與氮素同化相關(guān)酶及測(cè)定方法

與氮素同化相關(guān)酶及測(cè)定方法

自然界中N素循環(huán)一、植物體內(nèi)氮的含量與分布

含量：占植物干重的0.3～5％。

植物種類：豆科植物>非豆科植物

品種：高產(chǎn)品種>低產(chǎn)品種

器官：種子>葉>根>莖稈二、氮的生理功能氮是蛋白質(zhì)的重要成分（蛋白質(zhì)含氮16～18％）2.氮是核酸和核蛋白的成分（核酸中的氮約占植株全氮的7％）3.氮是酶的成分4.氮是葉綠素（葉綠素a:C55H72O5N4Mg)的成分（葉綠體含蛋白質(zhì)45～60％）5.氮是多種維生素的成分:如維生素B1(C12H17ON3S)、B2(C17H18O6N4)、B6(C6H11O3N)

6.氮是一些植物激素的成分（如IAA、CTK）7.氮也是生物堿的組分（如煙堿、茶堿、可可堿、咖啡堿、膽堿－－卵磷脂(磷脂酰膽堿）氮素通常被稱為生命元素三、植物對(duì)氮的吸收(adsorption)與同化

(assimilation)吸收的形態(tài)無(wú)機(jī)態(tài)：NO3-－N、NH4+－N （主要）有機(jī)態(tài)：NH2－N、氨基酸、 核酸等 （少量）

植物從外界環(huán)境獲得N主要是通過(guò)3條途徑,通過(guò)NO3-還原把無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為生命體可用的有機(jī)氮,通過(guò)固氮菌對(duì)N2的固定,直接吸收土壤中的銨或有機(jī)氮。

植物的氮源主要是銨鹽和硝酸鹽，占土壤含氮的1%-2%。（一）植物對(duì)硝態(tài)氮的吸收與同化1.吸收：旱地作物吸收NO3-－N為主，主動(dòng)吸收

2.同化(1)NO3-－N的還原作用(nitratereduction)過(guò)程：NO3-NO2-NH3

NR：硝酸還原酶(nitratereductase)

NiR：亞硝酸還原酶(nitritereductase)

NR，MoNiR，F(xiàn)e、Mn

根、葉細(xì)胞質(zhì)根、葉綠體

氨的同化植物吸收銨鹽以后，或當(dāng)植物所吸收的硝酸鹽被還原成氨后，氨必須立即被同化成氨基酸，否則就會(huì)毒害植物。因?yàn)榘笨赡芤种坪粑^(guò)程中的電子傳遞系統(tǒng)。氨的同化方式為：進(jìn)入谷氨酸合成酶循環(huán)。作用酶類：GOGAT:谷氨酸合成酶；存在于葉綠體。GS:谷氨酰胺合成酶；存在于葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。GDH:谷氨酸脫氫酶；存在于線粒體中。過(guò)程（1）GDH（谷氨酸脫氫酶）途徑酮戊二酸氨谷氨酸各種新的氨基酸酮酸酰胺氨谷氨酸脫氫酶轉(zhuǎn)氨基作用（2）GS-GOGAT途徑（谷氨酰胺合成酶－谷氨酸合成酶）是高等植物同化氨的主要途徑谷氨酰胺

合成酶COOH│CHNH2│CH2│CH2│CONH2COOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸合成酶2H+，2e—COOH│C=O│CH2│CH2│COOHCOOH│CHNH2│CH2│CH2│COOH谷氨酸脫氫酶NH4+吸收NO3—還原N2固定光呼吸NH3NH3NADH谷氨酰胺谷氨酸谷氨酸圖1

氨的同化途徑的模式ATPNADH鐵氧還蛋白

轉(zhuǎn)氨基作用含氮化合物反應(yīng)式：NH3＋谷氨酸＋ATP谷氨酰胺＋ADP＋Pi谷氨酰胺＋α-酮戊二酸＋2e－＋2H＋

2谷氨酸谷氨酸＋17酮酸17種氨基酸

蛋白質(zhì)

谷氨酰胺合成酶谷氨酸合成酶轉(zhuǎn)氨酶合成

轉(zhuǎn)氨基作用（transamination）

（1）定義：是指一種α-氨基酸和α-酮酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成相應(yīng)的α-酮酸和新的氨基酸的過(guò)程。（2）生物體內(nèi)兩種重要的轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨基作用谷草轉(zhuǎn)氨基作用谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）磷酸吡哆醛++①谷丙轉(zhuǎn)氨基作用②谷草轉(zhuǎn)氨基作用+谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）磷酸吡哆醛+3.酰胺(amide)的形成及意義形成：NH3＋意義：①貯存氨基； ②解除氨毒； ③參與代謝。

谷氨酸(Glu) 酰胺合成酶 谷氨酰胺(Gln)

天門冬氨酸(Asp)ATP天門冬酰胺(Asn)

銨態(tài)氮配方②非脲酶途徑：直接同化尿素氨甲酰磷酸瓜氨酸精氨酸（二）植物對(duì)有機(jī)氮的吸收與同化1.尿素urea（酰胺態(tài)氮amidenitrogen）

(1)吸收：根、葉均能直接吸收(2)同化：①脲酶途徑：尿素NH3氨基酸

脲酶水解尿素的毒害：當(dāng)介質(zhì)中尿素濃度過(guò)高時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)受害癥狀2.氨基態(tài)氮(aminonitrogen)

可直接吸收，效果因種類而異第一類效果>硫酸銨：如甘氨酸、天門冬酰胺等第二類，尿素<AA效果<硫酸銨：如天門冬氨酸等第三類，效果<尿素：如脯氨酸、纈氨酸等第四類，有抑制作用：如蛋氨酸植物轉(zhuǎn)氨酶(GOT和GPT)活度比色測(cè)定方法及其應(yīng)及GOGAT酶活性的測(cè)定主要試劑(1)0.05mol/LTris-HCL緩沖液(pH7.2):0.2mol/L三羥甲基氨基甲烷(24.2g三羥甲基氨基甲烷用蒸餾水溶解并定容至200ml)50ml和0.2mol/LHCl44.2ml,用蒸餾水稀釋至200ml。(2)0.1mol/L磷酸鹽緩沖液:稱取磷酸氫二鈉(AR)11.928g,磷酸二氫鉀(AR)2.176g,加少量蒸餾水溶解并定容至1000ml。(3)2,4-二硝基苯肼溶液:稱取2,4-二硝基苯肼19.8mg,用10mol/LHCL10ml溶解后,加蒸餾水至100ml,保存于棕色瓶中備用,此液可保存3個(gè)月。(4)0.4mol/L氫氧化鈉溶液:16g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(5)1mol/L氫氧化鈉溶液:40g氫氧化鈉(AR)加蒸餾水溶解并定容至1000ml。(6)丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液(2μmol/ml):精確稱取純丙酮酸鈉22.0mg于100ml容量瓶中,加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至刻度。此液應(yīng)新鮮配制。(7)GOT底物液(DL-門冬氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):稱取α-酮戊二酸29.2mg和DL-門冬氨酸2.66g置于一小燒杯中,加入1mol/L氫氧化鈉20.5ml使溶解,并校正pH至7.4,然后將溶液移入100ml容量瓶?jī)?nèi),用0.1mol/L磷酸鹽緩沖液定容至刻度。放置冰箱內(nèi)保存。(8)GPT底物液:(DL-丙氨酸200mmol/L,α-酮戊二酸2mmol/L):稱取α-酮戊二酸29.2mg和DL-丙氨酸1.79g置于一小燒杯中,加入0.1mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)約80ml煮沸溶解后,待冷,用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至7.4(約加0.5ml),再加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液至100ml混勻,加氯仿數(shù)滴防腐,貯于冰箱內(nèi)。1·酶粗制劑的提取將新鮮植物材料剪碎,取鮮重0.2g左右放入研缽,加0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.2)2.0ml,在冰浴中研磨,得到的勻漿用高速離心機(jī)20000×g離心20min,上清液供測(cè)酶活度用。2·谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)活度測(cè)定取10ml試管2支,一支作測(cè)定管,分別加酶粗制劑0.1ml和GOT底物液0.5ml,另一支作對(duì)照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時(shí)置37℃水浴,60min后取出,各管加2,4二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對(duì)照管再加GOT底物液0.5ml。將二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混勻,10min后用分光光度計(jì)比色,波長(zhǎng)500nm,蒸餾水調(diào)零點(diǎn),讀取吸光度。將測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml)。若查得的丙酮酸體積超過(guò)0.2ml時(shí)應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制:取10ml試管5支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GOT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對(duì)照管)、0.05、0.10、0.15、0.20ml。置37℃水浴5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對(duì)照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。3·谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活度測(cè)定取10ml試管2支,一支作測(cè)定管,分別加酶粗制劑0.1ml和GPT底物液0.5ml,另一支作對(duì)照管,僅加酶粗制劑0.1ml。將二管同時(shí)置37℃水浴,30min后取出,各管加2,4-二硝基苯肼液0.5ml終止反應(yīng),對(duì)照管再加GPT底物液0.5ml。將二管再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/LNaOH5.0ml,混勻,10min后用分光光度計(jì)比色,波長(zhǎng)500nm,蒸餾水調(diào)零點(diǎn),讀取吸光度。將測(cè)定管吸光度減去對(duì)照管吸光度,得吸光度差值,查工作曲線即可查得丙酮酸體積(ml),若查得的丙酮酸體積超過(guò)0.2ml時(shí)應(yīng)將酶粗制液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即得丙酮酸體積V(ml)。工作曲線繪制:取10ml試管6支,各管加0.1mol/L磷酸鹽緩沖液0.1ml,分別加GPT底物液0.5、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25ml,丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液0(對(duì)照管)、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25ml。置37℃水浴中5min,各管加2,4-二硝基苯肼溶液0.5ml,混勻,再置37℃水浴中20min,取出后各管加0.4mol/L氫氧化鈉溶液5ml,混勻,10min后同上比色,讀取各管吸光度。各管吸光度分別減去對(duì)照管吸光度,以各管丙酮酸體積為橫座標(biāo),以相應(yīng)的吸光度差值為縱座標(biāo)繪制工作曲線。(四)結(jié)果計(jì)算轉(zhuǎn)氨酶活度以每克植物鮮樣在30min內(nèi)反應(yīng)生成的丙酮酸微摩爾(μmol)表示。GOT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)GPT活度,μmol/g·30min=(C×V×20)/(m×2)式中,C—丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(μmol/ml);V—由工作曲線查得的丙酮酸體積(ml);20—稀釋倍數(shù);2—反應(yīng)時(shí)間換算系數(shù),GOT實(shí)際反應(yīng)時(shí)間為1h,按習(xí)慣本法酶活性以30min計(jì)算〔4〕,故應(yīng)除以2;m—植物鮮重(g)粗酶液制備取1g水稻根/葉，置于冰浴的研缽中，加入少量石英砂和3ml提取緩沖液（100mmol/LTris-HCl(pH7.6)含1.0mmol/LEDTA，1.0mmol/LMgCl2·6H2O，10mmol/Lβ-琉基乙醇）于4℃研磨成勻漿。混合均勻后于高速冷凍離心機(jī)4℃、20,000g離心20min（13，000g30min），收集上清，即為粗酶提取液，置于-80℃冰箱中凍存，待測(cè)。粗酶液用于Gs、NADH-GOGATH的活力測(cè)定。提取液配置：（Tris，121.14；EDTA，372.24；MgCl2·6H2O，203.3；β-琉基乙醇原液14.4mol/L）1L提取液的配置：12.114gTris+0.3722gEDTA+0.2033gMgCl2·6H2O用900ml水溶解，+0.7mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl調(diào)pH值至7.6，然后定容至1L。500ml提取液的配置：6.057gTris+0.1861gEDTA+0.1016gMgCl2·6H2O用450ml水溶解，+0.35mlβ-琉基乙醇原液后，用1mmol/LHCl（原液稀釋12000倍,83ul定容至100ml）調(diào)pH值至7.6，然后定容至500ml。GS測(cè)定：（1）合成酶活性反應(yīng)液配制：(50mmol/L咪唑-HCl(pH7.2)含40mmol/LMgSO4,90mmol/LL-谷氨酸,6mmol/L羥胺)(咪唑，68.077；無(wú)水氯化鎂，120；L-谷氨酸，147.13；羥胺，33.03)500ml反應(yīng)液：1.702g咪唑+2.4gMgSO4+6.621gL-谷氨酸+0.099g羥胺用450ml蒸餾水溶解，再用1mMHCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至500mL250ml反應(yīng)液：0.851g咪唑+1.2gMgSO4+3.311gL-谷氨酸+0.050g羥胺用200ml蒸餾水溶解，再用1mMHCl調(diào)節(jié)pH至7.2，定容至250mL（2）10mmol/LATP-Na(3個(gè)水，606.24):0.0666g定容至11ml（3）酸性FeC13終止液（2%(WV/)TCA+3.5%(WV/)FeC13·6H2O+2%HCl）配制:2gTCA+3.5gFeC13·6H2O+5.333mlHCl原液（分析純濃鹽酸一般為37.5%，摩爾濃度近似為12mol/L），用蒸餾水溶解后，定容至100ml.（4）測(cè)定（1個(gè)處理，3個(gè)管（1個(gè)對(duì)照，兩個(gè)重復(fù)））反應(yīng)總體積2ml：1.9ml(1ml活性反應(yīng)液+0.8ml蒸餾水+0.1ml粗酶液)混合液在37℃預(yù)熱2-3min后加入0.1ml10mmol/LATP啟動(dòng)反應(yīng)?；旌暇鶆蚝?，37℃室溫保溫15min后，立刻加入1mlFeC13終止液終止反應(yīng)，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測(cè)定吸光值?？瞻讓?duì)照：按順序加入1ml活性反應(yīng)液+0.8ml蒸餾水+0.1ml10mmol/LATP+1mlFeC13終止液+0.1ml粗酶液，然后3000g離心5min，上清液于540nm處測(cè)定吸光值。（5）一個(gè)GS活性單位定義為每分鐘于37℃產(chǎn)生1umol的r—谷氨酰異羥肟酸一glutamylhydroxmate)所需的酶量。（6）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：以r—谷氨酰異羥肟酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線取1ml反應(yīng)液，37℃預(yù)保溫，5min后分別加入0，0.5，1.0，1.5，2.0，3，4，5，6，7mM的谷氨酰基異羥肟酸1ml，混合均勻后，37℃室溫保溫15min后，立刻加入1mlFeC13終止液終止反應(yīng)，搖勻后在540nm波長(zhǎng)下比色，以蒸餾水作對(duì)照，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出谷氨?；惲u肟酸計(jì)算公式：=7.9*OD540-0.162

NADH-GOGAT活性的測(cè)定NADH-GOGAT活性測(cè)定按singh(1986)報(bào)道的方法進(jìn)行。測(cè)活貯備液:A:20mmol/L谷氨酰胺(146.15)0.2923g定容至100mlB:100mmol/La-酮戊二酸(146.11)1.4611g定容至100mlC:10mmol/LKCl(74.551)0.0745g定容至100mlD:25mmol/LTris-HCl緩沖液(pH7.6)1.514g定容至500mlE:3mmol/LNADH(新鮮配制)(709.4)0.017g定容至8ml空白對(duì)照為0.4mL(A)+0.05mL(B)+0.lmL(C)+2.45mL(D)。測(cè)活管:0.05mLB+0.lmLC+1.95mLD(測(cè)定前可以按照10:20:390比例混勻后，取混合液2.1ml)30℃水浴中預(yù)熱幾分鐘后,按順序加入0.2mLE和0.3mL酶液,再加入0.4mLA,混勻,立即啟動(dòng)反應(yīng)，紫外分光光度計(jì)在340nm處測(cè)光吸收,倒回試管,30℃水浴,三分鐘后再測(cè)一次光吸收,計(jì)算差值。NADH-GOGAT酶活性單位定義為:每分鐘反應(yīng)混合液于30℃減少1umolNADH為一個(gè)酶活性單位。NADH-GDH活性的測(cè)定:NADH-GDH(還原型GDH)和NAD+-GDH(氧化型GDH)的活性測(cè)定,參照Loulkakais等(1990)的方法。NADH-GDH測(cè)活貯備液:6.9898gTris+1.6876gα-酮戊二酸+6.179gNH4Cl定容至500ml(pH怎么調(diào)？還是分開配)？115.4mmol/LTris-HCI(pH8.0)，23.1mmol/Lα-酮戊二酸，231mmol/LNH4Cl(53.5)NADH貯備液(709.4):6mmol/L0.017g定容至4mlCaCl2:貯備液(110.98):30mmol/L0.3329g定容至100ml先在準(zhǔn)備好的試管中加入2.6mL測(cè)活貯備液，按順序加入0.lmLCaC12，0.lmLNADH，0.lmL蒸餾水。再加入0.lmL酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，并于340mn處測(cè)定吸光值，三分鐘后再測(cè)定一次，計(jì)算差值。以水代替NADH和酶液作為空白對(duì)照管。NADH-GDH