第十九章 生物技術(shù)藥物制劑

第19章生物技術(shù)藥物制劑一、概述生物技術(shù)的基本概念生物技術(shù)（Biotechnology）是應(yīng)用生物體（包括微生物、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞）或其組成部分（細(xì)胞器和酶），在最適條件下，生產(chǎn)有價值的產(chǎn)物或進(jìn)行有益過程的技術(shù)?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要包括：基因工程、細(xì)胞工程、酶工程，此外還有發(fā)酵工程、生化工程、蛋白質(zhì)工程、抗體工程等。二、蛋白質(zhì)類藥物的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性

（一）蛋白質(zhì)類藥物的組成和結(jié)構(gòu)

（二）蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定性

化學(xué)不穩(wěn)定性：主要指蛋白質(zhì)分子通過共價鍵的形成和斷裂形成了新的化學(xué)實(shí)體（Chemicalentity）；物理不穩(wěn)定性：指蛋白質(zhì)分子的高級結(jié)構(gòu)的物理轉(zhuǎn)變，無共價鍵改變。物理不穩(wěn)定包括變性、聚集、沉淀和表面吸附。1．化學(xué)不穩(wěn)定水解：肽和蛋白質(zhì)的水解反應(yīng)主要有肽鏈的斷裂；天冬酰胺和谷氨酰胺的去酰胺反應(yīng)（尤其C-氨基酸是絲氨酸和甘氨酸）；分子內(nèi)的氨基分解反應(yīng)形成二酮哌嗪；分子內(nèi)天冬氨酸催化的肽基轉(zhuǎn)移作用（蛋白水解作用）。

2．物理不穩(wěn)定性

由于伸展、非天然的重新折疊、氫鍵的變化和疏水相互作用力的改變所引起的蛋白質(zhì)的物理不穩(wěn)定性可使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。球狀蛋白以減少疏水基團(tuán)暴露的方式折疊，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)伸展時，球狀結(jié)構(gòu)松散，而且伸展的分子可進(jìn)一步通過表面吸附，與其它蛋白質(zhì)分子聚集或通過一些化學(xué)反應(yīng)而失活，變性使蛋白質(zhì)球狀結(jié)構(gòu)喪失。（一）液體劑型蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定化方法

改造蛋白質(zhì)：如改變蛋白質(zhì)一級序列或取代反應(yīng)官能團(tuán)和化學(xué)修飾蛋白質(zhì)的方法。其主要原理是提高蛋白質(zhì)伸展自由能。該方法不屬制劑范疇，為此本章不加以詳細(xì)討論。通過加入輔料，改變液體蛋白類藥物溶劑的性質(zhì)是藥物制劑中常用的穩(wěn)定化方法，其穩(wěn)定化的機(jī)理有兩種：①加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定作用力。②使其變性狀態(tài)不穩(wěn)定。三．蛋白質(zhì)類藥物制劑的處方設(shè)計(jì)

1．緩沖液

選擇緩沖液是液體蛋白質(zhì)制劑研制中重要的一步，因?yàn)閜H值和蛋白質(zhì)的物理化學(xué)穩(wěn)定性均有關(guān)，通常蛋白質(zhì)的穩(wěn)定pH范圍很窄，準(zhǔn)確控制制劑pH值是蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的第一步，遺憾的是目前在選擇緩沖體系方面毫無規(guī)律可尋，，現(xiàn)在常用的有磷酸鹽、醋酸鹽和枸櫞酸鹽緩沖鹽，最常用的是磷酸鹽。2.糖和多元醇糖和多元醇屬于非特異性蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，其穩(wěn)定機(jī)制是優(yōu)先排除，糖中蔗糖和海藻糖最常用，避免選用還原糖，因其與氨基酸有相互作用的可能。多元醇常用的有甘油，甘露醇，山梨醇（濃度1%～10%），其中甘油最為常用，糖和多元醇類的穩(wěn)定作用與其使用濃度密切相關(guān)，一般認(rèn)為0.3M（或5%）濃度是其作為穩(wěn)定劑使用的最小量，提取分離時糖的濃度可達(dá)1mol/L，多元醇可達(dá)10%，不同糖和多元醇對蛋白質(zhì)穩(wěn)定程度不同，這主要取決于蛋白質(zhì)的種類。3．表面活性劑表面活性劑可降低蛋白質(zhì)溶液的表面張力，抑制蛋白質(zhì)在疏水性表面的聚集、沉淀和吸附，或阻止蛋白質(zhì)的化學(xué)降解?？晒┻x擇的表面活性劑有二類：非離子型表面活性劑如聚山梨酯類、泊洛沙姆（Poloxamer）等。陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉。4.鹽類鹽可以起到穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用，也可以破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，還有可能毫無影響。這主要取決于鹽的種類、濃度、離子相互作用的性質(zhì)及蛋白質(zhì)的電荷。低濃度的鹽通過非特異性靜電作用提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。高濃度的鹽類的作用與Hofmeister感交離子序有關(guān)：SO42->HPO42->CH3COO->F->Cl->NO3->I->CNS-,(CH3)4N+>NH4+>K+>Na+>Mg2+>Ca2+>Ba2+5．聚乙二醇類高濃度的PEG類，常作為蛋白質(zhì)的低溫保護(hù)劑和沉淀/結(jié)晶劑，它可與蛋白質(zhì)的疏水鏈作用。研究表明不同分子量的PEG作用不同。如PEG300濃度0.5%或2%可抑制rhKGF的聚集；PEG200、400、600、和1000可穩(wěn)定BSA和溶菌酶。PEG4000不同濃度（可高達(dá)15%）可抑制LMW-UK的熱聚集。PEG類的穩(wěn)定作用的機(jī)制仍不清楚。

6．大分子化合物很多大分子化合物已表明具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用。其穩(wěn)定機(jī)制可能是大分子的表面活性、優(yōu)先排除、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的空間隱蔽、粘度提高限制蛋白質(zhì)運(yùn)動及優(yōu)先吸附等。

7．金屬離子一些金屬離子如鈣、鎂、鋅與蛋白質(zhì)結(jié)合，使整個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加緊密、結(jié)實(shí)、穩(wěn)定，從而使蛋白質(zhì)穩(wěn)定。不同金屬離子的穩(wěn)定作用的濃度不同而且種類具有特異性。通過穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)選擇金屬離子穩(wěn)定劑及其濃度。8．氨基酸一些氨基酸單獨(dú)或與其它輔料并用通過優(yōu)先排除機(jī)制穩(wěn)定蛋白質(zhì)。如組氨酸、甘氨酸、天冬氨酸鈉、谷氨酸及賴氨酸鹽酸鹽不同程度抑制45℃10mM磷酸鉀緩沖液中rhKGF的聚集。某些氨基酸也可抑制蛋白質(zhì)的化學(xué)降解，如甲硫氨酸是一種有效的抗氧劑。（二）液體蛋白質(zhì)制劑處方組成

（1）增溶劑：蛋白質(zhì)特別是非糖基化蛋白質(zhì)易于聚集和沉淀，提高其溶解度的方法包括選擇合適的pH、離子強(qiáng)度、加入氨基酸如賴氨酸、精氨酸（增溶組織纖溶酶原激活素t-PA）、表面活性劑（如十二烷基硫酸鈉增溶IL-2）和HP-β-CD等。（2）抗吸附和抗聚集劑：表面活性劑如聚山梨酯８０（１％）和白蛋白（１％）。（3）緩沖液：選擇合適的緩沖液是蛋白質(zhì)藥物制劑的一個重要內(nèi)容。因蛋白質(zhì)的溶解度、物理和化學(xué)穩(wěn)定性都依賴于pH，選擇時首先考慮維持產(chǎn)品穩(wěn)定pH的緩沖能力，其次應(yīng)考慮離子強(qiáng)度，因離子強(qiáng)度影響制劑的穩(wěn)定性和等滲。常用的有磷酸鹽、枸櫞酸鹽、醋酸鹽緩沖液等。（4）抗氧劑：常用的抗氧劑有抗壞血酸、亞硫酸氫鈉、單巰基甘油、半胱氨酸和α－生育酚，常用濃度０.1%以上。此外，可采取在容器內(nèi)填充惰性氣體。（5）防腐劑：對多劑量注射劑需加入防腐劑。常用的防腐劑有：苯酚、苯甲醇、氯丁醇、間甲酚、尼泊金類和汞撒利等。選擇防腐劑應(yīng)充分注意以下問題：抗菌活性、藥物的失活、使用濃度、穩(wěn)定性、溶解度及相容性。（6）等滲調(diào)節(jié)劑：靜脈注射劑必須等滲，常用品種有葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀。用糖比用鹽的效果更好。（三）固體狀態(tài)蛋白質(zhì)類藥物的穩(wěn)定性與制備工藝

1．冷凍干燥蛋白質(zhì)藥物制劑產(chǎn)品的外觀、含水量等質(zhì)量方面及經(jīng)濟(jì)成本均有較大的影響。2.噴霧干燥蛋白質(zhì)藥物制劑四、蛋白質(zhì)類藥物的釋放系統(tǒng)

（一）蛋白質(zhì)類藥物的給藥途徑及吸收促進(jìn)

1．注射給藥2．口服途徑給藥3．其它給藥途徑4．蛋白質(zhì)藥物的吸收促進(jìn)（提高蛋白質(zhì)藥物生物利用度的方法）

1．注射給藥蛋白質(zhì)、多肽類藥物由于口服吸收的限制因素，臨床多采用注射途徑給藥，包括靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射。但蛋白質(zhì)、多肽類藥物一般體內(nèi)血漿半衰期較短，清除率高，如t-PA體內(nèi)半衰期只有幾分鐘，因此，注射途徑給藥往往需通過其它方法延長體內(nèi)半衰期。最簡單的方法是靜脈注射給藥改為肌肉注射或皮下注射。采取此法時應(yīng)注意隨之引起的蛋白質(zhì)降解和體內(nèi)配置的變化。因?yàn)榧∪庾⑸浜推は伦⑸漭^靜脈注射相比延長了藥物在給藥部位的滯留時間，同時也增加了藥物降解的幾率。2.口服途徑給藥口服給藥途徑方便、簡單、易于被患者所接受，但蛋白質(zhì)類藥物的口服給藥存在以下限制，①蛋白質(zhì)類藥物的胃腸道降解。②胃腸粘膜的穿透性差。③形成多聚體。蛋白質(zhì)藥物口服在胃中首先受到胃蛋白酶及肽酶的水解生成小肽，小肽進(jìn)一步受腸酶水解。在腸粘膜上的肽酶有亮氨酸氨基肽酶、氨基多肽酶、氨基三肽酶、絲氨酸羧肽酶及一些蛋白酶。最終將蛋白質(zhì)分解成氨基酸或小肽（二肽或三肽），這種機(jī)制對人體完全吸收利用蛋白質(zhì)是積極的，但對蛋白質(zhì)類藥物的吸收是一個天然障礙。3．其它給藥途徑：包括鼻粘膜、肺部、直腸、口腔粘膜、皮膚給藥途徑等。4．蛋白質(zhì)藥物的吸收促進(jìn)

（1）提高吸收屏障的通透性：（2）降低吸收部位和吸收途徑肽酶的活性：（3）分子結(jié)構(gòu)修飾防止降解（4）延長作用時間（如：生物粘附技術(shù)）

（二）蛋白質(zhì)類藥物控制釋放的方法及靶向給藥體系

1．開放式控釋方法（openlooptype）（1）機(jī)械泵（2）滲透壓驅(qū)動系統(tǒng)2．反饋系統(tǒng)3．控釋微球制劑4．脈沖式給藥系統(tǒng)緩釋微球注射劑凍干固體粉末選擇日劑量小的藥物材料：PLA、PLGA最常用制備方法：復(fù)乳-液中干燥法、低溫噴霧提取法、O/W乳化法、凝聚法、聚合法等產(chǎn)品：黃體激素釋放激素、曲普瑞林、亮丙瑞林、破傷風(fēng)類毒素緩釋微球注射劑研究存在的問題PLA和PLGA價格昂貴，國內(nèi)暫無生產(chǎn)制造工藝復(fù)雜、條件要求高，產(chǎn)率、包封率較低，不易滅菌，穩(wěn)定性和重復(fù)性差等問題制備中使用二氯甲烷、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑，易殘留脂質(zhì)體注射劑脂質(zhì)體作為載體可以保護(hù)藥物的生物活性延長半衰期延緩釋放無毒，可生物降解，原料易得等提高穩(wěn)定性材料：磷脂與膽固醇制備方法：機(jī)械分散法、兩相分散法、表面活性劑法多肽、酶類、免疫佐劑納米粒注射劑納米球或納米囊材料：白蛋白、明膠、甲殼素等制備方法