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文檔簡(jiǎn)介

第九章:基因敲除與藥學(xué)基因敲除技術(shù)與諾貝爾獎(jiǎng)三位在基因敲除技術(shù)方面進(jìn)行了卓越、開(kāi)拓性工作并取得了顯著成就的科學(xué)家分享了2007年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng),他們是美國(guó)鹽湖城猶他州大學(xué)的MarieCapecchi教授、美國(guó)北卡羅來(lái)納州大學(xué)的Oliversmithies教授以及英國(guó)加蒂夫大學(xué)的MartinEvans教授

基因敲除簡(jiǎn)介定義:通過(guò)一定的途徑使機(jī)體特定的基因失活或缺失的技術(shù)。1234567123456790890RNAi同源重組插入突變基因敲除(geneknock-out)通常所說(shuō)到的基因敲除,又稱基因打靶,通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組,進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造,把具有功能的同源序列置換出來(lái),造成功能基因的缺失或失活。應(yīng)用DNA同源重組原理進(jìn)行基因敲除同源重組插入突變RNAi同源重組插入突變發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination),又稱基本重組。是最基本的DNA重組方式,通過(guò)鏈的斷裂和再連接,在兩個(gè)DNA分子同源序列間進(jìn)行單鏈或雙鏈片段的交換。要有將外援基因?qū)胨拗骷?xì)胞的載體2.能接受外援基因的受體(常用胚胎干細(xì)胞)基因敲除的必備條件基因敲除載體通常,我們將外源基因DNA片段通過(guò)相應(yīng)載體導(dǎo)入ES細(xì)胞中,一個(gè)好的載體應(yīng)具備以下特點(diǎn):能在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定存在2.具有多個(gè)限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn),即multiplecloningsite(MCS),便于外源基因的插入。常用質(zhì)粒。3.

具有一個(gè)以上的遺傳標(biāo)志,便于對(duì)基因重組的ES細(xì)胞進(jìn)行篩選。常用的篩選標(biāo)記為正負(fù)篩選:Neo(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因陽(yáng)性篩選標(biāo)記和HSV-tk(單純袍子病毒胸腺嘧啶激酶)基因陰性篩選標(biāo)記。Neo新霉素基因陽(yáng)性的ES細(xì)胞可以再含有G418(一種新霉素的類似物)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。HSV-tk基因陽(yáng)性的ES細(xì)胞,編碼的基因產(chǎn)物可以將更昔洛韋等轉(zhuǎn)化為有毒物質(zhì),將細(xì)胞殺死。胚胎干細(xì)胞(簡(jiǎn)稱ES細(xì)胞)胚胎干細(xì)胞是早期胚胎中分離出來(lái)的一類細(xì)胞,具有體外培養(yǎng)無(wú)限增殖、自我更新和多向分化的特性。(1)基因敲除載體的構(gòu)建Step1.獲得目的基因(待敲除基因)的同源片段,將此DNA片段克隆到一般質(zhì)粒中;Step2.從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源序列,只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端;Step3.將neo基因和HSV-tk克隆到質(zhì)粒中;基因敲除的基本程序

根據(jù)載體與靶基因組同源序列雙鏈斷裂位點(diǎn)位置的不同,基因載體通常分為兩種:

1.插入性載體(gene-insertionvector)

2.置換型載體(gene-replacementvector)大多數(shù)的基因敲除中,采用的是置換性載體;而插入性載體則更多的應(yīng)用于基因敲入和對(duì)目的基因的精確突變。(2)基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞

將基因敲除載體導(dǎo)入ES細(xì)胞,以載體上的neo基因置換ES細(xì)胞基因組的目的基因,從而得到基因敲除細(xì)胞

基因敲除載體導(dǎo)入ES的方法有顯微注射法,電穿孔法,DEAG葡聚糖介導(dǎo)法,脂質(zhì)體法,病毒感染法,精子載體法等1.正負(fù)雙向篩選系統(tǒng)(PNS):Nero基因表達(dá),ES細(xì)胞抗新霉素,在G418的培養(yǎng)基中存活。HSV-tk基因表達(dá),在更昔洛韋的培養(yǎng)基中,ES細(xì)胞被殺死。

(3)常用的篩選方法有兩類

2.正向篩選

又稱標(biāo)記基因的特異性表達(dá)法,僅有正性選擇性標(biāo)記的標(biāo)記基因,而且這種標(biāo)記方法是缺乏自身的某個(gè)表達(dá)調(diào)控序列。標(biāo)記基因因?yàn)樘禺愓希@得調(diào)控序列,能夠表達(dá)??梢苑譃闊o(wú)啟動(dòng)子篩選法,無(wú)增強(qiáng)子篩選法,無(wú)poly(A)篩選法。

(2)常用的篩選方法有兩類

3.物理篩選方法主要是PCR篩選方法,優(yōu)點(diǎn)是靈敏,專一性強(qiáng);。

此外還有富集或篩選率比較高時(shí),可以用Southernblot雜交法,

(2)常用的篩選方法有兩類

(3)基因敲除的ES細(xì)胞注射入胚泡(4)胚泡植入假孕小鼠的子宮中導(dǎo)入動(dòng)物胚胎后,可以發(fā)育成嵌合子或完全ES來(lái)源的動(dòng)物。嵌合體動(dòng)物與正常的動(dòng)物雜交,子代動(dòng)物再雜交,有可能產(chǎn)生雜合型突變體。(5)嵌合體的雜交育種

得到純合體:由于同源重組常常發(fā)生在一對(duì)染色體上中一條染色體中,所以如果要得到穩(wěn)定遺傳的純合體基因敲除模型,需要進(jìn)行至少兩代遺傳。一、條件性基因敲除法:

將某個(gè)基因的修飾限制于小鼠某些特定類型的細(xì)胞或發(fā)育的某一特定階段的一種特殊的基因敲除方法。在傳統(tǒng)基因敲除的基礎(chǔ)上,利用了特異性重組酶系統(tǒng)作為調(diào)控的按鈕,實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的時(shí)刻可調(diào)節(jié)敲除。與Cre-loxp重組酶系統(tǒng)有關(guān)。第三節(jié):基因敲除進(jìn)展及前景:

條件性基因敲除優(yōu)點(diǎn):

①目標(biāo)基因的敲除可以限定在特定的組織、細(xì)胞或發(fā)育的特定階段;

②可避免因基因突變而致死胎的問(wèn)題:

③在2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組率較高;

如用病毒或配體/DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)Cre的表達(dá),則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過(guò)程。

常見(jiàn)的幾種誘導(dǎo)性類型如下:四環(huán)素誘導(dǎo)型;干擾素誘導(dǎo)型;激素誘導(dǎo)型;腺病毒介導(dǎo)型。

二、體細(xì)胞基因敲除伴隨核移植和體細(xì)胞克隆技術(shù)的發(fā)展,體細(xì)胞基因敲除-核移植體系為研究熱點(diǎn)。選擇的體細(xì)胞應(yīng)該有較好的繁殖能力和克隆能力。有時(shí)用帶端粒酶基因的DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,提高細(xì)胞的壽命和活力。三、基因捕獲

又稱隨機(jī)基因敲除,又稱隨機(jī)基因敲除,是隨機(jī)插入突變進(jìn)行基因敲除的一種新型方法。原理:將外源基因(報(bào)告基因、標(biāo)記基因)的載體通過(guò)電穿孔或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法導(dǎo)入ES細(xì)胞,并隨機(jī)整合到細(xì)胞基因組中,建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫(kù)。基因誘捕所用的載體一般由報(bào)告基因、選擇性標(biāo)記基因及輔助元件組成。報(bào)告基因缺乏自身的某個(gè)表達(dá)調(diào)控序列,在捕獲內(nèi)源基因的相應(yīng)表達(dá)序列后獲得表達(dá)。根據(jù)所誘捕的表達(dá)調(diào)控序列的不同,廣義的基因誘捕包括:增強(qiáng)子誘捕、基因誘捕、啟動(dòng)子誘捕、poly(A)誘捕。

基因誘捕的優(yōu)點(diǎn)

利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫(kù),節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用,更有效迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。

基因誘捕的缺點(diǎn)

無(wú)法對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾,四、RNAi引起的基因敲除

①、②:雙鏈RNA進(jìn)入細(xì)胞后,能夠在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA,并在RdRP(以RNA為模板指導(dǎo)RNA合成的聚合酶RNA)的作用下自身擴(kuò)增后,再被Dicer酶裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除③

:SiRNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈,并和某些蛋白形成復(fù)合物RNAi引起的基因敲除④:上述復(fù)合物同與互補(bǔ)的mRNA結(jié)合,促進(jìn)mRNA被RNA酶裂解,并且以SiRNA作為引物,以mRNA為模板,在RdRP作用下合成出mRNA的互補(bǔ)鏈,并在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。RNAi引起的基因敲除⑤:這些新生成的siRNA也具有誘發(fā)RNAi的作用,通過(guò)這個(gè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),細(xì)胞內(nèi)的siRNA大大增加,顯著增加了對(duì)基因表達(dá)的抑制。五、基因敲除的應(yīng)用1.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)是研究基因的結(jié)構(gòu)功能和其他生命科學(xué)理論問(wèn)題的重要工具。2.建立生物模型。

基因敲除技術(shù)就常常用于建立某種特定基因缺失的生物模型,從而進(jìn)行相關(guān)的研究。這些模型可以是細(xì)胞,也可以是完整的動(dòng)植物或微生物個(gè)體。最常見(jiàn)的是小鼠,家兔、豬、線蟲、酵母和擬南芥等的基因敲除模型也常見(jiàn)于報(bào)道。

3.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)為人類疾病的基因治療提供有力手段。使用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)牖颊叩牟∽兗?xì)胞,糾正機(jī)體基因缺陷或調(diào)節(jié)基因表達(dá)功能是細(xì)胞重新獲得正常的功能,這個(gè)過(guò)程稱為基因表達(dá)。4.基因敲除和轉(zhuǎn)基因技術(shù)通過(guò)改造生物體基因,可以用于研制優(yōu)良的生物反應(yīng)器,培育新的生物品種和提供異種器官移植的供體動(dòng)物。隨著基

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