第六章動物實驗的基本方法

第六章動物實驗的基本技術方法一.動物實驗前的準備動物實驗前的理論準備:實驗動物方面的基礎知識;選題

;方案的制訂;方法的選定動物實驗前的條件準備:

實驗儀器、藥品、試劑、實驗動物

預備實驗二動物實驗的設計與分組1.設計原則：對照性原則：

設對照組，應有可比性，分為自體對照和組間對照一致性原則：

對照組和試驗組除處理因素外，其他因素保持一致重復性原則同一處理要設多個樣本例數(shù)，為估計試驗誤差、降低試驗誤差、增強代表性，提高實驗結果的精確度隨機性原則：隨機分組客觀性原則

實驗設計、選擇觀察指標以及結果判斷要客觀2.差異的控制：

差異的來源：⑴實驗者；⑵動物；⑶動物與環(huán)境的相互作用實驗者帶來的差異實驗過程的實施：不準確的測量動物固有的差異動物來源不一飼養(yǎng)管理的差別動物生活環(huán)境不同動物健康狀況動物與環(huán)境相互作用引起的差異群居因素，每個籠盒飼養(yǎng)動物數(shù)量動物與實驗操作過程之間的相互作用引起飼養(yǎng)操作與實驗操作的順序?qū)嶒灢僮饕l(fā)的動物之間的影響三.實驗動物的領取明確實驗所用動物的品種、品系、規(guī)格、等級、以及實驗的大致時間表填寫動物申領計劃表，教研室主任簽字生效填寫動物領用表,確定所領動物的品種、品系、規(guī)格、數(shù)量四.實驗動物的抓取和固定

小鼠的抓取和固定抓取方法

圖6—1小鼠抓取固定方法:徒手固定;固定板固定;固定架固定;簡易固定圖小鼠保定大鼠的抓取與固定

抓取方法固定方法:

徒手固定;固定板固定;卵圓鉗固定豚鼠的抓取與固定

抓取方法

固定方法

徒手固定固定板固定

圖豚鼠抓取和保定家兔的抓取與固定

抓取方法

固定方法徒手固定;盒式固定;臺式固定

圖兔抓取和保定犬的抓取與固定

抓取方法

固定方法

慢性試驗中犬的固定方法急性試驗中犬的固定方法:頭部的固定;四肢固定

圖狗嘴捆綁保定的方法豬的抓取與固定

抓取方法固定方法猴的抓取和固定

抓取方法固定方法

五.動物的編號、標記及去毛方法

動物的編號與標記：常用的標記液：

①3%~5%苦味酸溶液（黃色）

②0.5%中性紅或堿性品紅溶液（紅色）③2%硝酸銀溶液（咖啡色，涂后需光照10分鐘）④煤焦油酒精溶液（黑色）圖個體染色標記法編號原則：

先左后右，從前到后。左前肢記為1號，左側腹部為2號，左后肢3號，頭頂部為4號，腰背部5號，尾基部6號，右前肢7號，右側腹部8號，右后肢9號。編號超過10時，可使用兩種不同顏色的溶液，把一種顏色作為個位數(shù)，另一種為十位數(shù)。

六.實驗動物被毛的去除方法

1.

剪毛法2.

拔毛法3.

剃毛法4.

脫毛法常用的化學藥品：硫化鋇（BaS）、硫化鈉（NaS）、硫化鈣（CaS）

七.

動物的麻醉方法

常用的麻醉劑

1.

揮發(fā)性麻醉劑:乙醚、氯仿等

2.

非揮發(fā)性麻醉劑：苯巴比妥鈉、戊巴比妥鈉、硫噴妥鈉等巴比妥類的衍生物，鹽酸氯胺酮、水合氯醛等

3.中藥麻醉劑：洋金花、東莨菪堿等

其他麻醉輔助用試劑：鎮(zhèn)痛劑：芬太尼、埃托菲等鎮(zhèn)靜劑：氟阿尼酮、乙酚丙嗪等抗膽堿藥：阿托品、格隆溴銨等肌松劑：筒箭毒堿、泮庫溴銨等其它：α-2激動劑——美托咪定，對狗、貓、兔及大多數(shù)嚙齒類動物可產(chǎn)生良好的鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛效果動物的麻醉方法1．全身麻醉

①吸入法:②腹腔和靜脈給藥麻醉法

2.局部麻醉:鹽酸普魯卡因、鹽酸可卡因、利多卡因麻醉注意事項:①靜脈注射必須緩慢，同時觀察肌肉緊張性、角膜反射和對皮膚夾捏的反應，當這些活動明顯減弱或消失時，停止注射。

②麻醉時要注意保溫。保溫方法有：實驗桌內(nèi)裝燈，電褥，臺燈照射等

③作慢性實驗時，在寒冷季節(jié)，麻醉劑在注射前應加熱至動物體溫水平。

④注意保持動物的呼吸道的通暢，麻醉前禁食.八.動物的給藥途徑和方法

實驗動物的給藥方法主要分為注射法和投入法兩種，注射法又分為：皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、腦膜下注射、腦內(nèi)注射、胸腔內(nèi)注射、腰椎內(nèi)注射、靜脈注射、關節(jié)腔注射和心內(nèi)注射等方法，投入法可分為：鼻腔內(nèi)投入、胃腔內(nèi)投入、腸管內(nèi)投入、氣管內(nèi)投入以及經(jīng)口腔投入。小鼠的給藥途徑和方法

灌胃（i.g）:動物要固定好；頭頸部保持平展；要沿著口角進針，再順著食管方向插入胃內(nèi)；決不可進針不順就硬向里插。皮下注射（s.c）:常選用頸背部皮膚。

圖大小鼠的灌胃皮內(nèi)注射（i.d）:觀察皮膚血管的通透性變化及觀察皮內(nèi)反應，多用于接種、致敏實驗等。雄性較雌性皮膚緊密，注射難度大。肌肉注射（i.m）：較少應用

腹腔注射（i.p）:靜脈注射（i.v）：一般采用尾靜脈注射。小鼠尾部背腹各有一根動脈，兩側各有一根靜脈。圖小鼠腹腔注射圖小鼠尾靜脈注射大鼠的給藥途徑和方法

灌胃:左手按徒手固定方式固定大鼠,使大鼠伸開兩前肢,手掌握住大鼠背。方法與小鼠相同。皮下注射：常選在左側下腹部或后腿皮膚處，方法同小鼠。

皮內(nèi)注射：常選用背部脊柱兩側的皮膚，方法同小鼠。

肌肉注射：一般選擇股二頭肌注射，但應避免傷及坐骨神經(jīng)，否則會導致后肢癱瘓

腹腔注射：用左手的大拇指、食指和中指從大鼠的前肢和頭部后面抓住大鼠，同時用身體抵住大鼠的兩后肢使之固定，使腹部向上并伸展，注射方法與小鼠相同。靜脈注射：尾靜脈豚鼠的給藥途徑和方法經(jīng)口給藥：固體藥物的投入液體藥物的投入皮下注射：大腿內(nèi)側面、背部、肩部等皮下脂肪少的部位皮內(nèi)注射：脊柱兩側肌肉注射：大腿外側肌肉腹腔注射靜脈注射：

耳緣靜脈外側跖靜脈兔的給藥途徑和方法灌胃：確保灌胃管插入胃內(nèi)；藥液推完后將殘留在灌胃管內(nèi)的藥物用水沖入胃內(nèi)，確保給藥劑量的準確皮內(nèi)注射：背部脊柱兩側的皮膚皮下注射：背部和腿部皮膚肌肉注射腹腔注射靜脈注射：耳緣靜脈圖兔的灌胃圖兔的耳靜脈注射犬的給藥途徑和方法經(jīng)口給藥：

液體藥物的投入：同兔固體藥物的投入皮下注射肌肉注射腹腔注射靜脈注射：頭靜脈、小隱靜脈、正中靜脈、大隱靜脈等圖狗的小隱靜脈注射猴的給藥途徑和方法經(jīng)口給藥：固體藥物的投入液體藥物的投入皮下注射肌肉注射靜脈注射圖猴的后肢皮下靜脈注射豬的給藥途徑和方法灌胃、皮下（耳根）、皮內(nèi)（耳殼外側或腹側）、腹腔注射、靜脈注射（耳緣靜脈）實驗動物用藥量的確定及計算方法動物給藥量的確定：先用小鼠粗略的探索中毒劑量或致死劑量，然后用小于中毒量的劑量或致死量的若干分之一為應用劑量，一般可取1/10-1/15。植物藥粗制劑的劑量多按生藥折算化學藥品可參考化學結構相似的已知藥物，特別是化學結構和作用都相似的藥物的劑量。確定劑量后，若第一次實驗的作用不明顯，動物也沒有中毒的表現(xiàn)，可加大劑量再次實驗。最好同時用幾個劑量做實驗。用大動物進行實驗時，開始的劑量可用給鼠類劑量的1/15-1/2。確定動物給藥劑量時，要考慮動物的年齡大小和體質(zhì)強弱確定動物給藥劑量時，也要考慮因給藥途徑的不同，所用劑量也不同。實驗動物用藥量的計算方法

一般按mg/kg體重或g/kg體重計算，應用時須從已知藥液的濃度換算出相當于每kg體重應注射的藥液量（ml數(shù)），以便給藥人與動物及各類動物間藥物劑量的換算方法人與動物用藥量的換算：動物對藥物的耐受性比人大，一般可按此比例：人用藥量為1，小鼠、大鼠為25-50，兔、豚鼠為15-20，狗、貓為5-10。也可采用人與動物的體表面積計算法來換算人的體表面積計算法：許文生氏公式

體表面積（cm2)=0.0061×身高（cm)+0.0218×體重(kg)-0.1529動物的體表面積計算法：Meeh-Rubner公式

W（體重，g）2/3A（體表面積，m2)=K×10000K是常數(shù)，大、小鼠為9.1；豚鼠9.8；兔10.1；貓9.8；狗11.2；猴11.8

九.動物血液的采集方法(一)大小鼠的血液采集方法眶靜脈叢（竇）采血（多次重復）：輕壓頸部兩側，眼球充分外突眶動脈和眶靜脈取血（大量采血）：盡量使動物眼周圍皮膚往眼后壓，眼球突出充血，彎頭鑷迅速夾去眼球尾靜脈采血：剪尾或切開尾靜脈：將尾巴在熱水中浸泡數(shù)分鐘或用酒精/二甲苯反復擦試針刺尾靜脈其它：心臟采血、大血管采血等(二)兔、豚鼠的血液采集方法耳中央動脈采血：兔耳緣靜脈采血：兔心臟采血：兔、豚鼠頸動（靜）脈采血：背跖靜脈采血：豚鼠(三)犬的血液采集方法前后肢皮下淺層靜脈采血：頸靜脈采血隱動（靜）脈采血股動脈采血心臟采血(四)豬的血液采集方法耳大靜脈心臟采血(五)猴的血液采集方法前肢頭靜脈后肢皮下靜脈十.動物的安樂死方法一.原則：盡量減少動物的痛苦，避免產(chǎn)生驚恐、掙扎、喊叫注意實驗人員的安全方法容易操作不能影響實驗結果盡可能縮短致死時間判斷是否死亡時不僅要看呼吸，而且要觀察神經(jīng)反射、肌肉松弛等情況二.方法頸椎脫臼法：大、小鼠、豚鼠、兔空氣栓塞法：兔、貓、犬放血法：大、小鼠、豚鼠、兔、貓、犬斷頭法：大、小鼠、沙鼠藥物法：藥物吸入：大、小鼠、豚鼠等；CO2、CO、乙醚、氯仿等藥物注射：兔、犬靜脈注射氯化鉀、巴比妥類麻醉劑、DDT等病理解剖與取材病理解剖：動物麻醉后固定好，依次打開胸、腹腔，觀察臟器形態(tài)病理組織學取材：——病理切片、染色及組化用

ⅰ：10%甲醛溶液作為固定液

ⅱ：取樣要有代表性，包括病灶及周圍組織

ⅲ：組織塊大小1-1.5cm，厚度不超過0.2cm

ⅳ：組織要完整，注意夾捏組織時別弄破，減少人為的組織損傷

ⅴ:固定液要淹沒組織塊，最好每個組織塊單瓶固定，瓶體上標注好組別、動物編號、組織名稱、組織塊數(shù)量、取材時間等內(nèi)容。電鏡超薄切片取材：

?。?%戊二醛固定

ⅱ：用刀片切成1cm3大小的組織塊，避免反復切割組織造成人為損傷，取材要迅速，盡快放入固定液中

ⅴ:固定液要淹沒組織塊，每個組織塊單瓶固定，瓶體上標注好組別、動物編號、組織名稱、取材時間等內(nèi)容。動物實驗中的飼養(yǎng)管理單性別分籠飼養(yǎng)

性別鑒定：生殖孔與肛門之間的距離，雄性比雌性長動物個體標記：染色法各組別籠盒進行標記，按順序放置飼養(yǎng)密度：注意房間的溫濕度、通風換氣、光照等環(huán)境因素飼養(yǎng)管理：

?。翰婚g斷飲食

ⅱ：及時更換墊料與籠盒：一般小鼠每周至少更換一次墊料，大鼠一周兩次；籠盒與墊料一起更換，并進行清洗與滅菌處理

ⅲ：及時添加飼料、更換飲水，飲水原則上整瓶更換，半瓶時倒掉后瓶體清洗滅菌

ⅳ：每日至少進入動物房觀察1次，飼養(yǎng)操作與觀察盡量固定時間

ⅴ：房間每周至少清掃一次，最好用消毒藥水進行必要的擦洗。

ⅵ：更換的墊料及廢棄物不得隨便丟棄，動物尸體單獨包裝后送至冷庫，集中焚燒處理。論文中有關實驗動物和動物實驗的描述動物的品種、品系、規(guī)格、性別、數(shù)量、分組、來源品種、品系名稱要寫全，不能用縮寫；明確所選用動物的年（月、周）齡、體重（平均數(shù)±標準差）；性別（單一性別或雌雄各半）；數(shù)量（每個實驗組幾只）；來源