatthetemplatethatreadyforformingbasepairwiththeincomingnucleotideStabilizationofthepyrophosphateDNAPolymerase-fingerdomainNotdirectlyinvolvedincatalysisInteractswiththesynthesizedDNAtomaintaincorrectpositionoftheprimerandtheactivesite,andtomaintainastrongassociationbetweenDNAPolanditssubstrate.DNAPolymerase-thumbdomainpolⅢ由十種亞基組成，其中α亞基具有5′→3′DNA聚合酶活性，因而具有復(fù)制DNA的功能；而ε亞基具有3′→5′外切酶的活性，因而與DNA復(fù)制的校正功能有關(guān)。

DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ是在1999年才被發(fā)現(xiàn)的，它涉及DNA的錯(cuò)誤傾向修復(fù)(errorpronerepair)。當(dāng)DNA受到較嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩個(gè)酶，使修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性（accuracy)，因而出現(xiàn)高突變率。高突變率雖會(huì)殺死許多細(xì)胞，但至少可以克服復(fù)制障礙，使少數(shù)突變的細(xì)胞得以存活。

原核生物中的三種DNA聚合酶

在真核生物中，目前發(fā)現(xiàn)的DNA聚合酶有五種，分別命名為DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。參與染色體DNA復(fù)制的是polα（延長(zhǎng)滯后鏈）和polδ（延長(zhǎng)前導(dǎo)鏈），參與線粒體DNA復(fù)制的是polγ，polε與DNA損傷修復(fù)、校讀和填補(bǔ)缺口有關(guān)，polβ只在其他聚合酶無活性時(shí)才發(fā)揮作用。

DNA復(fù)制的保真性： 為了保證遺傳的穩(wěn)定，DNA的復(fù)制必須具有高保真性。DNA復(fù)制時(shí)的保真性主要與下列因素有關(guān)：1．遵守嚴(yán)格的堿基配對(duì)規(guī)律；2．DNA聚合酶在復(fù)制時(shí)對(duì)堿基的正確選擇；3．對(duì)復(fù)制過程中出現(xiàn)的錯(cuò)誤及時(shí)進(jìn)行校正。

2、DNA解旋酶和單鏈結(jié)合蛋白 復(fù)制過程中，復(fù)制叉在不斷前進(jìn)，復(fù)制叉前方的親代DNA就需不斷解鏈，為使復(fù)制能夠順利進(jìn)行，就必須防止DNA單鏈的鏈間或鏈內(nèi)局部“退火”并保證其完整性與伸展性，使單鏈DNA處于穩(wěn)定的狀態(tài)。承擔(dān)上述任務(wù)是DNA解旋酶（DNAhelicase）和單鏈DNA結(jié)合蛋白（single-strandbindingprotein,SSB）。

DNA解旋酶是很多細(xì)胞過程所要求的（如核苷酸切除修復(fù)、同源重組、轉(zhuǎn)錄終止）。DNA解旋酶是利用ATP水解獲得的能量來打斷氫鍵，解開雙鏈DNA并在DNA分子上沿一定方向移動(dòng)的一類酶的總稱（又稱解鏈酶）。解鏈酶的作用示意圖單鏈DNA結(jié)合蛋白行使很多涉及單鏈區(qū)域穩(wěn)定性的功能。SSB與DNA單鏈相結(jié)合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解開的單鏈DNA重新締合形成雙鏈，從而保持一種伸展?fàn)顟B(tài)，以保證復(fù)制順利進(jìn)行。在E.coli中SSB為四聚體，對(duì)單鏈DNA有很高的親和性，但對(duì)雙鏈DNA和RNA沒有親合力。SSB與DNA結(jié)合時(shí)有協(xié)同作用，當(dāng)一個(gè)SSB與DNA結(jié)合時(shí)，就會(huì)有更多的SSB迅速結(jié)合上去擴(kuò)展分布整個(gè)DNA單鏈，將DNA包被上蛋白聚合體。單鏈DNA結(jié)合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）的作用為：①使解開雙螺旋后的DNA單鏈能夠穩(wěn)定存在，即穩(wěn)定單鏈DNA，便于以其為模板復(fù)制子代DNA；②保護(hù)單鏈DNA，避免核酸酶的降解。

3、拓?fù)洚悩?gòu)酶天然DNA的負(fù)超螺旋雖然有利于DNA的解旋，但隨著復(fù)制的進(jìn)行，復(fù)制叉前方親代DNA中仍積累巨大的張力，因此復(fù)制中需要DNA旋轉(zhuǎn)酶去除解螺旋酶的解鏈產(chǎn)生的扭曲張力。大腸桿菌中的DNA旋轉(zhuǎn)酶（gyrase）又稱拓?fù)洚悩?gòu)酶（topoisomerase），超螺旋：DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成的空間結(jié)構(gòu)（1）正超螺旋(positivesupercoil)：

盤繞方向與DNA雙螺旋方同相同

（2）負(fù)超螺旋(negativesupercoil)：

盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反

正超螺旋：兩股以右旋方向纏繞的螺旋，在外力往緊纏的方向捻轉(zhuǎn)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一個(gè)左旋的超螺旋，以解除外力捻轉(zhuǎn)造成的脅變。這樣形成的螺旋為正超螺旋。負(fù)超螺旋：兩股以右旋方向纏繞的螺旋在外力向松纏的方向捻轉(zhuǎn)時(shí)，產(chǎn)生一個(gè)右旋的超螺旋以解除外力捻轉(zhuǎn)造成的脅迫。這樣形成的超螺旋為負(fù)超螺旋.正超螺旋負(fù)超螺旋天然DNA分子一般為負(fù)超螺旋負(fù)超螺旋DNA更易于局部解鏈，易于參加DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等拓?fù)洚悩?gòu)酶or溴化乙錠拓?fù)洚悩?gòu)酶or溴化乙錠DNA扭曲與雙螺旋相同（擰緊）DNA扭曲與雙螺旋相反（松開）負(fù)超螺旋松弛DNA正超螺旋3、拓?fù)洚悩?gòu)體（Topologicalisomer）：具有不同連接數(shù)的相同DNA分子4、拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase）：能夠改變DNA連接數(shù)從而改變DNA分子超螺旋水平的酶（1）拓?fù)洚悩?gòu)酶I（topoisomerase--I）作用機(jī)制：切開環(huán)狀一條鏈，連接數(shù)改變±1，不需ATP

（2）拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ作用機(jī)制：切開環(huán)狀兩條鏈，連接數(shù)改變±2，需要ATP

結(jié)合到一條鏈上形成復(fù)合物切斷一條鏈形成酶和蛋白的復(fù)合體共價(jià)連接Tyrosine-5’P一條鏈穿越重新連接L=2L=3

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(topoisomeraseI)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ－TopII引入負(fù)超螺旋作用于雙鏈：涉及雙鏈的斷裂和連接－－每次使DNA的連接數(shù)改變2DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶每作用一次產(chǎn)生兩個(gè)負(fù)超螺旋，因此可以消除復(fù)制叉向前移動(dòng)所產(chǎn)生的正超螺旋，并且復(fù)制完的兩個(gè)子代DNA雙鏈的分離也需要DNA旋轉(zhuǎn)酶的催化功能。當(dāng)加入DNA旋轉(zhuǎn)酶的抑制劑如香豆霉素（Coumermycin），新生霉素（novobiocin），萘啶酮酸（nalidixicacid）等時(shí)均能抑制細(xì)菌DNA的合成?？梢奃NA旋轉(zhuǎn)酶是DNA復(fù)制所必不可少的。4、引發(fā)酶與引物RNA的合成 DNA的半不連續(xù)復(fù)制中，DNA聚合酶不能從頭起始新的DNA鏈合成，只能在已有引物的3‘端向前延伸。迄今為止，人們所發(fā)現(xiàn)的引物大多為一段RNA，其長(zhǎng)度和序列隨著基因組的種類而表現(xiàn)出不同，在大多數(shù)情況下為1～10個(gè)核苷酸。催化RNA引物（RNAprimer）合成的酶叫引發(fā)酶（primerase）。引發(fā)酶識(shí)別DNA單鏈模板特異順序，以核糖核苷三磷酸為底物合成寡聚核苷酸產(chǎn)生3'-OH，為DNA聚合酶起始生成磷酸二酯鍵提供條件。引物與典型的RNA（如mRNA）不同，它們?cè)诤铣梢院蟛⒉慌c模板分離，而是以氫鍵與模板結(jié)合。RNA引物必須去除以完成DNA復(fù)制！RNaseHDNApolymeraseDNAligase5、DNA連接酶DNA連接酶(DNAligase)可催化兩段DNA片段之間磷酸二酯鍵的形成，而使兩段DNA連接起來。DNA連接酶催化的條件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封閉的缺口位于雙鏈DNA中，即其中有一條鏈?zhǔn)峭暾?；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。三、DNA復(fù)制過程復(fù)制的起始(initiation)DNA鏈的延伸(elongation)復(fù)制的終止(termination)1.DNA復(fù)制的起始復(fù)制起始原點(diǎn)DNA雙螺旋的解旋復(fù)制的引發(fā) DNA聚合酶只能延長(zhǎng)已存在的DNA鏈，而不能從頭合成DNA鏈，那么，新DNA的復(fù)制是怎樣開始的呢？大腸桿菌(E.coli)的OriC復(fù)制原點(diǎn)參與DNA復(fù)制起始和引發(fā)的蛋白質(zhì)DNA解旋酶(DNAhelicase)

催化DNA雙鏈的解鏈過程。單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandDNAbindingprotein)：

以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，只保持單鏈的存在，并不能起解鏈作用。DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(DNAtopoisomerase)

消除DNA雙鏈的超螺旋堆積。引物酶(primase)

合成一小段RNA引物，為DNA新鏈的合成提供3’-OH末端。2.DNA鏈的延伸DNA鏈的延伸需要的蛋白質(zhì):DNA聚合酶滑動(dòng)夾（SlidingDNAclamp）RNA酶(RNaseH等) 在復(fù)制完成后切除RNA引物。DNA連接酶(DNAligase) 通過生成3’5’-磷酸二酯鍵連接兩條DNA鏈。DNApolymerasecatalyzeDNAsynthesisDNAStructureofaslidingDNAclampSlidingDNAclampsencirclethenewlyreplicatedDNAproducedbyanassociatedDNApolymerase.SlidingclampsdramaticallyincreaseDNApolymeraseprocessivity(持續(xù)合成能力)RemovalofRNAprimersfromnewlysynthesizedDNARNA引物的切除3.

復(fù)制的終止當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到20bp重復(fù)性終止子序列（Ter）時(shí)，Ter-Tus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IV的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。四.DNA復(fù)制的幾種主要方式DNA復(fù)制通常是從雙螺旋的特定位置——復(fù)制原點(diǎn)（ori）開始，一般是富含A-T的區(qū)段，該區(qū)段的雙鏈DNA具有較強(qiáng)的呼吸作用（breathing），是經(jīng)常瞬間處于打開形成單鏈的區(qū)段（frequentlyopeningregion），由此產(chǎn)生的瞬時(shí)單鏈與SSB蛋白結(jié)合，對(duì)復(fù)制的起始十分重要。原核生物的復(fù)制原點(diǎn)通常為一個(gè)，而真核生物則有多個(gè)特定的復(fù)制原點(diǎn)。根據(jù)DNA合成的起始方式，復(fù)制可分為重新起始與共價(jià)延伸兩種類型：前者是前導(dǎo)鏈從新開始，也叫復(fù)制叉式復(fù)制；后者是先導(dǎo)鏈共價(jià)結(jié)合在一條親代鏈上，也叫滾環(huán)式復(fù)制。復(fù)制主要以雙向等速進(jìn)行，如原核生物E.coli等及真核生物DNA的復(fù)制；部分是單方向進(jìn)行，如質(zhì)粒ColE1的復(fù)制；或以不對(duì)稱的雙向方式進(jìn)行，如線粒體DNA的復(fù)制。1、復(fù)制叉式復(fù)制

(一)、復(fù)制的起始DNA復(fù)制的起始階段，由下列兩步構(gòu)成。

1、預(yù)引發(fā)：（1）．解旋解鏈，形成復(fù)制叉：由拓?fù)洚悩?gòu)酶和解鏈酶作用，使DNA的超螺旋及雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，堿基間氫鍵斷裂，形成兩條單鏈DNA。單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合在兩條單鏈DNA上，形成復(fù)制叉。DNA復(fù)制時(shí)，局部雙螺旋解開形成兩條單鏈，這種叉狀結(jié)構(gòu)稱為復(fù)制叉。對(duì)于雙向復(fù)制而言，形成的兩個(gè)復(fù)制叉向相反方向行進(jìn)，每個(gè)復(fù)制叉上的兩條DNA鏈均被拷貝。（2）．引發(fā)體組裝：由蛋白因子（如dnaB等）識(shí)別復(fù)制起始點(diǎn)，并與其他蛋白因子以及引物酶一起組裝形成引發(fā)體。2、引發(fā)：在引物酶的催化下，以DNA為模板，合成一段短的RNA片段，從而獲得3'端自由羥基（3'-OH）。

（二）、復(fù)制的延長(zhǎng)

1、聚合子代DNA： 由DNA聚合酶催化，以3′→5′方向的親代DNA鏈為模板，從5′→3′方向聚合子代DNA鏈。在原核生物中，參與DNA復(fù)制延長(zhǎng)的是DNA聚合酶Ⅲ；在真核生物中，是DNA聚合酶α(延長(zhǎng)滯后鏈)和DNA聚合酶δ（延長(zhǎng)前導(dǎo)鏈）。

2、引發(fā)體移動(dòng)： 引發(fā)體向前移動(dòng)，解開新的局部雙螺旋，形成新的復(fù)制叉，滯后鏈重新合成RNA引物，繼續(xù)進(jìn)行鏈的延長(zhǎng)。

（三）、復(fù)制的終止

去除引物，填補(bǔ)缺口： 在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ來水解去除RNA引物，并由該酶催化延長(zhǎng)引物缺口處的DNA，直到剩下最后一個(gè)磷酸酯鍵的缺口。 在真核生物中，RNA引物的去除，由一種特殊的核酸酶來水解，而岡崎片段仍由DNA聚合酶來延長(zhǎng)。

連接岡崎片段： 在DNA連接酶的催化下，形成最后一個(gè)磷酸酯鍵，將岡崎片段連接起來，形成完整的DNA長(zhǎng)鏈。

ThecompositionoftheDNAPolIIIholoenzyme2、滾環(huán)式復(fù)制θ型復(fù)制是雙鏈環(huán)狀DNA以復(fù)制叉方式進(jìn)行復(fù)制的特例。某些雙鏈環(huán)狀DNA或單鏈DNA的復(fù)制型（replicationform,RF），在復(fù)制時(shí)，以滾環(huán)復(fù)制方式進(jìn)行。滾環(huán)復(fù)制是在一條斷裂的親本鏈的3'-OH端不斷地發(fā)生DNA聚合作用，因而又稱共價(jià)延伸。由于斷開的3'-OH端仍然與其互補(bǔ)鏈形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，因而沒有合成RNA引物的必要。合成先導(dǎo)鏈的模板也總是呈環(huán)狀。滾環(huán)復(fù)制是單向復(fù)制的特殊方式，是某些噬菌體DNA復(fù)制的共同方式，E.coli噬菌體（如φX174、M13）的環(huán)形雙螺旋DNA復(fù)制時(shí)，僅僅以1條鏈作為模板合成若干環(huán)形DNA分子拷貝；某些雙鏈DNA的合成也可以通過滾動(dòng)環(huán)的復(fù)制方式進(jìn)行，例如，噬菌體λ復(fù)制的后期以及真核生物如非洲爪蟾卵母細(xì)胞中rDNA基因的擴(kuò)增都是以這種方式進(jìn)行的。Rollingcirclesproducemultimersofareplicon線粒體DNA的D-嚕噗復(fù)制雙鏈環(huán)狀DNA中的一條前導(dǎo)鏈已經(jīng)引發(fā)并開始合成，與其模板形成雙鏈結(jié)構(gòu)，而另一條親本鏈則被前導(dǎo)鏈置換出來成為單鏈狀態(tài)。這種由一條單鏈和一條雙鏈組成的三元泡狀結(jié)構(gòu)，叫做置換嚕噗或D-嚕噗（displacementloop）。只有前導(dǎo)鏈將另一條親本鏈（即滯后鏈的模板）的特別序列置換出來成為單鏈形式，才能產(chǎn)生滯后鏈前體的引發(fā)并合成其互補(bǔ)鏈。DNA復(fù)制的不同方式

3、真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)部分，通常膨大成粒狀。其共同的結(jié)構(gòu)特征是由一些富含G、C的短重復(fù)序列構(gòu)成，可重復(fù)數(shù)十次至數(shù)百次。

端粒結(jié)構(gòu)Telomeres端粒是線狀染色體末端的DNA重復(fù)序列。端粒是線狀染色體末端的一種特殊結(jié)構(gòu)，在正常人體細(xì)胞中，可隨著細(xì)胞分裂而逐漸縮短。把端粒當(dāng)作一件絨線衫袖口脫落的線段，絨線衫像是結(jié)構(gòu)嚴(yán)密的DNA，排在線上的DNA決定人體性狀。與人頭發(fā)的直與曲，眼睛的藍(lán)與黑，人的高與矮等等，甚至性格的暴躁和溫和有關(guān)。原核生物的末端問題在原核生物中：如果是環(huán)狀的DNA雙鏈雙向復(fù)制，RNA引物切除后不管是前導(dǎo)鏈還是滯后鏈都可以通過3’末端的延伸首尾相連把GAP補(bǔ)上（如大腸桿菌）；不存在末端問題如果是線狀的DNA雙鏈，會(huì)在復(fù)制時(shí)從線狀轉(zhuǎn)換成環(huán)狀或發(fā)夾結(jié)構(gòu)來避開末端復(fù)制的問題（如T4噬菌體和草履蟲的線狀線粒體DNA）。在真核生物中：對(duì)于前導(dǎo)鏈來說，因?yàn)檎婧松锏膹?fù)制是從復(fù)制叉向兩個(gè)方向復(fù)制的，前導(dǎo)鏈的切去的RNA的部分，可以被復(fù)制叉另外一個(gè)方向的后隨鏈補(bǔ)平，不存在末端問題而對(duì)于滯后鏈來說，其5’端就是通過端粒酶來完成末端復(fù)制了。真核生物的末端問題只有后隨鏈才有末端問題，前導(dǎo)鏈不存在末端問題，為什么？端粒的結(jié)構(gòu)與功能1972年JamesWatson提出了“復(fù)制末端問題”，復(fù)制DNA的DNA多聚酶并不能將線性染色體末端的DNA完全復(fù)制。也就是說在線性DNA復(fù)制時(shí)，DNA多聚酶留下染色體末端一段DNA（一段端粒）不復(fù)制。端粒DNA復(fù)制的特點(diǎn)是在每次DNA復(fù)制中，每條染色體的3'端均有一段DNA無法得到復(fù)制，隨著細(xì)胞每次分裂，染色體3'一末端將持續(xù)喪失50-200bp的DNA，因而細(xì)胞分裂具有一定的限度，即分裂壽命。所以端粒的長(zhǎng)度可作為細(xì)胞的“分裂時(shí)鐘”，反映細(xì)胞分裂能力。端粒酶的結(jié)構(gòu)端粒酶在結(jié)構(gòu)上為一核糖核蛋白復(fù)合體,由RNA和結(jié)合的蛋白質(zhì)組成,是RNA依賴的DNA聚合酶。它是一種特殊的能合成端粒DNA的酶,通過明顯的模板依賴方式每次添加一個(gè)核苷酸。端粒酶實(shí)質(zhì)上是一種特殊的逆轉(zhuǎn)錄酶端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶RNA(hTR)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）端粒酶結(jié)合蛋白（TEP）端粒酶RNA是第一個(gè)被克隆的端粒酶組分。端粒酶RNA含有與同源端粒DNA序列TTAGGG的互補(bǔ)序列,核糖核酸酶H切割此模板區(qū),能使體外消除端粒酶延長(zhǎng)端粒的功能。人類TERT（hTERT）基因?yàn)橐粏慰截惢?定位于5p15.33,具有7個(gè)保守序列結(jié)構(gòu)域單元和端粒酶特異性結(jié)構(gòu)域單元T。破壞TERT將消除端粒酶活性并致端?？s短。TEP1、生存動(dòng)力神經(jīng)細(xì)胞基因(SMN)產(chǎn)物、hsp90、PinX1、Est1p和Est3p

線性DNA在復(fù)制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出現(xiàn)縮短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，進(jìn)行延長(zhǎng)反應(yīng)。端粒酶是一種RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，它可以其RNA為模板，通過逆轉(zhuǎn)錄過程對(duì)末端DNA鏈進(jìn)行延長(zhǎng)。

端粒酶(telomerase)的作用機(jī)制轉(zhuǎn)座

TranspositionDNA的轉(zhuǎn)座基本概念：轉(zhuǎn)座子最先由BarbaraMcClintock于20世紀(jì)40年代在玉米遺傳學(xué)研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的。DNA的轉(zhuǎn)座：由可移位因子介導(dǎo)的遺傳物質(zhì)重排現(xiàn)象。轉(zhuǎn)座子（transposon,Tn）是存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位。轉(zhuǎn)座子存在于所有生物體內(nèi)，人類基因組中有約35%以上的序列為轉(zhuǎn)座子序列，其中大部分與疾病有關(guān)。轉(zhuǎn)座子分為兩大類：1.轉(zhuǎn)座子的分類和結(jié)構(gòu)特征1.插入序列（insertionalsequence,IS）2.復(fù)合型轉(zhuǎn)座子（compositetransposon）最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子，不含任何宿主基因。它們是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞常帶有少于10個(gè)IS序列。轉(zhuǎn)座子常被定位到特定的基因，造成該基因突變。插入序列（IS因子）IS因子的特征：很小的DNA片段末端具有倒置重復(fù)序列(反向互補(bǔ))復(fù)制宿主靶位點(diǎn)DNA（4-15bp）可獨(dú)立存在，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白，可作為其他轉(zhuǎn)座子的組成部分.特征：復(fù)合型轉(zhuǎn)座子兩翼往往是兩個(gè)相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插到功能基因的兩端就可能產(chǎn)生復(fù)合型轉(zhuǎn)座子。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子是一類帶有某些抗藥性基因（或其它宿主基因）的轉(zhuǎn)座子。復(fù)合型轉(zhuǎn)座子復(fù)合型轉(zhuǎn)座子還有一類無IS序列、體積龐大的的轉(zhuǎn)座子（5000bp以上）——TnA家族。TnA特征：攜帶3個(gè)基因，其中一個(gè)為編碼β-內(nèi)酰胺酶基因AmpR，使氨芐青霉素失活；兩翼都有38bp的倒置重復(fù)序列（IR）轉(zhuǎn)座后靶位點(diǎn)大都成為正向重復(fù)序列限制性內(nèi)切酶在靶DNA上