微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)(新課)

㈠.微生物的類群微生物原核類:真核類非細(xì)胞類：細(xì)菌、支原體、放線菌、藍(lán)藻個(gè)體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單酵母菌、霉菌、食用菌真菌：原生生物：顯微藻類、原生生物（如：草履蟲(chóng)、變形蟲(chóng)等）病毒、類病毒、朊病毒◆微生物的共同特點(diǎn)：一.微生物基礎(chǔ)知識(shí)1.細(xì)菌的形態(tài)細(xì)菌主要是以二分裂的方式進(jìn)行增殖（如右圖）2.細(xì)菌的繁殖3.細(xì)菌的菌落⑴.定義：?jiǎn)蝹€(gè)或者少數(shù)細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上大量繁殖時(shí)，會(huì)形成一個(gè)肉眼可見(jiàn)的、具有一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群體，叫做菌落。⑵.特征：大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等。⑶.功能：每種細(xì)菌在一定條件下所形成的菌落，可以作為菌種鑒定的重要依據(jù)。幾種菌落及其形態(tài)幾種菌落及其形態(tài)4.病毒的結(jié)構(gòu):由核酸和蛋白質(zhì)構(gòu)成。病毒的結(jié)構(gòu)微生物需要的五大類營(yíng)養(yǎng)要素物質(zhì)是：㈡.微生物需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及功能1.碳源2.氮源3.生長(zhǎng)因子4.無(wú)機(jī)鹽5.水：凡是能為微生物提供所需碳元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。①無(wú)機(jī)碳源：CO2；NaHCO3等②有機(jī)碳源：糖類、脂肪酸、花生粉餅、石油等①構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)和一些代謝產(chǎn)物②異養(yǎng)微生物的能源⑴.概念⑵.來(lái)源：⑶.作用：1.微生物的碳源①無(wú)機(jī)氮源：N2、NH4+、NO3-、NH3等。②有機(jī)氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡是能夠?yàn)槲⑸锾峁㎞元素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。主要用于合成蛋白質(zhì)、核酸及含N的代謝產(chǎn)物。2.微生物的氮源⑴.概念：⑵.來(lái)源：⑶.作用：3.生長(zhǎng)因子⑶.常見(jiàn)的生長(zhǎng)因子：⑴.概念：⑵.作用：微生物生長(zhǎng)不可缺少的微量有機(jī)物。酶和核酸的組成成分。維生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等。課題1微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)專題2:微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用一、培養(yǎng)基作用、種類二、無(wú)菌技術(shù)三、制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基四、純化大腸桿菌主要內(nèi)容一、培養(yǎng)基人們按照微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配置出供其生長(zhǎng)繁殖的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)稱培養(yǎng)基一般的培養(yǎng)基均需要碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽和水等培養(yǎng)基的基本成分

液體培養(yǎng)基：（一般用錐形瓶盛裝）

固體培養(yǎng)基：（一般用試管或培養(yǎng)皿盛裝，在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上再添加瓊脂。）培養(yǎng)基的種類1、按物理狀態(tài)分：2、按功能分：選擇培養(yǎng)基：加入某種化學(xué)物質(zhì)，從眾多微生物中分離出所需微生物鑒別培養(yǎng)基：加入某種試劑，鑒別不同種類的微生物加入青霉素的培養(yǎng)基:不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:

幾種選擇培養(yǎng)基舉例：分離酵母菌、霉菌等真菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物唯一碳源為纖維素的培養(yǎng)基分解纖維素的細(xì)菌二、無(wú)菌技術(shù)

無(wú)菌技術(shù)泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法技術(shù)。獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止外來(lái)雜菌的入侵，無(wú)菌技術(shù)就是防止雜菌污染的操作技術(shù)。消毒1、無(wú)菌技術(shù)的種類滅菌使用較為溫和的方法（酒精、紫外線）來(lái)殺死部分對(duì)人體有害的微生物。對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔消毒；將培養(yǎng)皿、接種用具和培養(yǎng)基等進(jìn)行滅菌；接種的過(guò)程要在酒精燈火焰附近進(jìn)行。避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與周圍物品接觸使用較為強(qiáng)烈的理化因素殺死物體內(nèi)外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。（1）、灼燒滅菌：接種用具和接種過(guò)程中的試管口或瓶口放在酒精燈火焰的充分燃燒層中進(jìn)行灼燒滅菌。2、常用的消毒與滅菌的方法（2）、干熱滅菌：將玻璃器皿、金屬用具等能耐高溫并需要保持干燥的物品放到干熱滅菌箱內(nèi)，在160～170OC中加熱1～2h即可。（3）、高壓蒸汽滅菌：將需滅菌的物品放到盛有水的高壓滅菌鍋內(nèi)煮沸，待冷空氣排盡后，密閉繼續(xù)加熱至鍋內(nèi)壓力到100kPa，溫度到121OC后，維持15～30min即可。（一）制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基1.計(jì)算：物質(zhì)牛肉膏蛋白胨NaCl瓊脂水重量5g10g5g20g定溶至1000mL2.稱量

準(zhǔn)確稱取各種成分，注意事項(xiàng)：牛肉膏要放在稱量紙上稱量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，稱取時(shí)動(dòng)作要迅速，稱后及時(shí)蓋上瓶蓋。三、實(shí)驗(yàn)操作3.溶化：先將牛肉膏連同稱量紙一起放入燒杯，加少量水，加熱至牛肉膏溶化并與稱量紙分離后，用玻璃棒取出稱量紙。加入蛋白胨和氯化鈉，用玻璃棒攪拌使之溶解，再加入瓊脂，攪拌，待溶解后，加自來(lái)水定溶至100mL。

4.滅菌：將配制好的培養(yǎng)基放到錐形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮紙），連同培養(yǎng)皿（3～5套，用幾層報(bào)紙包好）一起放到高壓鍋內(nèi)滅菌。

5.倒平板：待培養(yǎng)基冷卻到50OC左右時(shí)倒平板。倒平板操作的討論

1.培養(yǎng)基滅菌后要冷卻到50OC時(shí)倒平板。用什么辦法來(lái)估計(jì)培養(yǎng)基的溫度？

用手觸摸錐形瓶，溫度下降到剛剛不燙手時(shí)即可開(kāi)始倒平板。

2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰？

通過(guò)灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。

3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？

平板冷凝后，皿蓋上會(huì)凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。

4.在倒平板的過(guò)程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個(gè)平板還能用來(lái)培養(yǎng)微生物嗎？為什么？

空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個(gè)平板培養(yǎng)微生物。（二）純化大腸桿菌微生物接種方法常見(jiàn)的有平板劃線法和稀釋涂布平板法。1.平板劃線法

通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后可以分離到由一個(gè)細(xì)胞繁殖而來(lái)的肉眼可見(jiàn)的子細(xì)胞群體稱菌落。平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況平板劃線法獲取的微生物經(jīng)恒溫培養(yǎng)后的生長(zhǎng)情況1、為什么在操作的第一步以及劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時(shí)，仍然需要灼燒接種環(huán)？

第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時(shí)，接種環(huán)上的菌種直接來(lái)源于上次劃線的末端，從而通過(guò)劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時(shí)菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。劃線結(jié)束后仍然要灼燒接種環(huán)，能及時(shí)殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。平板劃線法的討論

2.在灼燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進(jìn)行劃線？

以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。

3.在作第二次以及其后的劃線操作時(shí)，為什么總是從上一次劃線的末端開(kāi)始劃線？

劃線后，線條末端細(xì)菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開(kāi)始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個(gè)細(xì)菌繁殖而來(lái)的菌落。

2.稀釋涂布平板法

將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面進(jìn)行培養(yǎng)。

在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物將分散成單個(gè)細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)的菌落。稀釋涂布平板法操作過(guò)程分兩個(gè)步驟，即系列稀釋操作和涂布平板操作。系列稀釋操作101102103104105106(1)將分別盛有9mL水的試管滅菌并編號(hào)。(2)用移液管吸取1mL培養(yǎng)的菌液，注入第二支試管中，輕壓橡皮頭，吹吸三次使之充分混勻。(3)從101倍稀釋的試管中吸取1mL稀釋液，注入第三支試管中，重復(fù)步驟2，直至到第六支試管。涂布平板操作(1)將涂布器浸在盛有70％的酒精的燒杯中。(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培養(yǎng)基表面。(3)將沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷卻8～10s。(4)用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。稀釋涂布平板法獲取的菌落涂布平板操作討論

涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進(jìn)行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無(wú)菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進(jìn)行無(wú)菌操作？

應(yīng)從操作的各個(gè)細(xì)節(jié)保證“無(wú)菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍等等。將接種后和未接種（作為對(duì)照組）的培養(yǎng)基均放到370C的恒溫箱中，培養(yǎng)12～24h后進(jìn)行觀察并記錄結(jié)果。

1.未接種的培養(yǎng)基表面是否有菌落生長(zhǎng)？如果有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明了什么？

未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2d后無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則需要重新制備。

2.在接種大腸桿菌的培養(yǎng)基上，能否觀察到獨(dú)立的菌落？它們的大小、形狀、顏色相似嗎？

如果接種成功的話，在培養(yǎng)基的表面可觀察到大小、形狀、顏色相似的菌落。四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

3.培養(yǎng)12h和24h后，觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相同嗎？如果不同，請(qǐng)分析產(chǎn)生差異的原因？

培養(yǎng)12h與24h后的大腸桿菌菌落的大小會(huì)有明顯不同。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)、菌落的不斷生長(zhǎng)，使菌落不斷增大。

4.如果在培養(yǎng)基上觀察到不同形態(tài)的菌落，請(qǐng)分析其可能的原因。

無(wú)菌操作未達(dá)到要求：可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底；可能是