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文檔簡介

Chapter2

TheproductionofEnzymebyFermentationofMicroorganism微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1酶的生產(chǎn)方法提取分離法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化學(xué)合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillusPlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample微生物發(fā)酵產(chǎn)酶植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶2Contentsofchapter21、酶生物合成過程2、常見產(chǎn)酶微生物4、酶的發(fā)酵工藝條件及控制5、酶生產(chǎn)過程的動力學(xué)6、動植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)酶3、微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式32.1酶生物合成過程ThebiosynthesisprocessofEnzyme1、中心法則-CentralDogma2、RNA的生物合成-Transcription3、蛋白質(zhì)的生物合成-Translation4、酶生物合成的調(diào)節(jié)-RegulationGoGoGoGo下一節(jié)本章目錄4Reversetranscription1、中心法則-CentralDogma5Replication復(fù)制:親代DNA或RNA在一系列酶的作用下,生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。Transcription轉(zhuǎn)錄:以DNA為模板,按照堿基配對原則將其所含的遺傳信息傳給RNA,形成一條與DNA鏈互補(bǔ)的RNA的過程。Translation翻譯:亦叫轉(zhuǎn)譯,以mRNA為模板,將mRNA的密碼解讀成蛋白質(zhì)的AA順序的過程。Reversetranslation逆轉(zhuǎn)錄:以RNA為模板,在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,生成DNA的過程。本節(jié)目錄62、RNA的生物合成(轉(zhuǎn)錄)-Transcription細(xì)胞內(nèi)RNA的生物功能(1)在某些RNA病毒中,其所含的雙鏈RNA作為遺傳信息的載體。(2)在蛋白質(zhì)的生物合成過程中,各種RNA起著重要的作用。其中,tRNA作為氨基酸載體,并由其上的反密碼子識別mRNA分子上的密碼子;mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板,由其分子上的三聯(lián)體密碼控制蛋白質(zhì)分子中氨基酸的排列順序;rRNA與蛋白質(zhì)一起組成核糖核蛋白體(核糖體),作為蛋白質(zhì)生物合成的場所。(3)某些RNA具有生物催化活性,屬于核酸類酶,在一定條件下,可以催化有關(guān)的生化反應(yīng)。(4)各種小分子RNA在分子修飾和代謝調(diào)節(jié)等方面有重要作用。7轉(zhuǎn)錄過程的特點1、轉(zhuǎn)錄的不對稱性:在RNA的合成中,DNA的二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄的模板,稱為轉(zhuǎn)錄的不對稱性。反義鏈antisensestrand(無意義鏈,負(fù)鏈):在RNA的轉(zhuǎn)錄中,用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈codingstrand(編碼鏈,正鏈):在RNA的轉(zhuǎn)錄中,不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。2、轉(zhuǎn)錄所需酶:依賴DNA的RNA聚合酶又稱為轉(zhuǎn)錄酶,是以DNA為模板的一類RNA聚合酶。在原核生物和真核生物中,轉(zhuǎn)錄酶有所不同。原核生物的轉(zhuǎn)錄酶比較簡單,由1種RNA聚合酶催化所有RNA的生物合成。而在真核生物中RNA聚合酶有3種,分別為RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ,它們都屬于寡聚酶,酶的亞基數(shù)目為4~10個,亞基種類有4~6種。8轉(zhuǎn)錄過程起始位點的識別recognition轉(zhuǎn)錄起始initiation鏈的延伸elongation轉(zhuǎn)錄終止termination轉(zhuǎn)錄后加工modification9TheE.coliRNApolymeraseholoenzymeconsistsofsixsubunits:a2bb’s.PossiblecatalyticsubunitsPromoterspecificityEnzymeassembly,promoterrecognition,activatorbindingRoleunknown(notneededinvitro)36.5kDa15115511kDa(32-90kDa)10本節(jié)目錄113、蛋白質(zhì)的合成(翻譯)-Translation翻譯:以RNA中mRNA為模板,按照其核苷酸順序所組成的密碼指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成的過程.mRNA蛋白質(zhì)翻譯

各種信息各種蛋白質(zhì)(核苷酸排列順序)(氨基酸排列順序)12蛋白質(zhì)合成的幾個要素-mRNA(模板,template)mRNA是帶有DNA遺傳信息指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的直接模板。以mRNA為模板,合成一定結(jié)構(gòu)的多肽鏈的過程(翻譯),就是將mRNA分子中的核苷酸排列順序轉(zhuǎn)變成蛋白質(zhì)分子中的氨基酸排列順序。13蛋白質(zhì)合成的幾個要素-遺傳密碼,nucleotidetripletcodonmRNA分子中,每三個相鄰的核苷酸組成的三聯(lián)體代表某種氨基酸或其它信息,稱為密碼子或三聯(lián)密碼。四種核苷酸編成三聯(lián)體可形成43個即64個密碼子。其中:一個起始密碼:AUG三個終止密碼:UAAUGAUAG多數(shù)氨基酸擁有2-4個密碼141516蛋白質(zhì)合成的幾個要素-轉(zhuǎn)運RNA(transporter)tRNA是氨基酸的轉(zhuǎn)運工具,攜帶活化的氨基酸到核蛋白體。tRNA有特異性,至少有20種以上。每種tRNA的反密碼環(huán)頂端均有由三個核苷酸組成的反密碼,能與mRNA上相應(yīng)的密碼互補(bǔ)結(jié)合。17酪5’5’3’AUGGUUUACACA酪氨酰-tRNA反密碼mRNA密碼(codon)與反密碼(anticodon)的堿基配對18蛋白質(zhì)合成的幾個要素-核糖體,ribosome核糖體(或稱核糖核蛋白體)由蛋白質(zhì)和rRNA組成。是存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的微小顆粒。19Theribosomecompositionofprokaryoticandeukaryoticcell沉降系數(shù)就是用來表示生物組織成分在離心力場下沉淀下來的速度大小,沉降系數(shù)越大,越先沉降20蛋白質(zhì)合成的幾個要素-其他因子和酶其他輔助因子工具酶21蛋白質(zhì)的合成過程肽鏈合成的起始initiation肽鏈合成的延伸elongation肽鏈合成的終止與釋放terminationandrelease合成多肽的輸送和加工transportandmodification蛋白質(zhì)分子的折疊folding22氨基酸活化生成氨酰-tRNA23原核生物肽鏈合成的起始階段是在GTP和起始因子(InitiationFactor)的參與下,核糖體30S亞基,fMet-tRNAF,mRNA和50S亞基結(jié)合,組成起始復(fù)合物的過程。主要包括5個步驟:(1)30S亞基與起始因子IF3結(jié)合;(2)30S亞基與mRNA結(jié)合,形成30S-IF3-mRNA復(fù)合物;(3)fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結(jié)合,生成fMet-tRNAF-IF2-GTP;(4)在起始因子IF1的參與下,fMet-tRNAF-IF2-GTP與30S-IF3-mRNA結(jié)合生成30S起始復(fù)合物。在此30S起始復(fù)合物中,fMet-tRNAF上的反密碼子正好與mRNA上的起始密碼子AUG結(jié)合;(5)50S亞基與上述30S起始復(fù)合物結(jié)合,形成完整的70S核糖體。同時放出IF1,IF2,IF3,并使GTP水解生成GDP和Pi。在此70S核糖體形成時,fMet-tRNAF位于70S核糖體的“P”位(肽酰基位),而它的“A”位(氨酰基位)是空位。蛋白質(zhì)合成起始24進(jìn)位轉(zhuǎn)位成肽25合成終止26高效率的蛋白質(zhì)合成體系27蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)如何形成?功能與結(jié)構(gòu)如何統(tǒng)一?體外、體內(nèi)的結(jié)構(gòu)如何變化?蛋白質(zhì)分子設(shè)計及蛋白質(zhì)工程的需要越來越多的基因工程產(chǎn)物需要復(fù)性復(fù)活,要求蛋白質(zhì)折疊的理論及技術(shù)的指導(dǎo)?;蚬こ讨亟M蛋白類產(chǎn)物必須要形成正確的折疊才能表現(xiàn)出功能和活性。蛋白質(zhì)的折疊本節(jié)目錄28ABEX底物水平的調(diào)節(jié)酶水平的調(diào)節(jié)

酶活性的調(diào)節(jié)酶含量的調(diào)節(jié)酶的定位調(diào)節(jié)輔助因子調(diào)節(jié)生長發(fā)育的不同時期外界環(huán)境變化酶合成與分解速度的變化(基因表達(dá)調(diào)控)產(chǎn)物調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)酶的調(diào)控模式4、酶生物合成的調(diào)節(jié)(regulation)29組成型酶在細(xì)胞中的量比較恒定,環(huán)境因素對這些酶的合成速率影響不大。

如DNA聚合酶,RNA聚合酶,糖酵解途徑中的各種酶。適應(yīng)型酶在細(xì)胞中的含量變化較大,其合成速率明顯受到環(huán)境因素的影響。適應(yīng)型的酶的生物合成受到的調(diào)節(jié)控制:轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)、翻譯水平的調(diào)節(jié)、翻譯產(chǎn)物的加工調(diào)節(jié)和酶降解的調(diào)節(jié)。4、酶生物合成的調(diào)節(jié)(regulation)30酶在細(xì)胞內(nèi)的含量取決于酶的合成速度和分解速度。細(xì)胞根據(jù)自身活動需要,嚴(yán)格控制細(xì)胞內(nèi)各種酶的合理含量,從而對各種生物化學(xué)過程進(jìn)行調(diào)控。酶濃度調(diào)節(jié)的化學(xué)本質(zhì)是基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在細(xì)胞內(nèi),所合成的酶的種類及數(shù)量是由特殊的基因信息決定的。DNA所攜帶的酶蛋白遺傳信息,需要通過轉(zhuǎn)錄和翻譯而合成酶蛋白。在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程都有特定的調(diào)節(jié)控制機(jī)制,其中轉(zhuǎn)錄的調(diào)控占主導(dǎo)地位。因此,基因表達(dá)的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行。31轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)又稱基因調(diào)節(jié)理論與酶的生物合成關(guān)系密切的基因:調(diào)節(jié)基因、啟動基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因。啟動基因決定酶的合成能否開始,由兩個位點組成,一個是RNA聚合酶的結(jié)合位點,另一個是cAMP與CAP組成的復(fù)合物(cAMP-CAP)的結(jié)合位點。CAP是cAMP受體蛋白或分解代謝物活化劑蛋白。只有cAMP-CAP復(fù)合物結(jié)合到啟動基因的位點上時,RNA聚合酶才能結(jié)合到其在啟動基因上的相應(yīng)位點上,轉(zhuǎn)錄才有可能開始,否則酶就無法開始合成。調(diào)節(jié)基因可以產(chǎn)生一種阻遏蛋白,當(dāng)阻遏蛋白與操縱基因結(jié)合時,由于空間排擠作用,RNA聚合酶就無法結(jié)合到啟動基因的位點上,也無法進(jìn)入到結(jié)構(gòu)基因的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,因而無法將DNA上的遺傳信息轉(zhuǎn)錄到mRNA分子上,酶的生物合成無法進(jìn)行。只有當(dāng)阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合,改變結(jié)構(gòu)而不與操縱基因結(jié)合時,RNA聚合酶才能結(jié)合到啟動基因的位點上,才能開始酶的生物合成。32啟動基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因一起組成操縱子。在原核生物中,操縱子有兩種類型,即誘導(dǎo)型和阻遏型。誘導(dǎo)型操縱子在無誘導(dǎo)物的情況下,其基因的表達(dá)水平很低或不表達(dá),只有在有誘導(dǎo)物的情況下,才能轉(zhuǎn)錄生成mRNA,進(jìn)而合成酶阻遏型操縱子在無阻遏物的情況下,基因正常表達(dá),當(dāng)有阻遏物存在時,轉(zhuǎn)錄受到阻遏。轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)主要有3種模式,分解代謝物阻遏作用、酶合成的誘導(dǎo)作用和酶合成的反饋阻遏作用33分解代謝物阻遏作用某些物質(zhì)(主要指葡萄糖和其他容易利用的碳源等)經(jīng)過分解代謝產(chǎn)生的物質(zhì)阻遏某些酶(主要是誘導(dǎo)酶)生物合成的現(xiàn)象如葡萄糖阻遏β-半乳糖苷酶的生物合成,果糖阻遏α-淀粉酶的生物合成。添加一定量的cAMP可以減少或解除分解代謝物阻遏作用。34細(xì)菌乳糖操縱子的作用機(jī)制(分解代謝物阻遏)調(diào)節(jié)基因啟動子操縱基因lacZlacYlacACAPcAMPCAP-cAMP復(fù)合物mRNA當(dāng)葡萄糖作唯一碳源時,葡萄糖的降解物對腺苷酸環(huán)化酶(將ATP轉(zhuǎn)變成cAMP)有抑制作用,則cAMP的濃度降低,CAP-cAMP復(fù)合物減少,不能與啟動子結(jié)合,故轉(zhuǎn)錄不得進(jìn)行。+-半乳糖苷酶-半乳糖苷透過酶-半乳糖苷乙?;D(zhuǎn)移酶酶過去稱葡萄糖效應(yīng)35酶生物合成的誘導(dǎo)作用酶合成誘導(dǎo)的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作:已知分解利用乳糖的酶有:-半乳糖苷酶;-半乳糖苷透過酶;硫代半乳糖苷轉(zhuǎn)乙酰酶。實驗:

1.大腸桿菌生長在葡萄糖培養(yǎng)基上時,細(xì)胞內(nèi)無上述三種酶合成;

2.大腸桿菌生長在唯一碳源乳糖培養(yǎng)基上時,細(xì)胞內(nèi)有上述三種酶合成;當(dāng)換成葡萄糖培養(yǎng)基時,三種酶基本消失;

3.表明菌體生物合成的經(jīng)濟(jì)原則:需要時才合成。

本世紀(jì)三十年代,H.Karstrom在對糖代謝過程中的某些酶的合成進(jìn)行研究時提出:誘導(dǎo)酶與組成酶加入某種物質(zhì)使酶的生物合成開始或加速進(jìn)行的過程,叫做酶合成的誘導(dǎo)。能誘導(dǎo)酶合成的物質(zhì)叫誘導(dǎo)物。被誘導(dǎo)合成的酶叫誘導(dǎo)酶。36乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)無誘導(dǎo)物存在時,調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白(lacrepressor)與操縱基因(Olac)的結(jié)合力強(qiáng),結(jié)構(gòu)基因無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,酶的生物合成受阻。37誘導(dǎo)機(jī)制當(dāng)培養(yǎng)基中以乳糖為唯一碳源時,細(xì)胞吸收乳糖變?yōu)閯e乳糖,別乳糖作為誘導(dǎo)物與阻遏蛋白結(jié)合,使阻遏蛋白結(jié)構(gòu)改變,與操縱基因結(jié)合力變?nèi)?,不再與操縱基因結(jié)合,酶的生物合成可以進(jìn)行。38酶生物合成的阻遏作用酶合成阻遏的現(xiàn)象—JacobandMonod的工作:實驗:

1.大腸桿菌生長在無機(jī)鹽和葡萄糖的培養(yǎng)基上時,檢測到細(xì)胞內(nèi)有色氨酸合成酶的存在;

2.在上述培養(yǎng)基中加入色氨酸,檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)色氨酸合成酶的活性降低,直至消失。

3.表明色氨酸的存在阻止了色氨酸合成酶的合成,體現(xiàn)了菌生長的經(jīng)濟(jì)原則:不需要就不合成。酶生物合成的阻遏作用又稱為產(chǎn)物阻遏作用,是指酶催化作用的產(chǎn)物或代謝途徑的末端產(chǎn)物使該酶的生物合成受到足額的現(xiàn)象。能阻遏酶合成的物質(zhì)叫輔阻遏物。被輔阻遏物作用而停止合成的酶叫阻遏酶。39調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因mRNA酶蛋白在沒有阻遏物存在時,調(diào)節(jié)基因產(chǎn)生的阻遏蛋白與操縱基因的親和力弱,不能與操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因能夠表達(dá)調(diào)節(jié)基因操縱基因結(jié)構(gòu)基因輔阻遏物trp當(dāng)環(huán)境中色氨酸濃度增加,阻遏物到達(dá)一定濃度時,阻遏蛋白與阻遏物結(jié)合,使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,與操縱基因結(jié)合,結(jié)構(gòu)基因不能表達(dá)色氨酸操縱子(酶的阻遏)

----------阻遏物和操縱基因的調(diào)節(jié)402.2常見產(chǎn)酶微生物CommonmicroorganisminEnzymeProduction基本要求:發(fā)酵周期短,產(chǎn)量高;容易培養(yǎng)和管理;產(chǎn)酶穩(wěn)定性好,不易變異退化,不易被感染;利于酶的分離純化;安全可靠,無毒性。(非致病菌):凡從可食部分或食品加工中傳統(tǒng)使用的微生物生產(chǎn)的酶,安全!由非致病微生物制取的酶,需作短期毒性實驗。非常見微生物制取的酶,需做廣泛的毒性實驗,包括慢性中毒實驗。41(1)大腸埃希氏桿菌,簡稱為大腸桿菌,是最為著名的原核生物。形態(tài):短桿或長桿狀,0.5~1.0×1.0~3.0um,革蘭氏陰性,運動(周毛)或不運動,無芽孢,一般無莢膜。菌落呈白色至黃白色,擴(kuò)展,光滑,閃光。Escherich屬菌株和大多數(shù)大腸桿菌是無害,但也有些大腸桿菌是致病的,會引起腹瀉和尿路感染。大腸桿菌的名聲主要因它易于在實驗室操作、生長迅速,而且營養(yǎng)要求低。應(yīng)用: 大腸桿菌能作為宿主供大量的細(xì)菌病毒生長繁殖 大腸桿菌也是最早用作基因工程的宿主菌 工業(yè)上生產(chǎn)谷氨酸脫羧酶、天冬酰胺酶和制備天冬氨酸、蘇氨酸及纈氨酸等42(2)醋酸桿菌(Acetobacter)

菌體從橢圓至桿狀,單個、成對或成鏈,革蘭氏陰性,運動(周毛)或不運動,不生芽孢。好氣。含糖、乙醇和酵母膏的培養(yǎng)基上生長良好。應(yīng)用:有機(jī)酸(食醋等)葡萄糖異構(gòu)酶(高果糖漿)山梨糖(維C中間體)43(3)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)

直狀、近直狀的桿菌,周生或側(cè)生鞭毛,革蘭氏陽性,無莢膜,芽孢0.5×1.51.8m,中生或近中生??莶菅挎邨U菌是工業(yè)發(fā)酵的重要菌種之一。生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、5’-核苷酸酶、某些氨基酸及核苷。44(4)根霉(Rhizopus)分類學(xué)上屬于藻狀菌綱,毛霉目,根霉屬。根霉因有假根(Rhizoid)而得名(假根的功能是在培養(yǎng)基上固著,并吸收營養(yǎng))。分布于土壤、空氣中,常見于淀粉食品上,可引起霉腐變質(zhì)和水果、蔬菜的腐爛。代表種:米根霉(R.oryzae)黑根霉(R.nigrican)等。應(yīng)用:根霉能產(chǎn)生一些酶類,如淀粉酶、果膠酶、脂肪酶等,是生產(chǎn)這些酶類的菌種。在釀酒工業(yè)上常用做糖化菌。有些根霉還能產(chǎn)生乳酸、延胡索酸等有機(jī)酸。45(5)曲霉(Aspergillus)分類:多數(shù)屬于子囊菌亞門,少數(shù)屬于半知菌亞門。分布:廣泛分布于土壤、空氣和谷物上,可引起食物、谷物和果蔬的霉腐變質(zhì),有的可產(chǎn)生致癌性的黃曲霉毒素。代表種:黑曲霉Asp.Niger、黃曲霉Asp.flavus應(yīng)用:是制醬、釀酒、制醋的主要菌種。是生產(chǎn)酶制劑(蛋白酶、淀粉酶、果膠酶)的菌種。生產(chǎn)有機(jī)酸(如檸檬酸、葡萄糖酸等)。農(nóng)業(yè)上用作生產(chǎn)糖化飼料的菌種?;乇竟?jié)46酶的發(fā)酵生產(chǎn)方式固體發(fā)酵液體發(fā)酵2.3微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶的方式47固體發(fā)酵表面培養(yǎng)或曲式培養(yǎng)以麩皮、米糠等為基本原料,加入適量的無機(jī)鹽和水作為培養(yǎng)基進(jìn)行產(chǎn)酶微生物菌種培養(yǎng)的一種培養(yǎng)技術(shù)淺盤培養(yǎng)轉(zhuǎn)桶培養(yǎng)多用通風(fēng)式厚層培養(yǎng)固體發(fā)酵技術(shù)原理48固體發(fā)酵法設(shè)備簡單,便于推廣,特別適合于霉菌的培養(yǎng)和產(chǎn)酶發(fā)酵條件不易控制、物料利用不完全、勞動強(qiáng)度大、容易染菌等優(yōu)點缺點不適于胞內(nèi)酶的生產(chǎn)49液體深層發(fā)酵浸沒式發(fā)酵利用液體培養(yǎng)基,在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行的一種攪拌通氣培養(yǎng)方式酶制劑生產(chǎn)的主要培養(yǎng)方式原料的利用率和酶的產(chǎn)量都較高,培養(yǎng)條件容易控制液體發(fā)酵法50工業(yè)規(guī)模應(yīng)用的微生物酶和它們的某些來源酶產(chǎn)酶微生物用途α-淀粉酶枯草芽胞桿菌,地衣芽胞桿菌,米曲霉淀粉液化,織物退漿,消化助劑,加酶洗滌劑葡萄糖淀粉酶米曲霉,黑曲霉,米根霉制造葡萄糖,發(fā)酵、釀酒等工業(yè)的淀粉水解糖中性蛋白酶枯草芽胞桿菌,米曲霉皮革、毛皮加工,食品加工,調(diào)味品制造、助消化、消炎、啤酒澄清堿性蛋白酶地衣芽胞桿菌加酶洗滌劑植酸酶黑曲霉,畢赤酵母工程菌株飼料添加劑轉(zhuǎn)化酶啤酒酵母、假絲酵母制造轉(zhuǎn)化糖凝乳酶米赫毛霉、大腸桿菌和真菌生產(chǎn)的重組酶制造乳酪脂肪酶曲霉、根霉、酵母等加酶洗滌劑,油脂加工,生物化工葡萄糖氧化酶青霉、曲霉食品去氧、除葡萄糖,測定葡萄糖葡萄糖異構(gòu)酶凝結(jié)芽胞桿菌,白色鏈霉菌生產(chǎn)果葡糖漿青霉素?;讣?xì)菌、霉菌、放線菌制造6-氨基青霉烷酸纖維素酶里氏木霉、黑曲霉水洗布生產(chǎn),飼料添加劑,消化植物細(xì)胞壁半纖維素酶木霉、曲霉、根霉飼料添加劑,消化植物細(xì)胞壁,低聚木糖生產(chǎn)β-葡聚糖酶枯草芽胞桿菌,黑曲霉啤酒釀造,飼料添加劑異淀粉酶產(chǎn)氣克雷伯氏菌,芽孢桿菌淀粉加工乳糖酶乳酸酵母,米曲霉,黑曲霉,米根霉乳品工業(yè)(處理牛乳和乳清)果膠酶曲霉、歐文氏菌水果加工,果汁、果酒澄清,麻類纖維脫膠52酶無菌空氣預(yù)培養(yǎng)固定化細(xì)胞保藏細(xì)胞細(xì)胞活化培養(yǎng)基固定化原生質(zhì)體原生質(zhì)體發(fā)酵擴(kuò)大培養(yǎng)分離純化工藝流程

2.4酶的發(fā)酵工藝條件與控制53一、細(xì)胞活化與擴(kuò)大培養(yǎng)1、生產(chǎn)菌種的來源(1)購買或篩選向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株,從中篩選所需菌株。中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC);中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC,又稱武大保藏中心)。中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心(ACCC);中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)美國典型微生物菌種保藏中心(ATCC)荷蘭微生物菌種保藏中心(CBS)德國微生物菌種保藏中心(DSMZ)英國國家典型菌種保藏所(NCTC)54(2)篩選由自然界采集樣品,如土壤、水、動植物體等,從中進(jìn)行分離篩選。篩選步驟:①樣品的采集:主要是各種富含所需微生物的土壤、水、氣、枯枝爛葉、爛水果等。②初篩:分離產(chǎn)目的酶的菌株給予特殊的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件,進(jìn)而讓目的菌株得以繁殖,盡可能地把只成為目的菌的菌株分離出來。55-淀粉酶的篩選蛋白酶的篩選56③復(fù)篩:從所得菌株中篩選優(yōu)良株在初篩的基礎(chǔ)上,篩選產(chǎn)酶量高、性能更符合生產(chǎn)要求的菌種。④高產(chǎn)菌株的選育誘變育種、細(xì)胞雜交、原生質(zhì)體融合育種、基因工程育種(3)保藏常用的保藏方法:斜面保藏法、沙土管保藏法、真空冷凍干燥保藏法、低溫保藏法、石蠟油保藏法。572、生產(chǎn)種子的制備

生產(chǎn)種子:由原始保藏菌種,經(jīng)過活化,擴(kuò)大培養(yǎng),用于發(fā)酵罐接種的大量菌體。(1)菌種活化

目的:保藏的菌種在用于發(fā)酵生產(chǎn)之前,必須接種于新鮮的斜面培養(yǎng)基上,在一定的條件下培養(yǎng),以恢復(fù)細(xì)胞的生命活動能力。方法:在試管斜面上培養(yǎng)1~3代。58(2)擴(kuò)大培養(yǎng)

目的:活化后的菌種經(jīng)過一級至數(shù)級的擴(kuò)大培養(yǎng),以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)基稱為種子培養(yǎng)基。59

方法:分為實驗室培養(yǎng)和車間培養(yǎng)兩個階段。擴(kuò)大培養(yǎng)應(yīng)注意的事項:(1)盡量減少傳代次數(shù),以降低菌種衰退和污染的可能性;(2)培養(yǎng)基成分一般應(yīng)比發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源豐富;(3)培養(yǎng)時間一般控制在微生物生長的對數(shù)生長期,及時接入下一級培養(yǎng)或發(fā)酵罐;(4)嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件(pH、溫度、通氣量等),加強(qiáng)培養(yǎng)過程的實時監(jiān)測。60二、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分一般包括碳源、氮源,無機(jī)鹽、生長因子等。培養(yǎng)基是指人工配制的用于細(xì)胞培養(yǎng)和發(fā)酵的各種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。611、碳源在酶的生物合成法生產(chǎn)過程中,首先要從細(xì)胞的營養(yǎng)要求和代謝調(diào)節(jié)方面考慮碳源的選擇;此外還要考慮到原料的來源是否充裕、價格是否低廉、對發(fā)酵工藝條件和酶的分離純化是否影響等因素。不同的細(xì)胞對各種碳源的利用差異很大,所以在配制培養(yǎng)基時應(yīng)根據(jù)不同細(xì)胞的不同要求而選擇合適的碳源。如黑曲霉具有淀粉酶系,可以采用淀粉為碳源,而酵母不能利用淀粉,只能采用蔗糖和葡萄糖等為碳源。62

當(dāng)前酶制劑生產(chǎn)使用的菌種大都是只能利用有機(jī)碳的異養(yǎng)型微生物。

有機(jī)碳的主要來源有:一是農(nóng)副產(chǎn)品中如甘薯、麩皮、玉米、米糠等淀粉質(zhì)原料;二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉質(zhì)原料。

此外,以石油產(chǎn)品中12~16碳的成分來作碳源,如以某些嗜石油微生物生產(chǎn)蛋白酶、脂酶,均已獲得成功。632、氮源酶制劑生產(chǎn)中的氮源主要有有機(jī)氮源和無機(jī)氮源兩種。

常用的有機(jī)氮源有:豆餅、花生餅、菜籽餅、魚粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等;

無機(jī)氮源有:(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3PO4、尿素等。643、碳氮比碳氮比(C/N)指培養(yǎng)基中碳元素的總量與氮元素總量之比。有的采用碳源總量和氮源總量之比。

一般蛋白酶(包括酸性、中性和堿性蛋白酶)生產(chǎn)采用碳氮比低的培養(yǎng)基比較有利。

淀粉酶(包括α-淀粉酶、糖化酶、β-淀粉酶等)生產(chǎn)的碳氮比一般比蛋白酶生產(chǎn)略高。65在微生物酶生產(chǎn)過程中,培養(yǎng)基的碳氮比也因培養(yǎng)過程不同而異。例如種子培養(yǎng)時,為了適應(yīng)菌體生長繁殖的需要,種子培養(yǎng)基的碳氮比一般要比發(fā)酵培養(yǎng)基低些。

發(fā)酵時,不同發(fā)酵階段要求的碳氮比也是不同的。例如在枯草桿菌BF-7658生產(chǎn)α-淀粉酶的發(fā)酵過程中,發(fā)酵前期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)降低,以利菌體生長繁殖,發(fā)酵中后期要求培養(yǎng)基的碳氮比適當(dāng)提高,以促進(jìn)淀粉酶的生成。664、無機(jī)鹽不同無機(jī)鹽在細(xì)胞的生命活動中作用不同,如主要組成元素(磷和硫),酶分子的組成元素(磷、硫、鋅、鈣),酶的激活劑(鉀、鎂、鋅、銅、鐵、錳、鈣、鉬、鈷、碘等),調(diào)節(jié)pH、氧化還原電位和滲透壓(鈉、鉀、鈣、磷、氯等)

根據(jù)細(xì)胞對無機(jī)元素需要量的不同,無機(jī)元素分為大量元素和微量元素兩大類。大量元素:磷、硫、鉀、鈣、鎂、氯等;微量元素:銅、錳、鋅、鉬、鈷、溴、碘等675、生長因子微生物還需一些微量的像維生素一類的物質(zhì),才能正常生長發(fā)育,這類物質(zhì)統(tǒng)稱生長因子(或生長素)。其中包括某些氨基酸、維生素、嘌呤或嘧啶等。酶制劑生產(chǎn)中所需的生長因子,大多是由天然原料提供,如玉米漿、麥芽汁、豆芽汁、酵母膏、麩皮、米糠等。玉米漿中一般含有生長素32~128mg/mL。68三、液體深層發(fā)酵的工藝控制酶的發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)酵效果除了受到菌種產(chǎn)酶性能的影響外,還受到發(fā)酵溫度、pH、溶氧量等條件的影響。691、溫度對產(chǎn)酶的影響微生物生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度隨著菌種和酶的性質(zhì)不同而異,生長繁殖和產(chǎn)酶的最適溫度往往不一致。一般細(xì)菌為37℃,霉菌和放線菌為28~30℃,一些嗜熱微生物需在40~50℃下生長繁殖,如紅曲霉生長溫度35~37℃,而生產(chǎn)糖化酶的最適溫度為37~40℃。70在酶生產(chǎn)中,為了有利于菌體生長和酶的合成,也有進(jìn)行變溫生產(chǎn)的。例如以枯草桿菌ASl.398進(jìn)行中性蛋白酶生產(chǎn)時,培養(yǎng)溫度必須從31℃逐漸升溫至40℃,然后再降溫到31℃進(jìn)行培養(yǎng),蛋白酶產(chǎn)量比不升溫者高66%。71

發(fā)酵溫度的變化主要隨著微生物代謝反應(yīng)、發(fā)酵中通風(fēng)、攪拌速度的變化而變化的。細(xì)胞的新陳代謝釋放能量,通風(fēng)攪拌導(dǎo)致發(fā)酵液升溫。同時由于熱量的不斷擴(kuò)散,會導(dǎo)致培養(yǎng)基的溫度不斷降低。兩者決定培養(yǎng)基的溫度。

溫度調(diào)控一般采用熱水升溫、冷水降溫的方法。發(fā)酵罐或其他生物反應(yīng)器均設(shè)計有足夠傳熱面積的熱交換裝置,如排管、蛇管、夾套、噴淋管等。722、pH對產(chǎn)酶的影響不同的細(xì)胞生長繁殖的最適pH有所不同。細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適pH與生長最適pH往往有所不同。細(xì)胞生產(chǎn)某種酶的最適pH通常接近于該酶催化反應(yīng)的最適pH。73

培養(yǎng)基的pH隨著細(xì)胞的生長、繁殖和新陳代謝產(chǎn)物的積累,往往會發(fā)生變化。一般來說,培養(yǎng)基成分中碳/氮(C/N)比高,由于糖代謝產(chǎn)生有機(jī)酸,發(fā)酵液傾向于酸性,pH低;C/N低,發(fā)酵液傾向于堿性,pH高。

控制pH的方法:改變培養(yǎng)基的組分和比列;使用緩沖液維持一定的pH;使用酸堿調(diào)節(jié)pH等。743、溶解氧對產(chǎn)酶的影響細(xì)胞必須獲得充足的氧氣,使從培養(yǎng)基中獲得的能源物質(zhì)(一般是指各種碳源)經(jīng)過有氧降解而生成大量的細(xì)胞的生長繁殖和酶的生物合成過程需要大量的能量ATP。75◆在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞一般只能吸收和利用溶解氧。在發(fā)酵過程中必須不斷供給氧(一般通過供給無菌空氣來實現(xiàn)),使培養(yǎng)基中的溶解氧保持在一定的水平。◆細(xì)胞對溶解氧的需要量與細(xì)胞的呼吸強(qiáng)度及培養(yǎng)基中的細(xì)胞濃度密切相關(guān)??梢杂煤难跛俾蔏O2表示:

KO2=QO2·Cc76◆氧的溶解速度又稱為溶氧速率或溶氧系數(shù),以Kd表示?!羧苎跛俾逝c通氣量、氧氣分壓、氣液接觸時間、氣液接觸面積以及培養(yǎng)液的性質(zhì)等有密切關(guān)系?!舢?dāng)溶氧速率和耗氧速率相等時,即:K02=Kd

的條件下,培養(yǎng)液中的溶解氧的量保持恒定,可以滿足細(xì)胞生長和發(fā)酵產(chǎn)酶的需要。77◆調(diào)節(jié)溶解氧的方法主要有:①調(diào)節(jié)通氣量②調(diào)節(jié)氧的分壓

③調(diào)節(jié)氣液接觸時間④調(diào)節(jié)氣液接觸面積⑤改變培養(yǎng)液的性質(zhì)78對于好氣性微生物的深層發(fā)酵,除了需要通氣外,還需要攪拌。攪拌有利于熱交換、營養(yǎng)物質(zhì)與菌體均勻接觸,降低細(xì)胞周圍的代謝產(chǎn)物,從而有利于新陳代謝。同時可打破空氣氣泡,從而提高溶氧量,增加空氣利用。但攪拌速度主要因菌體大小而異,由于攪拌產(chǎn)生剪切力,易使細(xì)胞受損。同時攪拌也帶來一定機(jī)械熱,易使發(fā)酵液溫度發(fā)生變化。攪拌速度還與發(fā)酵液黏度有關(guān)。4、攪拌的影響795、泡沫的影響消泡措施:一般除了機(jī)械消泡外,還可利用消泡劑。理想的消泡劑,其表面相互作用力應(yīng)低,而且應(yīng)難溶于水,還不能影響氧的傳遞速率和微生物的正常代謝。消泡劑主要是一些天然的礦物油類、醇類、脂肪酸類、胺類、酰胺類、醚類、硫酸酯類、金屬皂類、聚硅氧烷和聚硅酮,其中以聚甲基硅氧烷最好。我國常用聚氧丙烯甘油醚或泡敵(聚環(huán)氧丙環(huán)氧乙烷甘油醚)。80四、提高酶產(chǎn)量的措施1、添加誘導(dǎo)物誘導(dǎo)物一般可以分為3類:酶的作用底物,酶的催化反應(yīng)產(chǎn)物和作用底物的類似物。2、控制阻遏物的濃度阻遏作用根據(jù)其作用機(jī)理的不同,可以分為產(chǎn)物阻遏和分解代謝物阻遏兩種。81控制阻遏物的濃度是解除阻遏、提高酶產(chǎn)量的有效措施?!舴纸獯x物阻遏作用:控制培養(yǎng)基中葡萄糖等容易利用的碳源的濃度,或采用其他較難利用的碳源,如淀粉等,或者采用補(bǔ)料、分次流加碳源等方法,控制碳源的濃度在較低的水平。此外,在分解代謝物阻遏存在的情況下,添加一定量的環(huán)腺苷酸(cAMP),可以解除或減少分解代謝物阻遏作用?!裟┒水a(chǎn)物阻遏的酶,可以通過控制末端產(chǎn)物的濃度的方法使阻遏解除。823、添加表面活性劑表面活性劑可以與細(xì)胞膜相互作用,增加細(xì)胞的透過性,有利于胞外酶的分泌,從而提高酶的產(chǎn)量。表面活性劑離子型和非離子型兩大類。其中,離子型表面活性劑又可以分為陽離子型、陰離子型和兩性離子型3種?!魧⑦m量的非離子型表面活性劑,如吐溫(Tween)、特里頓(Triton)等添加到培養(yǎng)基中,可以加速胞外酶的分泌,而使酶的產(chǎn)量增加?!粲捎陔x子型表面活性劑對細(xì)胞有毒害作用,尤其是季胺型表面活性劑(如‘新潔而滅’等)是消毒劑,對細(xì)胞的毒性較大,不能在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中添加到培養(yǎng)基中。834、添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑產(chǎn)酶促進(jìn)劑是指可以促進(jìn)產(chǎn)酶、但是作用機(jī)理未闡明清楚的物質(zhì)。在酶的發(fā)酵生產(chǎn)過程中,添加適宜的產(chǎn)酶促進(jìn)劑,往往可以顯著提高酶的產(chǎn)量。例如,添加一定量的植酸鈣鎂,可使霉菌蛋白酶或者桔青霉磷酸二酯酶的產(chǎn)量提高1~20倍;842.4酶生產(chǎn)過程的動力學(xué)1、酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長動力學(xué)2、酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶動力學(xué)3、酶生產(chǎn)過程中基質(zhì)消耗動力學(xué)85酶發(fā)酵動力學(xué)發(fā)酵動力學(xué)是研究發(fā)酵過程中細(xì)胞生長速率、產(chǎn)物生成速率、基質(zhì)消耗速率以及環(huán)境因素對這些速率的影響規(guī)律的學(xué)科。包括細(xì)胞生長動力學(xué)、產(chǎn)物生成動力學(xué)和基質(zhì)消耗動力學(xué)861、酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長動力學(xué)細(xì)胞在控制一定條件的培養(yǎng)基中生長的過程中,其生長速度受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的影響,變化比較復(fù)雜,情況各不相同。細(xì)胞生長動力學(xué)主要研究細(xì)胞生長速度以及外界環(huán)境因素對細(xì)胞生長速度影響的規(guī)律。KS

為莫諾德常數(shù),是指比生長速率達(dá)到最大比生長速率一半時的限制性基質(zhì)濃度。1950年,法國的莫諾德(Monod)首先提出了表述微生物細(xì)胞生長的動力學(xué)方程。他認(rèn)為,在培養(yǎng)過程中,細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度成正比:假設(shè)培養(yǎng)基中只有一種限制性基質(zhì),而不存在其他生長限制因素時,μ為這種限制性基質(zhì)濃度的函數(shù)。87莫諾德方程是基本的細(xì)胞生長動力學(xué)方程。在發(fā)酵過程優(yōu)化以及發(fā)酵過程控制方面具有重要的應(yīng)用價值。不少學(xué)者從不同的情況出發(fā)或運用不同的方法,對莫諾德方程進(jìn)行了修正,得出了適用于不同情況的各種動力學(xué)模型。連續(xù)培養(yǎng)時的方程變化形式連續(xù)全混流生物反應(yīng)器進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵的過程中,連續(xù)不斷流加培養(yǎng)液并連續(xù)排出相同體積的發(fā)酵液。在穩(wěn)態(tài)時,游離細(xì)胞連續(xù)發(fā)酵的生長動力學(xué)可以表達(dá)為:D為稀釋率,指單位時間內(nèi),流加的培養(yǎng)液的與發(fā)酵容器中發(fā)酵液體積之比,一般以/h為單位。882、產(chǎn)酶動力學(xué)產(chǎn)酶動力學(xué)主要研究細(xì)胞產(chǎn)酶速率以及各種環(huán)境因素對產(chǎn)酶速率的影響規(guī)律。產(chǎn)酶動力學(xué)的研究可以從整個發(fā)酵系統(tǒng)著眼,研究群體細(xì)胞的產(chǎn)酶速率及其影響因素,這稱為宏觀產(chǎn)酶動力學(xué)或這稱為非結(jié)構(gòu)動力學(xué)。也可以從細(xì)胞內(nèi)部著眼,研究細(xì)胞中酶合成速率及其影響因素,這謂之微觀產(chǎn)酶動力學(xué)或稱為結(jié)構(gòu)動力學(xué)。89(1)酶生物合成的模式細(xì)胞在一定條件下培養(yǎng)生長,其生長過程一般經(jīng)歷調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段90

根據(jù)酶的合成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系,可將酶的生物合成分為3種模式,即:

生長偶聯(lián)型

:同步合成型和中期合成型

部分生長偶聯(lián)型:延續(xù)合成型

非生長偶聯(lián)型:滯后合成型91同步合成型

酶的生物合成與細(xì)胞生長同步進(jìn)行的一種酶生物合成模式。該類型酶的生物合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系,又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型的酶,其生物合成伴隨著細(xì)胞的生長而開始;在細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時,酶大量生成;當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后,酶的合成隨著停止。大部分組成酶的生物合成屬于同步合成型,有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。例如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸的培養(yǎng)基中生長,在單寧或沒食子酸的誘導(dǎo)作用下,合成單寧酶(tanaseEC3.1.1.20)。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度活細(xì)胞濃度胞外酶濃度胞內(nèi)酶濃度92延續(xù)合成型

酶的生物合成在細(xì)胞的生長階段開始,在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后,酶還可以延續(xù)合成一段較長時間。屬于該類型的酶可以是組成酶,也可以是誘導(dǎo)酶。例如,在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng),可以誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase,EC3.2.1.15)的生物合成。細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳

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