第四章-蛋白質(zhì)共價結(jié)構(gòu)

第四章蛋白質(zhì)及其共價結(jié)構(gòu)第一節(jié)蛋白質(zhì)通論1838年Mulder研究了血清、蛋清、蠶絲等物質(zhì)的元素組成后,發(fā)現(xiàn)它們均可以用C40H62N10O12來表示,命名為“Protein”(意為totakethefirstplace),并發(fā)展成“基團”學說。一、蛋白質(zhì)化學研究史19世紀末從蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物分離得到了

13種氨基酸,基團學說滅亡。1902年Fischer,Hofmeister同時提出肽鍵理論。1924年Svedberg發(fā)明超離心機。30年代Bergmann合成出只含L型氨基酸的多肽。1950年P(guān)auling提出蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)的基本單位：α-螺旋和β-折疊。1953年Sanger確定了牛胰島素的一級結(jié)構(gòu)。1958年P(guān)erutz&Kendrew用X光衍射法確定了肌紅蛋白的立體結(jié)構(gòu)。1961年Anfinsen證明蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定其立體結(jié)構(gòu)。80年代蛋白質(zhì)工程的興起。1997年蛋白組研究的概念。1999年蛋白質(zhì)芯片技術(shù)出現(xiàn)。對蛋白質(zhì)化學有突出貢獻的Nobel獎獲得者1902年H.E.Fischer(德，化)肽鍵理論，多肽合成1910年A.Kossel(德，醫(yī))組氨酸、組蛋白的發(fā)現(xiàn)，堿基的發(fā)現(xiàn)1915年W.H.Bragg/W.L.Bragg(德，物）用X射線測

定晶體物質(zhì)結(jié)構(gòu)1926年T.Svedberg(瑞，化)用超離心手段決定蛋白質(zhì)的分子量1946年J.B.Summer(美，化)蛋白質(zhì)酶的結(jié)晶，證明酶的本質(zhì)為protein1948年A.W.K.Tiselius(瑞，化)電泳裝置的開發(fā)，血清蛋白的研究1952年A.J.P.Martin/R.L.M.Synge(英，化)分配層

析發(fā)明，氨基酸的分離1954年L.Pauling(美，化)蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)，抗原抗體

反應(yīng)理論1958年F.Sanger(英，化)胰島素一級結(jié)構(gòu)的測定1962年M.F.Perutz/J.C.Kendrew(英，化)X射線確

定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)1972年G.M.Edelman/R.R.Porter(美，醫(yī)〕抗體的化學

構(gòu)造與功能的解明1972年W.H.Stein/S.More(美，化)RNase的一級結(jié)構(gòu)

和活性中心的解明1972年

C.B.Anfinsen(美，化)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)決定

其立體結(jié)構(gòu)1998年S.B.Prusiner(美，醫(yī))Prion:蛋白立體結(jié)構(gòu)

的變化導致疾病蛋白質(zhì)（protein）是由一條或多條具有確定氨基酸序列的多肽鏈組成的、具有特定空間結(jié)構(gòu)的生物大分子。這類生物大分子大多數(shù)具有生理活性，少數(shù)作為結(jié)構(gòu)支持物質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈是由幾十至數(shù)百個α-氨基酸通過脫水縮合形成酰胺鍵連接而成；各種氨基酸在蛋白質(zhì)中按特定的順序排列使得蛋白質(zhì)能夠形成特定空間結(jié)構(gòu)。二、蛋白質(zhì)及其化學組成構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸只有20種，正是這20種基本氨基酸的不同重復和排列形成生命世界中數(shù)以萬計的形形色色的具有各種功能的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)含C、H、O、N、S等元素，有的蛋白還含P、Fe、Zn、Cu等其他元素。不同蛋白質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)不同，但各元素所占的百分數(shù)基本一致，如蛋白質(zhì)的平均含氮量為16%?？蓳?jù)此數(shù)據(jù)計算樣品中蛋白質(zhì)的含量。碳氫氧氮硫其它

50%7%23%16%0-3%微量

蛋白質(zhì)的含量=蛋白氮×6.25

三、蛋白質(zhì)的基本組成單位氨基酸是蛋白質(zhì)的構(gòu)件分子。蛋白質(zhì)經(jīng)強酸、強堿、酶水解后，可以得到多種氨基酸。在動植物組織中可以分離得到26～30種不同的氨基酸。第一個氨基酸早在兩個世紀前就已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，而最后一個氨基酸在1935年才發(fā)現(xiàn)。直到1965年才搞清楚，只有20種氨基酸才是合成蛋白質(zhì)的原材料（稱為Primaryaminoacid）。（一）按化學組成分:1.單純蛋白(simpleprotein)：也稱簡單蛋白質(zhì)，完全由氨基酸組成的蛋白質(zhì)。

2.綴合蛋白(conjugatedprotein)也稱結(jié)合蛋白質(zhì)，由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成，非蛋白質(zhì)部分稱為輔基（prostheticgroup）或配基(ligand)。四、蛋白質(zhì)的分類1.單純蛋白(simpleprotein)1).清蛋白albumin溶于水、鹽、酸、堿溶液,加熱凝固(血清)2).球蛋白globulin溶于鹽、酸、堿溶液,

加熱凝固(血清)3).谷蛋白glutelin溶于酸、堿溶液(谷種)4).谷醇溶蛋白prolamin溶于70-90%酒精、酸、堿溶液(谷種)5).硬蛋白scleroprotein不溶(毛、發(fā)、爪、角等)6).組蛋白histone溶于水、酸溶液

(細胞核)7).魚精蛋白protamine溶于水、酸溶液

(精子)8).溶菌酶9).核糖核酸酶2.綴合蛋白(conjugatedprotein)1).核蛋白nucleoprotein含核酸(細胞核)2).磷蛋白phosphoprotein含有磷酸如：酪蛋白3).脂蛋白lipoprotein含lipid(動植物細胞)4).金屬蛋白（metalloprotein）含金屬，如：鐵蛋白含F(xiàn)e。5).糖蛋白glucoprotein含糖及其衍生物

(動植物細胞)6).血紅素蛋白（hemoprotein）含血紅素輔基7).黃素蛋白（flavoprotein）含黃素輔基（FAD或FMN）如琥珀酸脫氫酶（含F(xiàn)AD）?？煞譃榭扇苄缘鞍踪|(zhì)、醇溶性蛋白質(zhì)和不溶性蛋白質(zhì)。可溶性蛋白質(zhì)是指可溶于水、稀中性鹽和稀酸溶液，如清蛋白、球蛋白、組蛋白、魚精蛋白等。醇溶性蛋白質(zhì)是一類不溶于水而溶于70％～90%乙醇的蛋白質(zhì)，如谷醇溶蛋白。不溶性蛋白質(zhì)既不溶于水、稀鹽溶液，也不溶于一般有機溶劑，如角蛋白、膠原蛋白、絲蛋白、彈性蛋白等。（二）按溶解度的蛋白質(zhì)分類

（三）按形狀的蛋白質(zhì)分類

蛋白質(zhì)根據(jù)形狀可分為

1.纖維蛋白（fibrousprotein）

2.球蛋白（globularprotein）

3.膜蛋白（Membranous、protein）纖維蛋白質(zhì)分子的長短軸具有較大的比例（>10），呈規(guī)則性細棒狀或纖維狀。這類蛋白質(zhì)在機體內(nèi)主要起結(jié)構(gòu)作用，如角蛋白、膠原蛋白、絲蛋白、彈性蛋白，他們不溶于水和稀鹽溶液。還有一些纖維狀蛋白質(zhì)如肌球蛋白和血纖蛋白原是可溶性的，在體內(nèi)具有生理活性。球狀蛋白質(zhì)分子的長短軸比例比較接近（≤3～4）；結(jié)構(gòu)緊密，類似球形或橢球形，在機體內(nèi)呈溶解狀態(tài)，執(zhí)行生理功能。細胞中的絕大多數(shù)可溶性蛋白質(zhì)都屬于球狀蛋白質(zhì)如血紅蛋白、胞質(zhì)酶類、細胞因子等。膜蛋白則定位于各種生物膜上，其結(jié)構(gòu)有限，到目前為止，只有全α-螺旋或全β-折疊結(jié)構(gòu)，一般由多個結(jié)構(gòu)域組成，但至少有一個結(jié)構(gòu)域是脂溶性的，如細菌視紫紅質(zhì)。1.酶類占細胞內(nèi)蛋白質(zhì)種類的絕大部分2.運輸?shù)鞍?/p>

albumin,hemoglobin,transferrin等3.收縮運動蛋白actin,myosin,tubolin等4.激素蛋白insulin,growthhormone等5.細胞因子EGF,IL-2等6.受體蛋白insulinreceptor7.毒素蛋白choleratoxin,ricin,pertussist.

8.防御蛋白IgG等9.營養(yǎng)貯藏蛋白prolamine,glutelin等10.結(jié)構(gòu)蛋白keratin,collagen等11.特殊蛋白甜蛋白、抗凍蛋白、彈性蛋白等（四）按功能的蛋白質(zhì)分類法

1.活性蛋白質(zhì)（activeprotein）

包括生命活動過程中一切有活性的蛋白質(zhì)以及它們的前體分子，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)屬于活性蛋白質(zhì)，包括酶、激素蛋白、運輸?shù)鞍祝ㄞD(zhuǎn)運蛋白）、貯存蛋白、運動蛋白、保護或防御蛋白、受體蛋白、控制生長和分化蛋白、毒蛋白、膜蛋白等。

以上功能又可歸納為兩類：2.非活性蛋白質(zhì)（passiveprotein）對生物體起支持和保護作用，主要指硬蛋白包括角蛋白、膠原蛋白、絲蛋白、彈性蛋白等。五、蛋白質(zhì)的功能

1.生物催化劑

2.信息傳導3.調(diào)節(jié)基因表達的調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子4.轉(zhuǎn)運5.運動

6.儲藏7.結(jié)構(gòu)物質(zhì)8.保護9.特殊功能六、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織層次1952年丹麥人Linderstrom-Lang最早提出蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以分成四個層次:

一級結(jié)構(gòu)primarystructure：指的是多肽鏈共價主鏈的氨基酸順序。

二級結(jié)構(gòu)secondarystructure：指的是多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。如纖維狀蛋白質(zhì)中的α-螺旋和β-折疊片。

三級結(jié)構(gòu)tertiarystructure：是指多肽鏈借助各種次級鍵（非共價鍵）盤繞成具有特定肽鏈走向的緊密球狀構(gòu)象。

四級結(jié)構(gòu)quanternarystructure：是指寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間在空間上的相互關(guān)系或結(jié)合方式。寡聚蛋白質(zhì)中各個亞基又有自己特定的三維構(gòu)象。介于二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還存在超二級結(jié)構(gòu)（二級結(jié)構(gòu)的組合）和結(jié)構(gòu)域（在空間上相對獨立）這兩個層次。

蛋白質(zhì)一、二、三、四級結(jié)構(gòu)示意圖七、蛋白質(zhì)的大小蛋白質(zhì)是相對分子質(zhì)量很大的生物分子，不同蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量變化范圍非常大，從約6000到1×106甚至更大。對于特定的蛋白質(zhì)而言其相對分子質(zhì)量是不確定的。原因在于蛋白質(zhì)分子不同于其他分子，其分子的概念有時是不確定的。對于單體蛋白質(zhì)來說不存在上述問題，對于寡聚蛋白質(zhì)來說其分子質(zhì)量是與其分子概念密切相關(guān)的。蛋白質(zhì)、多肽和寡肽這些名詞的含義在一定程度上有重疊，經(jīng)常容易混淆。

1.肽和肽鍵定義一個氨基酸的α-羧基和另一個氨基酸的α-氨基脫水縮合而成的化合物稱肽。氨基酸之間脫水后形成的鍵（酰胺鍵）稱肽鍵。構(gòu)成肽的每一個氨基酸單位因脫去1分子水被稱為氨基酸殘基。多個氨基酸通過肽鍵連接起來的鏈狀物稱肽鏈。根據(jù)肽鏈的長短分寡肽、多肽、和蛋白質(zhì)。第二節(jié)肽蛋白質(zhì)和肽以肽鍵方式連接有以下依據(jù)：1.蛋白質(zhì)中游離的α-羧基和α-氨基很少。2.人工多肽能被蛋白酶水解。3.蛋白質(zhì)也有雙縮脲反應(yīng)。4.人工多肽與蛋白質(zhì)光譜一致。5.人工合成蛋白質(zhì)—牛胰島素。肽鍵將氨基酸與氨基酸頭尾相連

當兩個氨基酸通過肽鍵相互連接形成二肽，在一端仍然有游離的氨基和另一端有游離的羧基，每一端可連接更多的氨基酸。氨基酸能以肽鍵相互連接形成長的、不帶支鏈的寡肽（20個氨基酸殘基以下）和多肽（多于20個氨基酸殘基）和蛋白質(zhì)（多于50氨基酸殘基）。多肽仍然有游離的α-氨基和α-羧基，除非首尾相連形成環(huán)肽。

肽鏈表示法：游離α-氨基在左，游離α-羧基在右，氨基酸之間用“-”表示肽鍵。

H2N-絲氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸-COOHSer-Leu-Phe（S-L-F）Ser-Leu-Phe≠

Phe-Leu-Ser2.多肽與蛋白質(zhì)的區(qū)別根據(jù)肽鏈的長短依次稱為寡肽、多肽和蛋白質(zhì)，通常相對分子質(zhì)量在1500以下，稱謂“寡肽”；相對分子質(zhì)量在1500～6000，為多肽；相對分子質(zhì)量在6000～1×106，為蛋白質(zhì)。在很多場合多肽和蛋白質(zhì)可以等同使用。區(qū)別：蛋白質(zhì)表現(xiàn)功能需要有特定的空間構(gòu)象，多肽則不需要形成穩(wěn)定的空間構(gòu)象；分子量的差別。根據(jù)蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量可以初步計算蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的數(shù)目：如相對分子質(zhì)量為12100的蛋白質(zhì)其氨基酸殘基為110個（12100/110）。

20個氨基酸平均相對分子質(zhì)量為138；蛋白質(zhì)中較小的氨基酸較多（Gly75最小、Trp204最大），蛋白質(zhì)中氨基酸平均相對分子質(zhì)量為128，成為氨基酸殘基時再脫去一分子水，蛋白質(zhì)中氨基酸殘基平均相對分子質(zhì)量為110。3.活性肽具有天然生物活性的肽。（1）谷胱甘肽（GSH）H2N-CHCH2CH2CO—COOHγ-GluNHCHCO—CH2SHCysNHCH2COOHGly2GSHGSSG-2H﹢2H（2）催產(chǎn)素和加壓素均為9肽，第2位和第7位氨基酸不同。催產(chǎn)素使子宮和乳腺平滑肌收縮，具有催產(chǎn)和促使乳腺排乳作用。加壓素促進血管平滑肌收縮，升高血壓，減少排尿。（3）促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）

39肽，活性部位為第4～10位的7肽片段：Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。（4）腦肽

腦啡肽具有強烈的鎮(zhèn)痛作用（強于嗎啡），不上癮。

Met-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-MetLeu-腦啡肽Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

β-內(nèi)啡肽（31肽）具有較強的嗎啡樣活性與鎮(zhèn)痛作用。（5）胰高血糖素由胰島α-細胞分泌（β-細胞分泌胰島素），29肽，調(diào)節(jié)維持血糖濃度。

（6）短桿菌肽S(環(huán)十肽)

L-Leu-D-Phe-L-Pro-L-Val

L-OrnL-Orn

L-Val-L-Pro-D-Phe-L-Leu由細菌分泌的多肽，有時也都含有D-氨基酸和一些不常見氨基酸，如鳥氨酸（Orn）。

（7）鵝肌肽和肌肽在骨骼肌中豐富，功能尚不清楚。鵝肌肽（anserine）：β-Ala-1-Me-His

肌肽（carnosine）:β-Ala-His4.肽鍵的特點多肽的主鏈結(jié)構(gòu)都是一樣的，不同之處在于其側(cè)鏈R基的序列不同。多肽鏈的主鏈骨架（mainchain）是通過-N-Cα-C-序列重復排列而成，這里N是酰胺氮，Cα是氨基酸殘基的α碳，C是羰基碳。肽鍵的化學本質(zhì)是酰胺鍵，肽鏈中的酰胺基稱為肽基（peptideqroup）或肽單位（peptideunit）。理論上肽鏈主鏈（-N-Cα-C-）上的3種鍵（N-Cα鍵，Cα-C鍵和羰基

C-N）都是單鍵，所以繞多肽主鏈上的任一共價鍵都可以發(fā)生旋轉(zhuǎn)。肽基CαCHδ﹢NCαδ-O由于酰胺氮孤電子對離域和羰基碳軌道重疊,酰胺氮和羰基氧之間發(fā)生共振作用形成共振雜化體。C-N處于平面sp2雜化；C-O由一個σ和一個π鍵連接C-N參于π鍵形成，羰基O留有一個孤電子對，帶負電荷共振雜化的結(jié)果：(1)具有部分雙鍵的性質(zhì)（40％），限制肽鍵的自由旋轉(zhuǎn)。(2)使得組成肽基的4個原子和2個相鄰的Cα原子傾向于共平面，形成所謂多肽主鏈的酰胺平面也稱肽基平面或肽平面。(3)共振雙鍵鍵長0.133nm比典型雙鍵長,比單鍵短。肽鍵平面典型C=N為0.125nm(4)雜化中間狀態(tài)，N帶部分正電荷（0.28），O帶部分負電荷（0.28）。

(5)肽平面內(nèi)兩個Cα可以存在順反構(gòu)型。在反式構(gòu)型中，兩個Cα原子及其側(cè)鏈R基團彼此遠離，而在順式構(gòu)型中它們相互接近，引起Cα上的側(cè)鏈R基之間的空間位阻，所以反式構(gòu)型比順式穩(wěn)定，兩者相差8kJ/mol。但是X-Pro是例外。

5.肽的理化性質(zhì)1）兩性解離與等電點肽與氨基酸一樣具有酸、堿性質(zhì)，它的解離主要取決于肽鏈的末端氨基、末端羧基和側(cè)鏈R基。由于肽中N端自由氨基和C端自由羧基之間的距離比氨基酸中的大，因此它們之間的靜電引力較弱。肽中C端-COOH的pK略大于氨基酸中的pK值，pK1↑。N端-NH+3的pK略小于氨基酸中的pK值，pK2↓。R基的pK變化不大。

可解離功能團推測的pKa值α-COOH3.7側(cè)鏈COOH（Glu或Asp）4.6咪唑基（His）7.0α-+NH37.8-SH（Cys）8.8酚OH（Tyr）9.6ε-+NH3（Lys）10.2胍基（Arg）>12根據(jù)模型化合物得到的數(shù)據(jù)推測的多肽鏈中可解離功能團的pKa值多肽的滴定曲線比較復雜，很難用單個側(cè)鏈基團的解離來分析。根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程

pH

=

pKa

+

lg([A-]/[HA])在給定的pH下，總是可以確定每個側(cè)鏈基團占優(yōu)勢的離子狀態(tài)。當溶液pH大于解離側(cè)鏈的pKa值時，占優(yōu)勢的離子形式是該側(cè)鏈的共軛堿（pH>pKa→[HA]<[A-]），反之占優(yōu)勢的離子形式是共軛酸（pH<pKa→[HA]>[A-]）。肽的等電點：當溶液中多肽所攜帶的凈電荷為零時，該溶液pH就是該肽的等電點。肽的等電點計算：已知末端α-COOH，pK3.6，末端α-NH3+pK8.0，ε-NH+3pK10.6，請計算四肽Ala-Ala-Lys-Ala的等電點。pI=(8.0+10.6)/2=9.3溶液的pH功能團解離（帶電）狀況占優(yōu)勢離子的靜電荷α-COOH側(cè)鏈COOHα-NH2ε-NH2<3.5—COOH—COOH—+NH3—+NH3+23.7～4.5—COO-—COOH—+NH3—+NH3+14.5～7.8—COO-—COO-—+NH3—+NH307.8～10.2—COO-—COO-—NH2—+NH3-1>10.2—COO-—COO-—NH2—NH2-2甘氨酰谷氨酰賴氨酰丙氨酸

(H2N-Gly-Glu-Lys-Ala-COOH

)的酸堿性質(zhì)分析2）雙縮脲反應(yīng)3）肽鍵的紫外吸收 210～230nm雙縮脲＋堿性CuSO4溶液紫色第三節(jié)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)定義1969年正式將一級結(jié)構(gòu)定義為氨基酸序列和二硫鍵的位置。研究蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，就是要將氨基酸的排列順序說明清楚。一級結(jié)構(gòu)中包含的共價鍵（covalentbond）主要指肽鍵（peptidebond）和二硫鍵（disulfidebond）。二十世紀四十年代起，許多人不遺余力從事蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)研究，Sanger是第一個將一個蛋白質(zhì)（胰島素）的所有氨基酸的排列順序通過高度的實驗技巧分析確定出來。Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr–Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-AlaB鏈15710151920212530Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Ala-Ser-Val-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn15102015A鏈711621SSSS牛胰島素的化學結(jié)構(gòu)S————————S二、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的內(nèi)容1.多肽鏈的數(shù)目。2.每條肽鏈中氨基酸的排列順序。3.二硫鍵的數(shù)目和位置（鏈內(nèi)、鏈間）。牛胰島素由51個氨基酸殘基組成：A鏈：21個氨基酸殘基B鏈：30個氨基酸殘基A鏈和B鏈間2對-S-S-鍵A鏈內(nèi)1對二硫鍵。三、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)測定的步驟1.蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目2.多肽鏈及二硫鍵的拆分與保護(亞基分離)3.多肽鏈氨基酸組成分析4.多肽鏈末端分析5.多肽鏈裂解成肽段（多種方法的部分水解）6.測定肽段氨基酸序列7.重疊肽段方法排序8.二硫鍵位置的確定１.蛋白質(zhì)樣品必須均一，純度在97%以上，同時必須知道其相對分子質(zhì)量、其誤差允許在10%。２.測定某一具體蛋白質(zhì)的氨基酸序列時要解決的問題各有不同，以上步驟是蛋白質(zhì)測序中普遍應(yīng)用的策略。一級結(jié)構(gòu)測定要點1.確定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目根據(jù)蛋白質(zhì)N-末端或C-末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)和蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)，可以確定蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈數(shù)目。如果蛋白質(zhì)由一條多肽鏈構(gòu)成，其末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)應(yīng)與蛋白質(zhì)的摩爾數(shù)相等。如果前者是后者的倍數(shù)，說明該蛋白質(zhì)分子是由多條多肽鏈組成。如果存在多種N-末端或C-末端氨基酸殘基，表明該蛋白質(zhì)由多條不同的多肽鏈組成。2.多肽鏈及二硫鍵的拆分與保護對于由一條以上多肽鏈構(gòu)成的寡聚蛋白質(zhì)，可用變性劑如8mol/L尿素，6mol/L鹽酸胍或高濃度鹽處理，使各亞基拆開。如果多肽鏈（亞基）間是通過共價二硫鍵（-S-S-）交聯(lián)的，則可采用氧化劑或還原劑將二硫鍵斷裂，如胰島素（含兩條多肽鏈）和α-胰凝乳蛋白酶（含3條多肽鏈）等。3.多肽鏈氨基酸組成分析取經(jīng)分離純化的多肽鏈部分樣品，進行完全水解，測定它的氨基酸組成（aminoacidcomposition），并計算出各種氨基酸殘基的數(shù)目。測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。４.多肽鏈末端分析取經(jīng)分離純化的多肽鏈的部分樣品，進行末端殘基的鑒定，以便建立兩個重要的氨基酸序列參考點。5.多肽鏈裂解成肽段用兩種或多種不同的裂解方法，將每條多肽鏈樣品降解成兩套或多套相互重疊的肽段。對每套肽段進行分離、純化，并進行氨基酸組成和末端氨基酸殘基分析。6.測定肽段氨基酸序列常用的肽段測序方法為Edman降解法。根據(jù)Edman降解法的原理，已設(shè)計有商品化的氨基酸自動序列分析儀。質(zhì)譜法。核苷酸序列測定。7.重疊肽段方法排序利用兩套或多套肽段的氨基酸序列彼此間有交錯重疊，可以重構(gòu)出原來的完整多肽鏈的氨基酸序列。

8.二硫鍵位置的確定采用對角線電泳技術(shù)，確定多肽鏈間或鏈內(nèi)二硫鍵的位置。

N末端分析法1.Sanger法2.Edman法3.Dansylchloride法4.酶降解法Sanger試劑(FDNB)標記N末端酸水解穩(wěn)定留在有機溶劑相有機溶劑相抽提Edman降解法DABITC：有色Edman試劑在Edman試劑上加發(fā)色基團有機溶劑相抽提有機溶劑相抽提丹磺酰氯法（DNS法）靈敏度110-9mol

利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)將肽鏈的氨基酸從N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一個接一個游離出來，在不同時間取樣進行分析，根據(jù)所游離的氨基酸的摩爾數(shù)的多少來判斷末端氨基酸的序列。酶解法末端測序亮氨酸氨肽酶：焦谷氨酸氨肽酶：羧肽酶A：水解除Pro、Arg、Lys之外的AA羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶Y：任何一個AA

氨肽酶（aminopeptidase,Apase）法

AlaValGlyAla-Val-Gly亮氨酸氨肽酶（Leucineaminopeptidase,LAP）專一性:A=非極性氨基酸時快A=其它氨基酸時慢ABN端A=Leu時最快焦谷氨酰胺肽酶C末端的分析1.肼解法(hydrazine)2.還原法3.酶降解法

蛋白質(zhì)與無水肼加熱

-------NH-CH-CONH-CH-COOH

||Rn-1Rn

----NH-CH-CONH-NH2+NH2-CH-COOH||Rn-1Rn＋NH2NH2，100℃，5～10h溶于有機溶劑而被去除、或用苯甲醛沉淀去除多種方法確定硼氫化鋰還原法

羧肽酶（carboxypeptidase,Cpase）法羧肽酶A：水解除Pro、Arg、Lys之外的AA羧肽酶B：只水解Arg、Lys羧肽酶Y：任何一個AA二硫鍵的切割與保護1.過甲酸〔performicacid〕

不可逆－CH2SO3H2.亞硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆－R1-S-S-R2

＋

SO3-

R1-S-+R2-S-SO33.還原＋取代保護不可逆巰基乙醇或DTT＋8mol/L尿素或6mol／L鹽酸胍＋碘乙酸－S-CH2-COOH通常采用β-巰基乙醇處理（pH89,室溫下放置數(shù)小時）,可以使-S-S-定量還原為-SH。然后用碘乙酸保護-SH，防止發(fā)生氧化。多肽鏈的專一性裂解化學裂解法:1）溴化氰斷裂CNBr只斷裂由甲硫氨酸殘基的羧基參加形成的肽鍵。由于大多數(shù)蛋白質(zhì)只含有很少的甲硫氨酸，因此CNBr裂解產(chǎn)生的肽段不多。

這些肽段可以用胰蛋白酶處理使成更小的肽段。斷裂反應(yīng)在70％甲酸中進行，使卷曲的多肽鏈松散，暴露甲硫氨酸側(cè)鏈，有利于和CNBr發(fā)生作用。溴化氰基锍甲基硫氰酸肽酰高絲氨酸內(nèi)酯溴化亞氨內(nèi)酯2）羥胺斷裂：羥胺（NH2OH）在pH9下能專一性地斷裂Asn-Gly之間肽鍵。但專一性不很強，Asn-Leu及Asn-Ala鍵也能部分裂解。反應(yīng)式如下：酶解方法：用于肽鏈斷裂的蛋白水解酶是一種肽鏈內(nèi)切酶或叫內(nèi)肽酶（endopeptidase）。常用的有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（也稱糜蛋白酶）、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶等。1）胰蛋白酶（trypsin）胰蛋白酶的專一性強，只斷裂由Lys或Arg殘基的羧基端肽鍵，產(chǎn)生以Arg和Lys為C-末端殘基的肽段。通過化學修飾將待測多肽鏈中Lys殘基或Arg殘基的側(cè)鏈基團保護起來，可以減少胰蛋白酶的作用位點。用氮丙啶處理多肽鏈將Cys殘基修飾成S-氨乙基半胱氨酸（AECys）殘基，可增加多肽鏈中胰蛋白酶的斷裂點。2）胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）胰凝乳蛋白酶又稱糜蛋白酶，其專一性不如胰蛋白酶強，可以斷裂Phe、Trp和Tyr或其他疏水性氨基酸殘基的羧基端肽鍵。如果斷裂的肽鍵附近存在堿性基團，可以增強該酶的裂解能力，而酸性基團可以減弱其裂解能力。3）嗜熱菌蛋白酶（thermolysin）嗜熱菌蛋白酶的專一性較差，能水解疏水性氨基酸殘基如Leu、Ile、Phe、Val、Tyr、Met等的氨基端肽鍵。4）胃蛋白酶（pepsin）胃蛋白酶的專一性也較差，能水解疏水性氨基酸殘基（Phe、Leu、Trp、Tyr等）的氨基端肽鍵。由于二硫鍵在酸性條件下穩(wěn)定，而胃蛋白酶的最適pH值為2，因此常用胃蛋白酶來水解肽段來確定二硫鍵的位置。5）其他蛋白酶葡萄球菌蛋白酶又稱為Glu蛋白酶。在磷酸緩沖液（pH7.8）中，斷裂Glu殘基和Asp殘基的羧基端肽鍵；在碳酸氫銨緩沖液（pH7.8）只斷裂Glu殘基羧基端肽鍵。梭菌蛋白酶又稱為Arg蛋白酶，專一性裂解Arg殘基的羧基端肽鍵，在6mol/L尿素中作用20h內(nèi)仍具活力，對不溶性蛋白質(zhì)的裂解將是相當有效的。木瓜蛋白酶（papain）的專一性差，對Arg和Lys殘基的羧基端肽鍵敏。幾種蛋白水解酶的專一性胰蛋白酶：R1=Lys或Arg側(cè)鏈；R2=Pro抑制水解糜蛋白酶:R1=Phe或Tyr;Leu、Met、His；

R2=Pro抑制水解嗜熱菌蛋白酶：R1=Leu、Ile、Phe、Trp、Val、Tyr；R2=Pro或Gly抑制水解胃蛋白酶：R1和R2=Phe、Leu、Trp、Tyr。

短肽序列測定

Edman降解法¤¤¤★★★★Edman法提供逐次減少一個殘基的肽鏈樣品。Dansylchloride法測定N末端。Edman降解與DNS-Cl結(jié)合法串聯(lián)MS（質(zhì)譜）法也已用于氨基酸序列測定。該方法靈敏度高，所需的樣品量極少（<10-12mol水平），測定速度快，經(jīng)HPLC分離后的多肽混合物可直接進樣串聯(lián)質(zhì)譜儀，能免去繁重的多肽分離純化工作。根據(jù)核苷酸序列推定氨基酸序列。用待測的蛋白質(zhì)的抗體沉淀合成此種蛋白質(zhì)的多核糖體，分離出其mRNA，再反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測出cDNA的核苷酸序列后便可推測出蛋白質(zhì)的氨基酸序列。一般用兩種以上的方法斷裂多肽樣品，形成兩套或以上的肽段。不同的斷裂方法可以形成切口彼此錯位，因此兩套肽段正好相互跨過切口而重疊。肽段排序（重疊肽法）重疊肽法－－－－－－－－－－－－－－－－－多肽

酶Ⅰ→→→→

→→→→

→→→→→

→→→→

→→→→→→

→→→→→

→→→→→→

酶Ⅱ氨基酸序列找重疊肽從而推斷整個肽鏈的氨基酸序列

所得資料：氨基末端殘基H羧基末端殘基S

第一套肽段第二套肽段

OUSSEOPSWTOUEOVEVERLRLAAPSHOWTHO末端殘基

H

S末端肽段HOWTAPS第一套肽段HOWTOUSEOVERLAPS第二套肽段HOWTOUSEOVERLAPS推斷全順序HOWTOUSEOVERLAPS1.為防止Cys跟Cys-Cys發(fā)生交換反應(yīng)，先將自由SH基封閉。2.進行專一性部分水解(如胃蛋白酶)。3.電泳

(或紙層析)分離水解產(chǎn)物。4.氣相過甲酸法切斷S-S鍵，作第二相電泳(或紙層析)。5.將遷移率發(fā)生變化的多肽進行測序。二硫鍵位置的確定法對角線電泳的原理是：把水解后的混合肽段點到濾紙的中央，在pH6.5的條件下，進行第一向電泳，肽段將按其大小及電荷的不同分離開來。然后把濾紙暴露在過甲酸蒸氣中，使-S-S-斷裂。這時每個含二硫鏈的肽段被氧化成一對含半胱氨磺酸的肽。濾紙旋轉(zhuǎn)90°角在與第一向完全相同的條件下進行第二向電泳，大多數(shù)肽段的遷移率未變，并將位于濾紙的一條對角線上。而含半胱氨磺酸的成對肽段比原來含二硫鍵的肽小而負電荷增加，結(jié)果它們都偏離了對角線。對角線電泳

蛋白質(zhì)測序?qū)嵗?、蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系（一）同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進化蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的種屬差異十分明顯，但相同部分氨基酸對蛋白質(zhì)的功能起決定作用。根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上的差異，可以判斷他們在親緣關(guān)系上的遠近。

1、同源蛋白質(zhì)不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質(zhì)。序列同源（sequencehomology）：aa順序中的相似性稱為順序同源現(xiàn)象。不變殘基（invariantresidue）：一級結(jié)構(gòu)中有許多位置的aa對所有種屬來說都是相同的?？勺儦埢╲ariableresidue）：其他位置的aa差異較大，稱為可變殘基。細胞色素c（cytochromec）2、細胞色素c的進化真核生物細胞色素c有100個左右氨基酸殘基。其中有28個位置的氨基酸是不變的，包括17位和14位上的Cys和70-80位的氨基酸。細胞色素c的進化樹（二）同源蛋白質(zhì)的起源共同性肌紅蛋白

153AAα-珠蛋白

141AAβ-珠蛋白

146AA同源序列38同源序列64絲氨酸蛋白酶類胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶以及血液凝固和溶解系統(tǒng)的酶都屬于絲氨酸蛋白酶類，具有類似的活性中心，序列同源性高，生理功能異化。（三）氨基酸序列的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中也有一些特定的序列能阻礙蛋白質(zhì)表現(xiàn)出生物功能，只有將其切除后才能形成有活性的蛋白質(zhì)。凝血系統(tǒng)主要凝血因子

因子I，纖維蛋白原

因子II,凝血素

因子III,凝血酶原酶

因子IV,鈣(