微生物的實驗室培養(yǎng)(新課)

㈠.微生物的類群微生物原核類:真核類非細胞類：細菌、支原體、放線菌、藍藻個體微小、結(jié)構(gòu)簡單酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：顯微藻類、原生生物（如：草履蟲、變形蟲等）病毒、類病毒、朊病毒◆微生物的共同特點：一.微生物基礎知識1.細菌的形態(tài)細菌主要是以二分裂的方式進行增殖（如右圖）2.細菌的繁殖3.細菌的菌落⑴.定義：單個或者少數(shù)細菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時，會形成一個肉眼可見的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細胞群體，叫做菌落。⑵.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。⑶.功能：每種細菌在一定條件下所形成的菌落，可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。幾種菌落及其形態(tài)幾種菌落及其形態(tài)4.病毒的結(jié)構(gòu):由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒的結(jié)構(gòu)微生物需要的五大類營養(yǎng)要素物質(zhì)是：㈡.微生物需要的營養(yǎng)物質(zhì)及功能1.碳源2.氮源3.生長因子4.無機鹽5.水：凡是能為微生物提供所需碳元素的營養(yǎng)物質(zhì)。①無機碳源：CO2；NaHCO3等②有機碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等①構(gòu)成細胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)微生物的能源⑴.概念⑵.來源：⑶.作用：1.微生物的碳源①無機氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有機氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠為微生物提供N元素的營養(yǎng)物質(zhì)。主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。2.微生物的氮源⑴.概念：⑵.來源：⑶.作用：3.生長因子⑶.常見的生長因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生長不可缺少的微量有機物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。課題1微生物的實驗室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應用一、培養(yǎng)基作用、種類二、無菌技術三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無機鹽和水等培養(yǎng)基的基本成分

液體培養(yǎng)基：（一般用錐形瓶盛裝）

固體培養(yǎng)基：（一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝，在液體培養(yǎng)基的基礎上再添加瓊脂。）培養(yǎng)基的種類1、按物理狀態(tài)分：2、按功能分：選擇培養(yǎng)基：加入某種化學物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無氮培養(yǎng)基:不加含碳有機物的無碳培養(yǎng)基:

幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細菌二、無菌技術

無菌技術泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術。獲得純凈培養(yǎng)物的關鍵是防止外來雜菌的入侵，無菌技術就是防止雜菌污染的操作技術。消毒1、無菌技術的種類滅菌使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來殺死部分對人體有害的微生物。對實驗操作的空間、操作者的衣著和手進行清潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進行滅菌；接種的過程要在酒精燈火焰附近進行。避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸使用較為強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。（1）、灼燒滅菌：接種用具和接種過程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進行灼燒滅菌。2、常用的消毒與滅菌的方法（2）、干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170OC中加熱1～2h即可。（3）、高壓蒸汽滅菌：將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa，溫度到121OC后，維持15～30min即可。（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計算：物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.稱量

準確稱取各種成分，注意事項：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后及時蓋上瓶蓋。三、實驗操作3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來水定溶至100mL。

4.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報紙包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時倒平板。倒平板操作的討論

1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時倒平板。用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時即可開始倒平板。

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？

通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

4.在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。（二）純化大腸桿菌微生物接種方法常見的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1.平板劃線法

通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個細胞繁殖而來的肉眼可見的子細胞群體稱菌落。平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長情況1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)？

第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。平板劃線法的討論

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？

以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？

劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。

2.稀釋涂布平板法

將菌液進行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個細胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。稀釋涂布平板法操作過程分兩個步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。系列稀釋操作101102103104105106(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號。(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復步驟2，直至到第六支試管。涂布平板操作(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。稀釋涂布平板法獲取的菌落涂布平板操作討論

涂布平板的所有操作都應在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應如何進行無菌操作？

應從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。將接種后和未接種（作為對照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進行觀察并記錄結(jié)果。

1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長？如果有菌落生長，說明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四、結(jié)果分析與評價

3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實驗結(jié)果相同嗎？如果不同，請分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會有明顯不同。隨著時間的延長、菌落的不斷生長，使菌落不斷增大。

4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請分析其可能的原因。

無菌操作未達到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是