生物分離技術(shù)11 超聲微波包涵體

超聲波輔助技術(shù)超聲波原理人耳的聽覺范圍大約在20~18000Hz，高于這個(gè)頻率范圍的聲音聽不見，稱為超聲。聲波通過在介質(zhì)中壓縮、膨脹來實(shí)現(xiàn)傳播。超聲波是一種能量傳播方式超聲波的特點(diǎn)1.比通常的聲波頻率高很多，波長短很多。2.同光波相似，具有反射，折射，散射，聚焦等幾何光學(xué)定律。3.比普通聲波強(qiáng)大的多的功率。4.介質(zhì)對(duì)超聲波的吸收比對(duì)聲波大的多，因此其傳播距離短的多。5.對(duì)介質(zhì)可產(chǎn)生顯著的聲壓作用。超聲效應(yīng)1.機(jī)械效應(yīng)：由于超聲的傳播引起介質(zhì)的壓縮和拉伸，造成介質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，由于頻率很高，故振動(dòng)加速度很大，其運(yùn)動(dòng)加速度可達(dá)到重力加速度的數(shù)萬倍，形成強(qiáng)烈的機(jī)械運(yùn)動(dòng)效應(yīng)，甚至可以斷裂粉碎物質(zhì)。2.聲流效應(yīng)當(dāng)超聲波射入兩個(gè)具有不同聲阻的介質(zhì)界面時(shí)，動(dòng)量發(fā)生變化，產(chǎn)生輻射壓力，引起撕裂，可對(duì)生物組織造成損傷。3.熱效應(yīng)超聲波頻率高，能量大，被介質(zhì)吸收時(shí)能產(chǎn)生顯著的熱效應(yīng)。4.空化效應(yīng)

超聲傳播于液體介質(zhì)中時(shí)，由于劇烈的膨脹和壓縮，導(dǎo)致液體內(nèi)部的小氣泡，以及局部產(chǎn)生超過液體分子間作用力的小氣泡，在聲壓的作用下，氣泡不斷運(yùn)動(dòng)迅速長大，而后突然破裂閉合，破滅時(shí)周圍液體突然沖入氣泡產(chǎn)生高溫、高壓，同時(shí)產(chǎn)生激波。局部瞬時(shí)溫度可達(dá)200度以上，上千個(gè)大氣壓。

微小空間內(nèi)的高溫高壓，機(jī)械剪切力，以及由于高溫高壓使周圍的液體超臨界化，因而使得溶解、傳質(zhì)和反應(yīng)速度大大加快?？栈浅晳?yīng)用中最重要的一種效應(yīng)，具有如下特點(diǎn)：

1.波長越大，空化越明顯

2.溫度高，易于空化

3.液體中含氣量高有助于空化

4.超聲波頻率增高，外界氣壓增大，黏度大，空化減弱超聲波的綜合效應(yīng)可以充分打碎細(xì)胞，攪拌，促進(jìn)分子運(yùn)動(dòng)，幫助目標(biāo)分子充分與溶劑混合，加速擴(kuò)散，乳化等，幫助萃取的進(jìn)行。選擇合適的聲波參數(shù)，使萃取液達(dá)到最大空化狀態(tài)，有助于超聲提取的分離效果。超聲波具有如此殺傷力，為什么可以用于醫(yī)學(xué)檢測(cè)？超聲波的應(yīng)用超聲萃取用于從動(dòng)植物中提取藥物或其他成分獲得非常好的效果，可以實(shí)現(xiàn)很好的細(xì)胞破碎效果和萃取效率，尤其是在天然植物藥用成分的萃取生產(chǎn)方面很有優(yōu)勢(shì)。超聲萃取具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.提取時(shí)間縮短，能耗低，提取效率高2.萃取溫度低，不會(huì)破壞具有熱不穩(wěn)定、易水解或氧化特性的有效成分3.常壓操作，工藝簡易安全，設(shè)備投資低4.適用范圍廣，與溶劑和目標(biāo)物質(zhì)的性質(zhì)沒有關(guān)系。超聲懸浮利用駐波在聲場中的輻射壓力與固體液體微?；蛏锛?xì)胞的重力相平衡，而使其穩(wěn)定懸浮在聲場中的技術(shù)。超聲凝聚當(dāng)超聲通過有懸浮顆粒的流體介質(zhì)時(shí)，會(huì)帶動(dòng)懸浮顆粒一起振動(dòng)，而大小不同的粒子的振動(dòng)相位和振幅各不相同，從而使顆?；ハ嗑奂瘡亩?。例如用于酒類，飲料，醬油等的澄清，常規(guī)靜置法需要4~10天，使用超聲法處理醬油只需1~2分鐘，對(duì)葡萄酒用超聲只需處理1~2h即可完全沉淀。超聲過濾超聲駐波過濾：1、節(jié)點(diǎn)分離2、促使凝聚。3、使不溶物質(zhì)懸浮，從而給溶解成分留出通道。超聲蒸發(fā)超聲蒸發(fā)為熱敏性物料的蒸發(fā)濃縮提供了理想途徑。利用超聲的作用，使液體霧化，使液體的蒸發(fā)面積大大增加，揮發(fā)速度也大大增加，使物料在較短時(shí)間和較低溫度下快速除去水分。超聲干燥具有增加物料內(nèi)部水分?jǐn)U散，加快水分遷移，使物料產(chǎn)生自熱，降低水分粘性，產(chǎn)生氣泡，驅(qū)使水分從毛細(xì)管中排出。相比常規(guī)干燥方法，具有干燥速度快，溫度低，干燥程度高，對(duì)產(chǎn)品的破壞小等優(yōu)點(diǎn)超聲乳化和破乳利用超聲能量和空化作用，可將水珠打散并均勻分布在油中，可以減少或不使用乳化劑，就能生成穩(wěn)定的乳化油，形成的乳液平均尺寸小，濃度高，可以控制乳液的類型。而使用混合聲強(qiáng)超聲可使乳化液破乳，實(shí)現(xiàn)油，水，固體的分離。超聲降解由于超聲的造成的極高運(yùn)動(dòng)速度，產(chǎn)生激烈的機(jī)械振動(dòng)，分子在介質(zhì)中隨著波的高速振動(dòng)及剪切力降解。超聲形成高溫高壓的微環(huán)境，引起自由基的增加，促進(jìn)氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。用于水體的有機(jī)污染的處理等領(lǐng)域，具有簡單，快速，高效，無污染等優(yōu)點(diǎn)

超聲脫附用于其他分離技術(shù)的吸附分離單元的輔助解吸。超聲結(jié)晶超聲可以代替常規(guī)晶種，加快結(jié)晶，提高結(jié)晶產(chǎn)品性能，有效改善晶體產(chǎn)品的后處理過程。超聲殺菌超聲波分離應(yīng)用展望超聲波分離時(shí)間較短，過程效果增強(qiáng)，在分離提取方面具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值，目前多數(shù)超聲分離技術(shù)仍僅限于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，其主要原因是其工程放大的問題。微波輔助分離技術(shù)微波輔助分離技術(shù)微波是一種電磁波，以直線方式傳播，并具有反射、折射、衍射等光學(xué)特性。微波遇到金屬物質(zhì)會(huì)被反射，但遇到非金屬物質(zhì)則能穿透或被吸收。微波的電場頻率介于300MHz~300GHz之間。微波原理微波是一種電磁輻射，被輻射物質(zhì)的極性分子在微波電磁場中可快速轉(zhuǎn)向并定向排列，產(chǎn)生的撕裂和相互摩擦將引起物質(zhì)發(fā)熱，即將電能轉(zhuǎn)化為熱能，從而產(chǎn)生強(qiáng)烈的熱效應(yīng)。因此，微波加熱過程實(shí)質(zhì)上是介質(zhì)分子獲得微波能并轉(zhuǎn)化為熱能的過程。微波的加熱方式的特點(diǎn)微波加熱的整體快速：微波萃取主要是利用微波強(qiáng)烈的熱效應(yīng)，但微波加熱方式不同于傳統(tǒng)的加熱方式，是同時(shí)直接作用于內(nèi)部和外部的介質(zhì)分子，使整個(gè)物料被同時(shí)加熱，即為“體加熱”過程，從而可克服傳統(tǒng)的傳導(dǎo)式加熱方式所存在的溫度上升較慢的缺陷。微波加熱的選擇性：體系的極性越大，對(duì)微波的吸收越大，極性小溶劑吸收微波能力也較弱，所以加熱效應(yīng)也相對(duì)較差，若樣品和溶劑均不吸收微波,則微波加熱過程無法進(jìn)行。微波輔助萃取原理：在微波萃取過程中，微波能迅速轉(zhuǎn)化為熱能而使細(xì)胞內(nèi)部的溫度快速上升。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)部的壓力超過細(xì)胞的承受能力時(shí)，細(xì)胞就會(huì)破裂，有效成分即從胞內(nèi)流出，并在較低的溫度下溶解于萃取介質(zhì)，獲得被萃取組分。微波萃取的特點(diǎn)1.快速高效2.加熱均勻3.加熱具有選擇性4.不具有熱慣性，易于控制5.試劑用量少，節(jié)能，污染小微波萃取的選擇性利用吸收微波能力的差異可使原料物質(zhì)的某些區(qū)域或萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使被萃取物質(zhì)從基體中分離出來，進(jìn)入到介電常數(shù)較小、微波吸收能力相對(duì)較差的萃取劑中。從原理上說，傳統(tǒng)的溶劑提取法，如浸漬法、滲漉法、回流提取法、連續(xù)回流提取法等，均可加入微波進(jìn)行輔助提取，從而成為高效提取方法。微波萃取的局限性1.對(duì)于熱敏性物質(zhì)，微波加熱可能使其變性或失活。

2.微波萃取要求材料具有一定的吸水性，否則細(xì)胞難以吸收足夠的微波能而將自身擊破，產(chǎn)物也就難以釋放出來。

3.微波萃取過程中細(xì)胞因受熱而破裂，一些不希望得到的組分也會(huì)溶解于溶劑中，從而使微波萃取的選擇性降低。

微波萃取的主要影響因素

1.破碎度：被提取物經(jīng)過適當(dāng)破碎，可以增大接觸面積,有利于萃取過程的進(jìn)行。

2.分子極性：在微波場中，極性分子受微波的作用較強(qiáng)3.溶劑：在微波萃取中，一次提取所需的溶劑用量可減少30%～60%。溶劑用量較大反而不利于提取，因?yàn)槲⒉ㄔ诖┩溉軇┑倪^程中會(huì)發(fā)生衰減，溶劑越多，使得到達(dá)基體物質(zhì)的微波能越少，提取效果就越差。

提取物料中若含不穩(wěn)定或揮發(fā)性成分，則宜選用對(duì)微波高度透明的溶劑如正己烷等作為提取介質(zhì)。將材料浸沒于溶劑中，在微波場的作用下，材料中的揮發(fā)性成分因顯著自熱而急速氣化，沖破組織，從材料中逸出。此時(shí)，包圍于藥材周圍的溶劑因沒有自熱，可捕獲、冷卻并溶解逸出的揮發(fā)性成分。

用水作溶劑時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外同時(shí)加熱，破壁的效果不會(huì)太理想，且大部分微波被溶劑所消耗，此時(shí)可先用微波處理經(jīng)浸潤后的干材料，然后再加水或有機(jī)溶劑來提取有效成分，這樣既可節(jié)省能源，又可簡化微波提取裝置。4.溫度與時(shí)間微波提取有可能導(dǎo)致體系的溫度過度上升，為減小高溫的影響，可將微波提取過程分次進(jìn)行，即先進(jìn)行一段時(shí)間的微波提取，然后將體系的溫度冷卻至室溫再進(jìn)行第二次微波提取，從而可最大限度地降低被提取成分因受熱而發(fā)生破壞的危險(xiǎn)。微波萃取的安全性問題1.微波輻射的防護(hù)2.有機(jī)溶劑的易燃性微波萃取制備系統(tǒng)1.封閉式2.敞開式3.連續(xù)流動(dòng)式

1、封閉式（高壓式）

常用于一些猛烈條件下的萃取，反應(yīng)溫度可高于100度。萃取時(shí)間短，萃取效率高，試劑消耗少需要注意安全問題，特別是在使用揮發(fā)性溶劑的情況下，必須有高能排風(fēng)體系和壓力安全裝置，并在開啟容器前冷卻到室溫。

2敞開容器系統(tǒng)系統(tǒng)內(nèi)有冷卻裝置，在大氣壓下工作相對(duì)更加安全，處理量更大。1.微波爐2.瓶架

3.蒸餾瓶4.攪拌器5.銅管6.冷凝管7.開關(guān)8.控制面板3.連續(xù)流動(dòng)式

萃取溶劑連續(xù)流動(dòng)而樣品隨之流動(dòng)或固定不動(dòng)的一種微波萃取體系，可以與檢測(cè)儀器相偶聯(lián)，進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)?；蚬こ叹亟M蛋白原核生物與真核生物基因表達(dá)有什么區(qū)別？用原核微生物表達(dá)真核基因會(huì)如何？蛋白包涵體什么是包涵體重組基因工程菌生產(chǎn)蛋白質(zhì)，其表達(dá)形式可以是分泌表達(dá)、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、胞內(nèi)不溶性表達(dá)。由外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的不溶性蛋白聚合體稱為包涵體。包涵體一般含有50%以上的重組蛋白，其余還含有核糖體元件、RNA聚合酶、內(nèi)毒素、外膜蛋白，質(zhì)粒DNA，以及脂體、脂多糖等，大小為0.5-1um，具有很高的密度（約1.3mg/ml），無定形，呈非水溶性，只溶于變性劑如尿素、鹽酸胍等。E.coli是常用的基因工程宿主菌，包涵體常見于大腸桿菌中，但其他菌種也可以形成包涵體。當(dāng)重組蛋白以包涵體形式存在時(shí)，就需要對(duì)包涵體進(jìn)行變性復(fù)性處理。對(duì)包涵體的變性復(fù)性是重組蛋白藥物生產(chǎn)中最關(guān)鍵的技術(shù)之一。包涵體的特點(diǎn)1.是由宿主菌表達(dá)的外源基因的蛋白產(chǎn)物。2.包涵體密度高、折光性強(qiáng)，形態(tài)容易觀察到。3.具有不溶性，可通過離心將其和其他可溶性蛋白分離4.不易受蛋白酶影響5.無生物活性6.具有普遍性，很多在E.coli中表達(dá)的真核基因產(chǎn)物都以包涵體形式存在。包涵體形成的機(jī)制

包涵體形成的根本原因是基因的高水平表達(dá)。即使是內(nèi)源性蛋白，表達(dá)過量時(shí)也會(huì)形成包涵體?；钚缘鞍椎暮铣砂?，肽鏈的合成，蛋白的折疊，蛋白的聚集。如果新生肽鏈的速率超過蛋白正確折疊的速率，就會(huì)導(dǎo)致包涵體的形成。包涵體形成的機(jī)制

包涵體是由部分折疊的中間體之間的錯(cuò)誤聚合而發(fā)生聚集形成的，即不是由完全舒展的肽鏈或成熟的蛋白質(zhì)聚集成的。

UINU：解鏈態(tài)，I：折疊中間體，N：天然態(tài)蛋白聚集物主要作用是重組蛋白之間的疏水作用，二硫鍵的錯(cuò)配也有影響。影響包涵體形成的因素1、表達(dá)量過高，在低表達(dá)時(shí)很少形成包涵體，表達(dá)量越高越容易形成包涵體。合成速度太快，以至于沒有足夠的時(shí)間進(jìn)行折疊，二硫鍵不能正確的配對(duì)，過多的蛋白間的非特異性結(jié)合等。2、重組蛋白的氨基酸組成：一般含硫氨基酸越多越易形成包涵體，脯氨酸，天冬氨酸，甘氨酸的含量與包涵體的形成呈正相關(guān)。

3、重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內(nèi)pH接近蛋白的等電點(diǎn)時(shí)容易形成包涵體。4、重組蛋白是異源蛋白，由于缺乏真核生物中翻譯后修飾所需酶類，如分子伴侶蛋白(分子自組裝與蛋白折疊)，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。包涵體的利與弊優(yōu)點(diǎn)：1.具有高密度，不溶性，易于分離純化。2.抗蛋白酶消化，穩(wěn)定不易被降解。3.包涵體無活性，對(duì)于生產(chǎn)對(duì)宿主菌有毒害作用的蛋白產(chǎn)品時(shí)十分有利。4.降低了胞內(nèi)外源蛋白的濃度，有利于表達(dá)量的提高。

5.對(duì)機(jī)械攪拌和超聲破碎不敏感，易于破壁，與細(xì)胞膜碎片分離。缺點(diǎn)：1.包涵體需經(jīng)過變性復(fù)性處理，過程中常常伴有蛋白的水解和沉淀，形成異構(gòu)體，引起蛋白質(zhì)的不可逆修飾及性質(zhì)改變。導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量降低2.要加入各種變性劑，復(fù)性試劑，表面活性劑等試劑，操作繁瑣，成本昂貴。包涵體的純化與復(fù)性目的與思路：1.使原本緊密聚集的蛋白包涵體分散開成蛋白單體。2.使分散開的蛋白單體重新正確折疊為具有生物活性的蛋白質(zhì)。包涵體的純化與復(fù)性步驟：1.包涵體的提取基因工程菌發(fā)酵液，經(jīng)離心濃縮后破壁，然后以5000-20000g15min離心，可使大多數(shù)包涵體沉淀，與可溶性蛋白分離。2.洗滌為了除去包涵體上粘附的雜質(zhì)，如膜蛋白或核酸，應(yīng)用洗滌液洗滌包涵體，通常用低濃度的變性劑,如尿素和鹽酸胍，過高濃度的尿素或鹽酸胍會(huì)使包涵體溶解，此外還可以用溫和去垢劑TritonX-100洗滌去除膜碎片和膜蛋白。3.溶解變性劑：一般用強(qiáng)變性劑如尿素（6-8M）、鹽酸胍（GdnHCl6M），打斷包涵體蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的各種化學(xué)鍵，使多肽伸展，鹽酸胍是較尿素強(qiáng)的變性劑，能使尿素不能溶解的包涵體溶解，而且尿素分解的異氰酸鹽能導(dǎo)致多肽鏈的自由氨基甲?；?，特別是在堿性pH值下長期保溫時(shí)。去垢劑：如SDS、正十六烷基三甲基銨氯化物等，可以破壞蛋白內(nèi)的疏水鍵，可以增溶幾乎所有的蛋白。但是由于SDS較難徹底的去除而限制了其使用。極端pH：可以破壞蛋白的次級(jí)鍵從而增溶蛋白。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。這些方法只適合于少部分蛋白的增溶。

還原劑：如果蛋白間存在二硫鍵，在溶解時(shí)還應(yīng)使用還原劑。還原劑一般是DTT，對(duì)于沒有二硫鍵的某些包涵體，有時(shí)還原劑的使用也是有用的，可能是由于含二硫鍵的雜蛋白影響了包涵體的溶解。

4.純化包涵體溶解后進(jìn)行純化有助于提高復(fù)性率，純化的方法主要有膜過濾，電泳，色譜等。5.重組蛋白質(zhì)的復(fù)性使散開的蛋白肽鏈重新折疊成正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)其生理活性。通過緩慢去除變性劑使目標(biāo)蛋白從變性的伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)，同時(shí)去除還原劑使二硫鍵重新正常形成。變性蛋白過渡態(tài)蛋白天然態(tài)蛋白影響復(fù)性效率的因素蛋白質(zhì)的復(fù)性濃度：正確折疊的蛋白質(zhì)的得率低通常是由于多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質(zhì)的濃度是使蛋白質(zhì)聚集的重要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復(fù)性液中過快，容易形成絮狀沉淀，可能是蛋白重新凝聚的緣故。pH：復(fù)性緩沖液的pH值應(yīng)在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質(zhì)子化作用影響正確配對(duì)的二硫鍵的形成，過高或過低會(huì)降低復(fù)性效率，最適宜的復(fù)性pH值一般是8.0-