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PurificationandCharacterizationofaLow-temperatureHydroxylamineOxidasefromHeterotrophicNitrifierAcinetobactersp.Y16*IntroductionAutotrophicnitrifyingbacteriaperformaerobicnitrification,whereasheterotrophicnitrifyingbacteriacansimultaneouslyperformaerobicnitrificationanddenitrification.Hydroxylamineoxidationcatalyzedbyhydroxylamineoxidase(HAO)isconsideredasakeyreactionofnitrificationinautotrophicandheterotrophicbacteria.HAOinautotrophicbacteriaoxidizeshydroxylaminetonitrite,whereastheenzymeinheterotrophicbacteriaoxidizeshydroxylaminetonitriteortonitrousoxide.Acinetobactersp.Y16isanewlyisolatedheterotrophicnitrifyingbacteriumfromtheSonghuaRiverinwinter,whichcandegradelowamountsofammonianitrogen(5mg/L)at4-15°C.MaterialsandMethodsCultivationOrganismPreparationofCrudeEnzymeEnzymePurification

AKTAPurifierInstrument、anion-exchangecolumn、gel-filtrationcolumn、

TCA

EnzymeAssays

theabsorbancechangeat400nmEffectofpH,Temperature,andElectronAcceptoronHAOActivitySDSandMolecularMassDetermination

BradfordPurityAssayofthePurifiedProtein

highperformanceliquidchromatographyAminoAcidSequenceAnalysis

MSResultsPurificationofHAO

ActivityAnalysisofHAOEffectofpH,Temperature,andElectronAcceptoronHAOActivityUsingcytochromecastheelectronacceptortoreplacepotassiumferricyanideinreactionmixtures,noHAOactivitywasobserved.SDSAnalysisofHAOAminoAcidSequenceAnalysisofPurifiedHAODiscussionHAOwasconsideredtobeakeyenzymeduringthenitrogenremovalprocess,whichcanoxidizeNH2OHtonitriteornitrousoxide.

ThefindingofthepresentstudyindicatedthatthestrainY16couldoxidizeNH2OHtonitritecatalyzedbyalow-temperatureHAOduringammoniumremovalatlowtemperatures.Inthepresentstudy,ahighlypureHAOwasisolatedfromanAcinetobactersp.strainY16byananion-exchangeandgel-filtrationchromatography.PartialaminoacidsequenceanalysisofpolypeptidesofthepurifiedHAOshowedthatnohomologytothereportedHAOswaspublishedindatabase.ThedifferentsizeandaminoacidsequenceoftheHAOfromthestrainY16implythatitmaybedistinctfromotherpublishedHAOs.

Inthisstudy,thepurifiedHAOshowedahighactivitywithK3Fe(CN)6aselectronacceptor

andnoactivitywithcytochromeCaselectronacceptorwasfound.TheresultsindicatedthatalittleHAOwasextractedfromthestrainY16.Aswespeculated,tworeasonsmightcausethelowerHAOproduction.Ontheonehand,thepurificationproces

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