第四章基因克隆的載體

第二節(jié)噬菌體載體（Bacteriophage，簡(jiǎn)稱(chēng)phage）

一、λ噬菌體載體λphage48.5kbinlengthLinearorcirculargenome

溶菌階段(復(fù)制和釋放)溶源階段

(整合到寄主染色體上)Thephage

cos

ends(cohesive-endsite

)

5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’

CleavageLigation(duringpackaging)(afterinfection)5’-CG+

GGGCGGGCGACCTCG-3’3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’CircularformLinearform通過(guò)Cos末端互補(bǔ)單鏈形成環(huán)狀DNA分子，在宿主細(xì)胞的DNA連接酶和旋促酶作用下，形成封閉的環(huán)狀DNA分子，充當(dāng)轉(zhuǎn)錄的模板。λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)已經(jīng)定位的λ噬菌體的基因至少有61個(gè)，其中有一半左右參與了噬菌體生命周期的活動(dòng)，我們稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)棣耸删w的必要基因；另一部分基因，當(dāng)它們被外源基因取代之后，并不影響噬菌體的生命功能，我們稱(chēng)這類(lèi)基因?yàn)棣耸删w的非必要的基因。λphageDNAProteincoatcoscosNonessentialregionLong(left)armshort(right)armExogenousDNA(~20-23kb)12bp

Virusesthatcaninfectbacteria.48.5kbinlengthLinearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase

(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)

1.插入式載體一種只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)的派生載體。

2.替換型載體（取代型載體）具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的λDNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。

λ噬菌體載體的主要類(lèi)型

λ噬菌體載體相對(duì)于質(zhì)粒載體來(lái)說(shuō)，克隆片段較大，所以一般用于cDNA文庫(kù)或基因組文庫(kù)的構(gòu)建。

cI基因插入失活：如λgt10、λNM1149等載體，在cI基因上有EcoRI及HindIII的酶切位點(diǎn)。外源基因插入后將導(dǎo)致cI基因的失活。cI基因失活后將導(dǎo)致噬菌體不能溶原化，產(chǎn)生清晰的噬菌斑。相反，產(chǎn)生混濁的噬菌斑。

LacZ基因插入失活：如charon16A載體，在非必須區(qū)段引入lacZ基因，在lacZ基因上有EcoRI位點(diǎn)，插入失活后利用X-gal法篩選（蘭白篩選）。

插入式載體

cIEcoRI

LA32.7RA10.6

λgt10

Charon16A

lacZRA21.9EcoRILA19.9λ

替換型載體（取代型載體）外源DNA取代噬菌體染色體中對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制非必要的片段

(～20kb)

高感染效率(109

轉(zhuǎn)化株/ug

載體DNA,比質(zhì)粒高

100倍)EMBL3、DASH

野生型噬菌體染色體的中段對(duì)于噬菌體的感染和復(fù)制是非必要的，外源DNA可以取代這一片段，例如Charon4A、λEMBL3/4、Charon40等載體，這些載體是用Lac5（乳糖操縱子的大部分系列，包括完整的LacZ）替換入噬菌體的中間區(qū)段，同時(shí)將Lac5作為選擇標(biāo)記，使用時(shí)用EcoRI水解，去掉中間的片段，再與欲克隆片段在體外進(jìn)行重組、包裝。而后，感染E.coli使之在E.coli內(nèi)繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。

spi-選擇

λ噬菌體的red和gam基因產(chǎn)物可抑制噬菌體在宿主細(xì)菌中正常生長(zhǎng)，red-和gam-突變型λ噬菌體則可正常生長(zhǎng)。當(dāng)置換型載體的可置換片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置換片段，則同時(shí)除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生長(zhǎng)，否則就不能正常生長(zhǎng)。替換型噬菌體λ是使用最廣泛的載體。

替換式載體Lac

EcoRIEcoRICharon4A

EcoRIBanHISalISalIBamHIEcoRIEMBL3/4Lac

MCSMCS

Charon40Lac1.應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶消化λ載體，除去可取代的DNA片段；2.將上述所得的

λDNA載體臂同外源DNA片段的連接；3.對(duì)重組體的λDNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的λ重組噬菌體3.組裝4.侵染2.連接1.酶切替換型載體克隆外源DNA的步驟

λ噬菌體DNA體外重組后，一般必須經(jīng)過(guò)體外包裝，然后以噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入E.coli細(xì)胞內(nèi)。這是因?yàn)橐愿腥痉绞綄?dǎo)入細(xì)胞的頻率可達(dá)106～108/μgDNA，而以轉(zhuǎn)染（translation）的方式導(dǎo)入的頻率僅為103～105/μgDNA。

λ噬菌體的包裝限制為野生噬菌體DNA（約48.5kb）的75%-105%。體外包裝

由于λ噬菌體包裝時(shí)，當(dāng)DNA的長(zhǎng)度短于野生型的78%或超過(guò)105%時(shí)，噬菌體的活性就急劇下降。因此只包裝它的野生型DNA（48.5KB）的75%～

105%左右的ＤＮＡ，要求λ載體DNA和外源DNA長(zhǎng)度之和在39～53kb之間。

插入式載體可攜帶的外源DNA片段較替換式為小。根據(jù)體外互補(bǔ)作用研究發(fā)現(xiàn)，λ噬菌體的頭部和尾部的裝配是分開(kāi)進(jìn)行的。頭部基因發(fā)生了突變的噬菌體只能形成尾部，而尾部基因發(fā)生了突變的噬菌體則只能形成頭部。將這兩種不同突變型的噬菌體的提取物混合起來(lái)，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。這就是噬菌體體外包裝所依據(jù)的基本原理。（左右臂連接）（三段自身連接）（插入片段）根據(jù)噬菌斑的透明度或顏色來(lái)進(jìn)行重組子的篩選二、單鏈DNA噬菌體載體(M13)

M13是一種含單鍵（+）DNA（ssDNA）的絲狀大腸桿菌噬菌體，其基因組大小為6.4kb。這類(lèi)載體主要用來(lái)獲得大量的單鏈DNA片段，這種單鏈DNA片段在遺傳學(xué)研究中主要用來(lái)測(cè)定DNA序列（sanger雙脫氧法）、基因的定點(diǎn)突變研究、異源雙鏈DNA的分析等。

M13噬菌體載體.感染Ecoli后，在宿主細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成雙鏈的復(fù)制型DNA（replicationformDNA,RFDNA）。可以象質(zhì)粒DNA那樣在體外進(jìn)行純化和操作。M13噬菌體的特點(diǎn)2.成熟的噬菌體顆粒僅能感染E.coli的F+細(xì)胞，這是因?yàn)檫@種噬菌體的感染位點(diǎn)在性散毛上。但是無(wú)論是RFDNA或ssDNA都能轉(zhuǎn)染E.coli的F+或F-細(xì)胞。

3.噬菌體顆粒的大小是受其DNA的大小制約的，這一點(diǎn)正好與λ噬菌體相反。所以M13噬菌體并不存在包裝限制的問(wèn)題。

M13lifecycle具有多克隆位點(diǎn)(MCS)，方便克隆。許多M13載體的多克隆位點(diǎn)與質(zhì)粒載體pUC序列的多克隆位點(diǎn)是相同的，在克隆位點(diǎn)選擇上更為方便?？梢远ㄏ虻目寺NA片段，克隆在M13RFDNA分子上的雙鏈DNA片段，到了子代噬菌體便成了單鏈的形式。所以如果要同時(shí)分離ＤＮＡ分子中的雙鏈，則需要兩種獨(dú)立的克隆。根據(jù)M13的生物學(xué)特性知道，M13子代噬菌體中總是只含有（＋）鏈，所以M13載體克隆的外源DNA片段在子代噬菌體中究竟是含有DNA分子中的哪條鏈，則完全取決于外源DNA克隆時(shí)的取向。這樣一來(lái)，為分別分離外源DNA分子的兩條鏈帶來(lái)一定的麻煩，解決這一問(wèn)題的一個(gè)行之有效的方法就是定向克隆技術(shù)。M13載體Blue-whiteselection1.在這類(lèi)載體的基因組中有一條飾變的β-半乳糖苷酶基因片段（HindⅢ片段），其中插入了一段具有密集的多克隆位點(diǎn)的序列；2.M13載體系列是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對(duì)地構(gòu)建的，可有效地克隆雙鏈DNA分子中的每一條鏈。M13載體系列的優(yōu)點(diǎn)M13mp18MCSM13mp19MCS

EcoRI

BamHI

HindIII

PstI

BglI

BglI

PstI

HindIII

BamHI

EcoRI

BP

PBBP

BPBPBamHI&PstIM13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖M13、f1、fd優(yōu)越性：1.單鏈DNA噬菌體的復(fù)制，是以雙鏈環(huán)形的DNA為媒介的，這種復(fù)制形式的DNA簡(jiǎn)稱(chēng)RFDNA；2.不論是RFDNA還是ssDNA都能感染大腸桿菌；3.單鏈DNA噬菌體顆粒的大小，是受其DNA的多少制約的，不存在包裝限制問(wèn)題；4.容易測(cè)定外源DNA片斷的插入取向；5.可產(chǎn)生含外源片斷的單鏈DNA分子。

單鏈DNA噬菌體載體三、噬菌粒載體由質(zhì)粒載體和單鏈?zhǔn)删w載體結(jié)合而成的新型的載體系列。它具有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、選擇性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等，方便DNA的操作，可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定存在；又具有單鏈?zhǔn)删w的復(fù)制起點(diǎn)，在輔助噬菌體的存在下，可進(jìn)行噬菌體的繁殖，產(chǎn)生單鏈的子代噬菌體。1.具有較小分子量的共價(jià)、閉合、環(huán)形的基因組DNA，可克隆10kb的外源DNA片段，并易于進(jìn)行分離與操作；2.編碼一個(gè)ampr基因作為選擇記號(hào)，因此只有攜帶pUC118或pUC119噬菌粒載體的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，才能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，便于轉(zhuǎn)化子的選擇；常用的噬菌粒載體pUC118和pUC1194.存在著一個(gè)多克隆位點(diǎn)區(qū)，因此許多種不同類(lèi)型的外源DNA片段，不經(jīng)修飾便可直接插入到載體分子上；3.拷貝數(shù)含量高，每個(gè)寄主可高達(dá)500個(gè)，所以只要用少量的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物，便可制備出大量的載體DNA；5.由于多克隆位點(diǎn)區(qū)阻斷了大腸桿菌lacZ基因的5’-端編碼區(qū)，可按照IPTG組織化學(xué)顯色反應(yīng)試驗(yàn)，篩選重組子；7.含有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在沒(méi)有輔助噬菌體的情況下，克隆的外源基因可以像質(zhì)粒一樣按常規(guī)的方式，復(fù)制形成大量的雙鏈DNA分子8.帶有一個(gè)M13噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)，在有輔助噬菌體感染的寄主細(xì)胞中，可以合成出單DNA拷貝，并包裝成噬菌體顆分泌到培養(yǎng)基中；6.lacZ基因是置于lac啟動(dòng)子的控制之下，這樣插入的外源基因便會(huì)以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)；9.在pUC118和pUC119這兩個(gè)載體中，多克隆位點(diǎn)區(qū)的核苷酸序列取向是彼此相反的，于是它們當(dāng)中的一個(gè)可轉(zhuǎn)錄克隆基因的正鏈DNA，另一個(gè)則可轉(zhuǎn)錄出負(fù)鏈DNA；10.可以直接對(duì)克隆的DNA片斷進(jìn)行核苷酸的序列測(cè)定，免去了從質(zhì)粒載體到噬菌體的這一煩瑣的亞克隆步驟?；窘Y(jié)構(gòu)：1.在多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)，有一對(duì)T3和T7噬菌體的啟動(dòng)子，可以定向指導(dǎo)外源基因的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)；2.同時(shí)具有一個(gè)單鏈?zhǔn)删wM13或f1的復(fù)制起點(diǎn)和一個(gè)來(lái)自ColE1質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)，在不同的情況下，可以采取不同的復(fù)制形式，分別合成單鏈或雙鏈的DNA；3.編碼有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，供作轉(zhuǎn)化子記號(hào)；4.含有l(wèi)acZ基因，可用Xgal-IPTG組織顯色反應(yīng)法篩選噬菌粒載體。pBluescript

噬菌粒載體用于體外轉(zhuǎn)錄四、柯斯(cosmid）質(zhì)粒載體CosmidAmprCossiteCoEⅠoripolylinkercosmid載體也稱(chēng)粘粒、柯斯載體。

這是一類(lèi)用于克隆大片段DNA的載體，它是由λ噬菌體的cos（cohesive）末端及質(zhì)粒（plasmid）重組而成的載體。cosmid載體帶有質(zhì)粒的復(fù)制起點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、選擇性標(biāo)記以及λ噬菌體用于包裝的cos末端等，因此該載體在體外重組后，可利用噬菌體體外包裝的特性進(jìn)行體外包裝，利用噬菌體感染的方式將重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。但它不會(huì)產(chǎn)生子代噬菌體，而是以質(zhì)粒DNA的形式存在于細(xì)胞內(nèi)?？滤官|(zhì)粒載體具有λ噬菌體的特性；具有質(zhì)粒載體的特性；具有較高容量的克隆能力；具有與同源性序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)由質(zhì)粒pBR322和噬菌體λ的cos位點(diǎn)的一段DNA構(gòu)成全長(zhǎng)4.3kb設(shè)計(jì)構(gòu)建的柯斯質(zhì)粒一般長(zhǎng)4～6kb。其上的cos位點(diǎn)的一個(gè)重要作用是識(shí)別噬菌體的外殼蛋白。凡具有cos位點(diǎn)的任何DNA分子只要在長(zhǎng)度相當(dāng)于噬菌體基因組，就可以同外殼蛋白結(jié)合而被包裝成類(lèi)似噬菌體λ的顆粒。因此，插入柯斯質(zhì)粒的外源DNA可大于40kb。重組的柯斯質(zhì)粒可象噬菌體λ一樣感染大腸桿菌，并在細(xì)菌細(xì)胞中復(fù)制。FormationofacosmidcloneLigationtocleavedcosmidvectormoleculescanproducevector-targetconcatemers,resultinginalargeexogenousDNAfragmentflankedbycossequences.采用柯斯質(zhì)粒作載體的困難①載體自身只相當(dāng)于可以插入片段的1/10左右，因此往往會(huì)出現(xiàn)載體同載體自身連接，結(jié)果在一個(gè)重組分子內(nèi)可有幾個(gè)柯斯質(zhì)粒載體連在一起。但用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接；②大小不等的外源片段相互連接后插入同一個(gè)載體分子，結(jié)果使在基因組內(nèi)本來(lái)不是相鄰的片段錯(cuò)亂地連接成一個(gè)片段，會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，后來(lái)專(zhuān)門(mén)選出30～45kb的外源DNA插入載體DNA，此時(shí)，每個(gè)載體只可能插入一個(gè)外源片段，因?yàn)槿绻€(gè)片段，則將超過(guò)包裝成噬菌體顆粒的限度；③細(xì)菌的菌落體積遠(yuǎn)大于噬菌斑，因此如用柯斯質(zhì)粒制備基因文庫(kù)，則篩選所需的含某一DNA片段的菌落很費(fèi)時(shí)間?，F(xiàn)雖建立了高密度菌落篩選法，但由于柯斯質(zhì)粒制成的基因文庫(kù)常常不太穩(wěn)定，插入的大片段外源DNA有可能通過(guò)同宿主基因組交換而致丟失等，所以最常使用的還是噬菌體載體。常用載體的比較質(zhì)粒λ噬菌體柯斯質(zhì)粒單鏈?zhǔn)删w克隆DNA大片段±*++-構(gòu)建基因組文庫(kù)-++-構(gòu)建DNA文庫(kù)+---常規(guī)的亞克隆化+---構(gòu)建新型的DNA結(jié)構(gòu)+---序列分析+--+單鏈探針+**--+外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)+---*外源DNA如超過(guò)10kb，則重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率和DNA得率都非常低**已有個(gè)別材料可用于此目的酵母人工染色體載體（yeastartificialchromosome,YAC）細(xì)菌人工染色體載體（bacterialartificialchromosome,BAC）噬菌體人工染色體載體（Bacteriophageartificialchromosome,PAC）

第三節(jié)、其他載體人基因組十分龐大，約含4×109bp，建立和篩選人的基因組文庫(kù)，要求有容量更大的載體，酵母人工染色體（yeastartificialchromosome,YAC）載體應(yīng)運(yùn)而生。

YAC含有酵母染色體端粒（telesome）、著絲點(diǎn)(centromere)及復(fù)制起點(diǎn)等功能序列，可插入長(zhǎng)度達(dá)200-500kb的外源DNA，導(dǎo)入酵母細(xì)胞可以隨細(xì)胞分裂周期復(fù)制繁殖供作克隆，成為人基因組研究計(jì)劃的重要。一、酵母人工染色體載體構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列：2個(gè)端粒，著絲粒，ARS元件，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。適用于克隆大片段DNA，0.2～5Mb。1）著絲粒（centromeresequence,CEN)

有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的結(jié)合位點(diǎn)，使染色體在分裂過(guò)程中能正確分配到子細(xì)胞中。在YAC中起到保證一個(gè)細(xì)胞內(nèi)只有一個(gè)人工染色體的作用。如pYAC4使用的是酵母第四條染色體的著絲粒。

YAC主要結(jié)構(gòu)的功能2）端粒(telomeresequences,TEL)

定位于染色體末端一段序列，用于保護(hù)線狀的DNA不被胞內(nèi)的核酸酶降解，以形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

3）自主復(fù)制序列（autonomousreplicatingsequence,ARS）一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA進(jìn)行雙向復(fù)制所必須的信號(hào)，是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。4）YAC載體的選擇標(biāo)記主要采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和組氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突變抑制基因sup4。與YAC載體配套工作的宿主酵母菌AB1380，它的胸腺嘧啶合成基因攜帶赭石突變（ochremutation）ade-2

，從而影響嘌呤的代謝。這種突變能夠造成紅色素在酵母體內(nèi)的積累。然而，當(dāng)攜帶赭石突變抑制基因SUP4gene的載體存在于細(xì)胞中時(shí)，能夠使酵母細(xì)胞恢復(fù)為野生型，形成無(wú)色的酵母菌。同時(shí)寄主細(xì)胞trp1andura3的等位基因也是敏感型的，它們所控制的表型可由載體攜帶的TRP1andURA3來(lái)互補(bǔ)。由此可作為篩選是否攜帶YACvector的標(biāo)記。外源片段的插入則由

SUP4gene的插入失活來(lái)檢測(cè)。CloingintoaYeastArtificialChromosome

YAC載體功能強(qiáng)大，但有一些弊端，主要表現(xiàn)在3個(gè)方面：

首先，在YAC載體的插入片段會(huì)出現(xiàn)缺失（deletion）和基因重排（rearrangement）的現(xiàn)象。

其次，容易形成嵌合體。嵌合就是在單個(gè)YAC中的插入片段由2個(gè)或多個(gè)的獨(dú)立基因組片段連接組成。嵌合克隆約占總克隆的5%～50%。

最后，YAC染色體與宿主細(xì)胞的染色體大小相近，影響了YAC載體的廣泛應(yīng)用。

YAC染色體一旦進(jìn)入釀酒酵母細(xì)胞，由于其大小與內(nèi)源的染色體的大小相近，就很難從中分離出來(lái)，不利于進(jìn)一步分析。YAC載體的優(yōu)缺點(diǎn)

但是YAC的一個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)是，酵母細(xì)胞比大腸桿菌對(duì)不穩(wěn)定的、重復(fù)的和極端的DNA有更強(qiáng)的容忍性。另外，YAC在功能基因和基因組研究中是一個(gè)非常有用的工具。由于高等真核生物的基因大多數(shù)是多外顯子結(jié)構(gòu)并且有長(zhǎng)長(zhǎng)的內(nèi)含子，大型基因組片段可通過(guò)YAC載體轉(zhuǎn)移到動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞系中，進(jìn)行功能研究。

二、細(xì)菌人工染色體載體細(xì)菌人工染色體（bacterialartificialchromosome，BAC）由大腸桿菌單拷貝F質(zhì)粒衍生而成的，可用于克隆基因組大片段DNA及構(gòu)建基因組文庫(kù)的克隆載體，可攜帶大片段的外源DNA，其遺傳穩(wěn)定性比酵母人工染色體要高。

F質(zhì)粒

大腸桿菌的F因子是一個(gè)約100kb的質(zhì)粒。它編碼60多種參與復(fù)制、分配和接合過(guò)程的蛋白質(zhì)（WillettsandSkurray，1987）。雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個(gè)拷貝/細(xì)胞）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個(gè)位點(diǎn)處進(jìn)行隨機(jī)整合（Low，1987）。攜帶F因子的細(xì)胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達(dá)三根發(fā)樣狀的F菌毛。F菌毛為供體與受體細(xì)胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。

細(xì)菌人工染色體載體用于克隆DNA測(cè)序的Sp6、T7啟動(dòng)子（來(lái)源于噬菌體）。

BAC載體空載時(shí)大小約7.5kb，在大腸桿菌中以質(zhì)粒的形式復(fù)制。

BAC載體可以通過(guò)α互補(bǔ)的原理，篩選含有插入片段的重組子。一個(gè)來(lái)源于大腸桿菌F因子（致育因子）的嚴(yán)謹(jǐn)型控制的復(fù)制子oriS

；一個(gè)易于DNA復(fù)制的由ATP驅(qū)動(dòng)的解旋酶（RepE）;三個(gè)確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細(xì)胞的基因座（parA、parB和parC）；用于回收克隆DNA的NotⅠ(GC↓GGCCGC)酶切位點(diǎn)（位點(diǎn)十分稀少，重組子通過(guò)NotⅠ消化后，可以得到完整的插入片段）；cosN位點(diǎn)可被入噬菌體末端酶切割為黏末端，因而能像傳統(tǒng)的黏粒一樣在克隆后包裝每個(gè)環(huán)狀DNA分子中攜帶一個(gè)抗生素抗性標(biāo)記(氯霉素抗性基因)；BAC載體特點(diǎn)

BAC與YAC和PAC（P1artificialchromosomes，P1人工染色體）相似，沒(méi)有包裝限制，因此可接受的基因組DNA大小也沒(méi)有固定的限制。大多數(shù)BAC文庫(kù)中克隆的平均大小約120kb，然而個(gè)別的BAC重組子中含有的基因組DNA最大可達(dá)300kb。

F質(zhì)粒能夠編碼形成性菌的蛋白，通過(guò)大腸桿菌的結(jié)合轉(zhuǎn)移可以進(jìn)行遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移。但是基因操作的時(shí)候一般不用這種自發(fā)的轉(zhuǎn)化方式。外源基因組DNA片段可以通過(guò)酶切、連接克隆到BAC載體多克隆位點(diǎn)上，通過(guò)電穿孔的方法將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌重組缺陷型菌株。

BAC載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)宿主細(xì)胞的毒副作用。三、噬菌體PI載體和PAC(Pl-derivedArtificialChromosome

)

以噬菌體P1為基礎(chǔ)的克隆系統(tǒng)。

PI噬菌體與λ噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的（110～115kb）線性DNA，并在體外包裝于PI殼內(nèi)。PI進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化，擴(kuò)增。

1994年，有人將PI和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)-----PAC。

PAC載體含有很多P1噬菌體來(lái)源的順式作用元件，能容納70～100kb大小的基因組DNA片段。含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到P1噬菌體顆粒中，總?cè)萘靠蛇_(dá)115kb（包括載體和插入片段）。PAC載體載體攜帶一個(gè)通用的選擇標(biāo)記kanr;一個(gè)區(qū)分?jǐn)y帶外源DNA克隆的陽(yáng)性標(biāo)記sacB

以及一個(gè)能夠使每個(gè)細(xì)胞都含有約一個(gè)拷貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的P1質(zhì)粒復(fù)制子。另一個(gè)P1復(fù)制子（P1裂解性復(fù)制子）在可誘導(dǎo)的lac啟動(dòng)子（IPTG誘導(dǎo)）控制下，用于DNA分離前質(zhì)粒的擴(kuò)增。

cre-loxP

位點(diǎn)特異性重組。

SacB基因:編碼一種將蔗糖轉(zhuǎn)化為果聚糖的酶，當(dāng)含該基因的細(xì)胞培養(yǎng)在2%以上蔗糖培養(yǎng)基中時(shí),果聚糖積累在細(xì)胞周質(zhì)空間內(nèi)，導(dǎo)致大腸桿菌細(xì)胞死亡

SacB基因上游加上E.coli基因啟動(dòng)子,克隆位點(diǎn)BamHI位于這兩個(gè)DNA片段間,外源DNA片段插入時(shí)可進(jìn)行顯性篩選重組子將重組DNA注入到表達(dá)Cre

重組酶的大腸桿菌中，線狀DNA分子通過(guò)重組于載體的兩個(gè)loxP

位點(diǎn)之間而發(fā)生環(huán)化。質(zhì)粒和噬菌體載體只能在細(xì)菌中繁殖，不能滿足真核DNA重組需要。感染動(dòng)物的病毒可改造用作動(dòng)物細(xì)胞的載體。由于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)和操作較復(fù)雜、花費(fèi)也較多，因而病毒載體構(gòu)建時(shí)一般都把細(xì)菌質(zhì)粒復(fù)制起始序列放置其中。使載體及其攜帶的外來(lái)序列能方便地在細(xì)菌中繁殖和克隆，然后再引入真核細(xì)胞。目前病毒載體常用者有改造來(lái)自猴腎病毒SV40（SimianVirus40）、逆轉(zhuǎn)錄病毒和昆蟲(chóng)桿狀病毒等，使用這些病毒載體的目的多為將目的基因或序列放入動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)或試驗(yàn)其功能、或作基因治療等。

四、病毒載體猴病毒40（SV40）的基因組常用來(lái)作為克隆載體，把外源DNA轉(zhuǎn)入哺乳類(lèi)細(xì)胞。猴病毒40是球形動(dòng)物病毒，直徑40nm，呈20面體，有一個(gè)共價(jià)閉環(huán)的雙鏈DNA基因組，全長(zhǎng)5244bp。它在猴腎中增殖。被SV40感染的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)SV40的T抗原。早已證明完整的小鼠染色體β珠蛋白基因（包括所有的間插順序和兩