蘭州大學(xué) 第4章 蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)

第四章蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)通論一、蛋白質(zhì)的化學(xué)組成和分類蛋白質(zhì)的元素組成：主要由C、H、O、N、S組成，其中含N平均為16%，這一數(shù)據(jù)可用于蛋白質(zhì)的含量測(cè)定，是凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)含量=蛋白氮/16%=蛋白氮×6.25蛋白質(zhì)按化學(xué)組成分類

單純蛋白質(zhì)：完全由氨基酸組成，不含非蛋白成分。根據(jù)溶解性的不同，可將簡(jiǎn)單蛋白分為7類：清蛋白（溶于水）球蛋白（溶于稀鹽溶液）谷蛋白（溶于稀酸或稀堿）醇溶蛋白（溶于70%-80%的乙醇）組蛋白（溶于水或稀酸，可用稀氨水沉淀）精蛋白（溶于水或稀酸，不溶于氨水）硬蛋白（只能溶于強(qiáng)酸）。

（二）綴合蛋白由蛋白質(zhì)和非蛋白成分組成，后者稱為輔基。根據(jù)輔基的不同，可將結(jié)合蛋白分為以下7類：核蛋白、脂蛋白、糖蛋白、磷蛋白、血紅素蛋白、黃素蛋白和金屬蛋白。（三）按蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能分類1．酶生物體內(nèi)的酶都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，沒(méi)有酶，生物體內(nèi)的各種化學(xué)反應(yīng)就無(wú)法正常進(jìn)行。2．調(diào)節(jié)蛋白某些激素、一切激素受體和許多其他調(diào)節(jié)因子都是蛋白質(zhì)。3．轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白脊椎動(dòng)物的血紅蛋白和無(wú)脊椎動(dòng)物的血藍(lán)蛋白起著運(yùn)輸氧氣的作用；血液中的載脂蛋白可運(yùn)輸脂肪，轉(zhuǎn)鐵蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)鐵；一些脂溶性激素的運(yùn)輸也需要蛋白，如甲狀腺素要與甲狀腺素結(jié)合球蛋白結(jié)合才能在血液中運(yùn)輸。4．貯存蛋白某些蛋白質(zhì)的作用是貯存氨基酸作為生物體的養(yǎng)料和胚胎或幼兒生長(zhǎng)發(fā)育的原料。此類蛋白質(zhì)包括蛋類中的卵清蛋白、奶類中的酪蛋白和小麥種子中的麥醇溶蛋白等。肝臟中的鐵蛋白可將血液中多余的鐵儲(chǔ)存起來(lái)，供缺鐵時(shí)使用。5．收縮和游動(dòng)蛋白肌肉中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白是運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)的必要成分，它們構(gòu)像的改變引起肌肉的收縮，帶動(dòng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)。細(xì)菌中的鞭毛蛋白有類似的作用，它的收縮引起鞭毛的擺動(dòng)，從而使細(xì)菌在水中游動(dòng)。6．結(jié)構(gòu)蛋白蛋白質(zhì)可以作為生物體的結(jié)構(gòu)成分。高等動(dòng)物的膠原蛋白是主要的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)蛋白，占蛋白總量的1/4；細(xì)胞膜、線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等膜系統(tǒng)都是由蛋白質(zhì)與脂類組成的；動(dòng)物的毛發(fā)和指甲都是由角蛋白構(gòu)成的。7.支架蛋白這一類蛋白質(zhì)主要起到支架作用，并且在這種蛋白上能完成某些蛋白的裝配。如錨定蛋白就屬于支架蛋白。8．保護(hù)和開(kāi)發(fā)蛋白高等動(dòng)物的免疫反應(yīng)是機(jī)體的一種防御機(jī)能，它主要也是通過(guò)蛋白質(zhì)（抗體）來(lái)實(shí)現(xiàn)的。凝血與纖溶系統(tǒng)的蛋白因子、溶菌酶、干擾素等，也擔(dān)負(fù)著防御和保護(hù)功能。某些生物能合成有毒的蛋白質(zhì)，用以攻擊或自衛(wèi)。白喉毒素可抑制真核生物的蛋白質(zhì)合成。9．異常蛋白除具有上述功能蛋白質(zhì)以外的一類蛋白質(zhì)。二、蛋白質(zhì)的形狀和大小按蛋白質(zhì)的形狀和溶解度可將蛋白質(zhì)分為：纖維狀蛋白質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)和膜蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量差別很大。三、蛋白質(zhì)構(gòu)像和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的

組織層次蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，可分為不同的結(jié)構(gòu)層次：一級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈的氨基酸序列。二級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助氫鍵形成的有規(guī)則的局部結(jié)構(gòu)，如α螺旋、β折疊等。三級(jí)結(jié)構(gòu)：多肽鏈借助各種非共價(jià)鍵彎曲折疊具有特定走向的緊密球狀構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)：指寡聚蛋白質(zhì)中個(gè)亞基之間在空間上的相互關(guān)系和結(jié)合方式。四、蛋白質(zhì)功能的多樣性

蛋白質(zhì)序列的多樣性(P160)決定了其功能的多樣性。如：20種蛋白質(zhì)形成的二十肽（每種氨基酸只用1次）可以形成的異構(gòu)體為：20！=2×1018。又如：相對(duì)分子質(zhì)量為34000的蛋白質(zhì)含12種氨基酸，假定在肽鏈的任一位置，12種氨基酸出現(xiàn)的概率相等，則34000/120=283，12283=10305。催化：大多數(shù)酶是蛋白質(zhì)。調(diào)節(jié)：如激素和反式作用因子。轉(zhuǎn)運(yùn)：如血紅蛋白、血清蛋白、載酯蛋白、膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等。貯存：如種子蛋白和卵清蛋白。運(yùn)動(dòng)：如肌肉、微管蛋白等。結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、膠原蛋白等。結(jié)構(gòu)成分：如角蛋白、膠原蛋白等。支架作用：如錨定蛋白、連接蛋白等。防御和進(jìn)攻：如抗體、毒蛋白等。異常功能：如甜蛋白、膠質(zhì)蛋白等。第二節(jié)肽一、肽和肽鍵的結(jié)構(gòu)肽鍵的C和N均為sp2雜化，有部分雙鍵的性質(zhì)，相關(guān)的6個(gè)原子處于共平面，稱作肽平面，肽平面內(nèi)兩個(gè)Cα多處于反式構(gòu)型。

二、肽的物理和化學(xué)性質(zhì)肽的等電點(diǎn)計(jì)算需先分別判斷各解離基團(tuán)的帶電荷情況，再統(tǒng)計(jì)凈電荷的量。肽的化學(xué)反應(yīng)與氨基酸類似，同時(shí)，由于肽鍵的存在，肽可以進(jìn)行雙縮脲反應(yīng)。三、天然存在的活性肽均為9肽，僅2個(gè)氨基酸有差別，生理功能差別極大。+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO-Met-腦啡肽+H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO-Leu-腦啡肽由細(xì)菌分泌的多肽，含有D-氨基酸和一些不常見(jiàn)氨基酸，如鳥(niǎo)氨酸（Ornithine，縮寫為Orn）第三節(jié)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定一、蛋白質(zhì)測(cè)序的策略

確定蛋白質(zhì)的純度在97%以上。測(cè)定多肽鏈的數(shù)目。拆分多肽鏈。分析每一條多肽鏈的氨基酸組成。鑒定多肽鏈的N—末端和C—末端氨基酸殘基。用兩種以上方法裂解多肽鏈成較小的肽段。測(cè)定各肽段的氨基酸序列。拼接各肽段成完整的多肽鏈。確定二硫鍵的位置。二、N-末端和C-末端氨基酸殘基的鑒定

（一）N-末端的測(cè)定二硝基氟苯(DNFB)法(Sanger法)：2，4-二硝基氟苯在堿性條件下，能夠與肽鏈N-端的游離氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。在酸性條件下水解，得到黃色DNP-氨基酸。該產(chǎn)物能夠用乙醚抽提分離。不同的DNP-氨基酸可以用色譜法進(jìn)行鑒定。

丹磺酰氯法：在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是丹磺酰-氨基酸有很強(qiáng)的熒光吸收，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1×10-9mol，比DNFB法靈敏100倍。異硫氰酸苯酯(PITC)法：N末端氨基酸生成相應(yīng)的PTH（苯乙內(nèi)酰硫脲）–AA，并脫離肽鏈，可連續(xù)測(cè)定N末端氨基酸，廣泛應(yīng)用于肽鏈的氨基酸序列測(cè)定。氨肽酶法：氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)水解肽鏈，釋放氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，可以確定蛋白質(zhì)的N-末端殘基。（二）C-末端的測(cè)定

還原法：C末端氨基酸可用硼氫化鋰還原生成相應(yīng)的α氨基醇。肽鏈水解后，再用層析法鑒定。

肼解法：多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，可斷裂所有的肽鍵，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的酰肼化合物。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離，C末端氨基酸可用紙層析鑒定。但精氨酸會(huì)變成鳥(niǎo)氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破壞。

羧肽酶法：將蛋白質(zhì)在pH8.0，30℃與羧肽酶一起保溫，按一定時(shí)間間隔取樣，用紙層析測(cè)定釋放出來(lái)的氨基酸，根據(jù)氨基酸的量與時(shí)間的關(guān)系，就可以知道C末端氨基酸的排列順序。目前常用的羧肽酶有四種：A，B，C和Y；A和B來(lái)自胰臟；C來(lái)自柑桔葉；Y來(lái)自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro，Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸殘基；B只能水解Arg和Lys為C-末端殘基的肽鍵。通常將二者混合使用。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，因而，除用來(lái)測(cè)定C末端氨基酸外，還可以用來(lái)測(cè)定氨基酸的排列順序。三、二硫橋的斷裂

四、氨基酸組成的分析

一般用酸水解，得到氨基酸混合物，再分離測(cè)定氨基酸。目前用氨基酸自動(dòng)分析儀，2－4小時(shí)即可完成。蛋白質(zhì)的氨基酸組成，一般用每分子蛋白質(zhì)中所含的氨基酸分子數(shù)表示。不同種類的蛋白質(zhì)，其氨基酸組成相差很大。五、多肽鏈的部分裂解和肽段混合物的分離純化可以用酶水解法或化學(xué)水解法將蛋白質(zhì)水解成肽段。肽段的分離純化可用層析法或電泳法。溴化氰斷裂法：羥胺斷裂法：斷裂Asn-Gly之間的肽鍵，但專一性不強(qiáng)，也可以斷裂Asn-Leu和Asn-Ala之間的鍵。六、肽段氨基酸序列的測(cè)定（一）Edman化學(xué)降解法

用此原理已制成蛋白質(zhì)序列分析儀。若每次循環(huán)的準(zhǔn)確度為99%，經(jīng)60次循環(huán)，準(zhǔn)確度為：0.9960=0.54。（二）降解法

可用氨肽酶和羧肽酶，只能測(cè)出末端的幾個(gè)氨基酸。羧肽酶Y可作用于任何氨基酸，有可能以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)出新的氨基酸的順序測(cè)定儀。（三）根據(jù)核苷酸序列推定法分離mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄測(cè)定cDNA的核苷酸序列，再用遺傳密碼推定氨基酸序列。（四）質(zhì)譜法可分析微量的肽鏈，短肽在第一臺(tái)質(zhì)譜儀中經(jīng)電噴射電離，按荷質(zhì)比分離，依次在經(jīng)碰撞池被裂解成離子碎片，在第二臺(tái)質(zhì)譜儀中測(cè)出各個(gè)離子碎片的譜線，推算出短肽的氨基酸序列。在蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用廣泛，但不能區(qū)分亮氨酸和異亮氨酸。七、肽段在多肽鏈中次序的決定肽段A法水解得到四個(gè)小肽：A1Ala-PheA2Gly-Lys-Asn-TyrA3Arg-TyrA4His-ValB法水解得到四個(gè)小肽：B1Ala-Phe-Gly-LysB2Asn-Tyr-ArgB3Tyr-His-Val重疊法：Ala-Phe-Gly-Lys－Asn-Tyr-Arg－Tyr-His-Val八、二硫橋位置的確定用對(duì)角線電泳法：九、蛋白質(zhì)測(cè)序舉例（胰島素的序列測(cè)定）十、蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)歐洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的SWISS-PROT有10多萬(wàn)條肽鏈的信息。美國(guó)國(guó)家生物醫(yī)學(xué)基金會(huì)主持的PIR有近30萬(wàn)條肽鏈的信息，但多數(shù)由核酸信息翻譯而來(lái)，有些未經(jīng)嚴(yán)格檢驗(yàn)。美國(guó)政府支持的GenBank和歐洲的EMBL有大量的基因序列信息，從其閱讀框可以得到蛋白質(zhì)序列的不少信息。第四節(jié)蛋白質(zhì)的氨基酸序列

與生物功能一、同源蛋白質(zhì)的物種差異與生物進(jìn)化細(xì)胞色素C的物種差異。二、同源蛋白質(zhì)具有共同的進(jìn)化起源血紅素蛋白與肌紅蛋白絲氨酸蛋白酶類:顯示明顯的序列同源性。一些功能差異很大的蛋白質(zhì):如溶菌酶和α-乳清蛋白功能差異很大，但有序列同源性。蛋白質(zhì)家族的形成可能有趨同進(jìn)化和趨異進(jìn)化兩種機(jī)制。三、血液凝固與氨基酸序列的局