生物制藥綜合性實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告

PAGEPAGE26廣東藥學(xué)院基因工程（跨課程）綜合性實(shí)驗(yàn)論文姓名班級(jí)學(xué)號(hào)指導(dǎo)教師廣東藥學(xué)院生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院生物制藥研究所目錄TOC\o"1-4"\f\h\z\u摘要 2前言 3一、材料與方法 41.1材料 41.1.1重組蛋白質(zhì)藥物單元的實(shí)驗(yàn)材料 41.1.2重組DNA藥物單元的實(shí)驗(yàn)材料 41.2方法 51.2.1重組蛋白質(zhì)藥物單元 51.2.1.1工程菌構(gòu)建（已由老師完成） 51.2.1.2 工程菌表達(dá)篩選 61.2.1.3制備IL-18工程菌甘油種 81.2.1.4GST工程菌生長(zhǎng)曲線分析 81.2.1.5GST工程菌表達(dá)影響因素試驗(yàn) 91.2.1.6表達(dá)進(jìn)程分析 91.2.1.7凝膠掃描分析 101.2.1.8發(fā)酵工藝（觀摩） 101.2.2重組DNA藥物單元 101.2.2.1質(zhì)粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大規(guī)模制備 101.2.2.2TCR質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備與分析 111.2.2.3TCR體外轉(zhuǎn)染活性檢測(cè) 121.2.2.4TCR轉(zhuǎn)染體內(nèi)試驗(yàn) 12二、結(jié)果與討論 122.1重組蛋白質(zhì)單元結(jié)果與討論 132.1.1IL-18工程菌表達(dá)篩選SDS 132.1.2 GST工程菌生長(zhǎng)曲線分析 142.1.3表達(dá)影響因素試驗(yàn) 152.1.4 表達(dá)進(jìn)程試驗(yàn) 172.2重組DNA藥物單元結(jié)果與討論 192.2.1質(zhì)粒陰離子交換層析純化 192.2.2質(zhì)粒柱層析樣品瓊脂糖電泳分析 202.2.3質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備 212.2.4TCR轉(zhuǎn)染基因表達(dá)熒光檢測(cè) 212.2.5TCR體外轉(zhuǎn)染活性檢測(cè) 232.2.6TCR轉(zhuǎn)染體內(nèi)試驗(yàn) 25三、小結(jié) 27致謝 27

摘要：本綜合性實(shí)驗(yàn)分為“重組蛋白質(zhì)類藥物”和“重組DNA類藥物”二個(gè)單元。重組蛋白質(zhì)藥物以hIL-18的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)為例，全面介紹工程菌構(gòu)建、表達(dá)篩選、甘油種制備、生長(zhǎng)與表達(dá)分析、發(fā)酵工藝單元操作和表達(dá)產(chǎn)物分離純化等基因工程藥物研發(fā)與生產(chǎn)實(shí)踐中最常用的技術(shù)與工藝過(guò)程?！爸亟MDNA藥物”單元以質(zhì)粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP為例，介紹質(zhì)粒DNA大規(guī)模制備、陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物制備、T細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染T細(xì)胞目的基因表達(dá)和體外活性檢測(cè)、體內(nèi)給藥試驗(yàn)等。關(guān)鍵詞重組蛋白藥物;hIL-18;重組DNA藥物;陽(yáng)離子脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA復(fù)合物Abtract：Thecomprehensiveexperimentsaredividedintotwounits,whichis"RecombinantProteinDrugs"and"RecombinantDNADrugs".Theunit,Recombinantproteindrugs,takesexampleforhIL-18inE.coliexpressionsystem.ItcomprehensivelyintroductedthemostusualtechnologyandprocessofR&Dandproductionpracticeofthegeneticengineeringdrugs,suchastheconstructionofengineeringbacteria,expressionscreening,glycerolkindofpreparation,growthandExpressionAnalysis,fermentationprocessunitoperationandthepurificationofexpressionproduct.Theunitof"RecombinantDNAdrug"takedplasmidTCRVα12.2-Vβ7.1-EYFPasexample.Itintroductedthelarge-scalepreparationofplasmidDNA,Preparationofcationicliposomes-plasmidDNAcomplex,invitroTransfectionofTcells,expressionandinvitroactivityassayingofthetargetgeneoftransfectedTcellsandundertakingthetestinvivo.KeywordsRecombinantProteindrugs;hIL-18;RecombinantDNAdrugs;cationicliposomes-plasmidDNAcomplex

前言生命科學(xué)與生物技術(shù)的最主要任務(wù)之一是利用其理論與技術(shù)研究成果為人類的健康服務(wù)，生物技術(shù)制藥則是其最主要的應(yīng)用領(lǐng)域，且在重大傳染性疾病、惡性腫瘤及其它疑難雜癥防治方面具有巨大的潛力。藥品的研究開(kāi)發(fā)是一項(xiàng)龐大的系統(tǒng)工程，實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)的任何候選藥物要開(kāi)發(fā)成新藥都需要經(jīng)過(guò)生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究、有效性評(píng)價(jià)和安全性評(píng)價(jià)等過(guò)程。需要特別指出的是，生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究的內(nèi)容和任務(wù)還會(huì)始終貫穿于產(chǎn)品投產(chǎn)上市的過(guò)程中，相應(yīng)的技術(shù)手段也是作為企業(yè)生產(chǎn)或質(zhì)量控制人員必備的技能。因此，作為生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院的本科生，了解生物技術(shù)藥物研究、開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)的過(guò)程、掌握與生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制研究密切相關(guān)的技術(shù)手段是非常必要的。以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的基因工程藥物和基因工程抗體是當(dāng)今最主要的生物技術(shù)藥物形式，以DNA為基礎(chǔ)的基因治療制劑和DNA疫苗是未來(lái)生物制藥的主要發(fā)展方向之一。一、材料與方法1.1材料1.1.1重組蛋白質(zhì)藥物單元的實(shí)驗(yàn)材料1.1.1.1儀器超凈工作臺(tái)、移液槍（量程：10—100，0—1000）、滅菌槍頭、標(biāo)記筆、無(wú)菌牙簽、帶塞試管、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、帶塞三角瓶（500mL）、EP管(1.5mL)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、電泳儀、垂直電泳裝置、水浴鍋、離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)、培養(yǎng)皿、冰箱（-20℃，-80℃，1.1.1.2氨芐青霉素、LB培養(yǎng)基、pBV220—hIL-18轉(zhuǎn)化平板、GST工程菌平板、2×上樣緩沖液、10×電泳緩沖液、10%APS、30%膠母液、10%SDS、TEMED、分離膠緩沖液（pH8.8）、濃縮膠緩沖液（pH6.8）、考馬斯亮藍(lán)染色液、脫色液、10%甘油、去離子水、IPTG1.1.2重組DNA藥物單元的實(shí)驗(yàn)材料1.1.2.1高速冷凍離心機(jī)、臺(tái)式高速離心機(jī)、離心機(jī)、離心杯、離心管、水浴鍋、4℃冰箱、超凈工作臺(tái)、移液槍、滅菌槍頭、500mL三角瓶、常壓層析系統(tǒng)、燒杯、水平電泳裝置、電泳儀、紫外檢測(cè)儀、凝膠成像系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、1.5mLEP管、恒溫培養(yǎng)箱、滅菌玻璃滴管、12孔培養(yǎng)板、細(xì)胞計(jì)數(shù)板、電子顯微鏡、1.1.2.2STE、堿裂解溶液Ⅰ（（高壓滅菌）：50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris－Cl（pH8.0））、堿裂解溶液Ⅱ（0.2MNaOH、1％（m/V）SDS（高壓滅菌））、堿裂解溶液Ⅲ（5mol/L乙酸鉀、冰乙酸、H2O）、異丙醇、70%乙醇、TE、0.02MNaCl的TE溶液、0.3MNaCl的TE溶液、1.0MNaCl的TE溶液、0.5MNaOH、RNA酶、雙蒸水、生理鹽水、1.0MnaCl、20%乙醇、瓊脂糖、TAE、EB、電泳緩沖液、Marker、Buffer、質(zhì)粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP、脂質(zhì)體、腫瘤細(xì)胞BEL-7402、胰酶、完全培養(yǎng)基、4%苯酚溶液、1640培養(yǎng)基、胎牛血清、IL-2、雙抗（青霉素、鏈霉素）1.2方法1.2.1重組蛋白質(zhì)藥物單元1.2.1.1工程菌構(gòu)建（已由老師完成）（1）pBV220-hIL-18表達(dá)載體和工程菌構(gòu)建在本綜合性實(shí)驗(yàn)中目的基因的表達(dá)載體為pBV220，該載體的物理圖譜見(jiàn)圖1。該載體有一個(gè)氨芐青霉素抗性基因，在多克隆位點(diǎn)的上游為λ噬菌體的PL和PR啟動(dòng)子，PL和PR啟動(dòng)子受λ噬菌體CI基因的負(fù)調(diào)控。CI阻遏蛋白是溫度敏感蛋白，在28-37℃培養(yǎng)時(shí)，CI產(chǎn)生抑制作用，在溫度升至42℃時(shí)，CI被破壞，這樣就解除了對(duì)啟動(dòng)子的封閉，使PL和P目的基因?yàn)閔IL-18的編碼序列（cDNA），采用RT-PCR技術(shù)從外周血細(xì)胞中獲得。首先據(jù)Genebank報(bào)道序列設(shè)計(jì)引物，并在引物的5’端引入EcoRI位點(diǎn)和啟始密碼子ATG，在3’端引入HindⅢ位點(diǎn)。IL-18基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和HindⅢ雙酶切插入表達(dá)載體pBV220的相同位點(diǎn)即得hIL-18的表達(dá)載體pBV220-hIL-18。構(gòu)建的表達(dá)載體pBV220-hIL-18按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α株后即得“重組hIL圖1pBV220物理圖譜（2）pGEX-GST表達(dá)載體和工程菌構(gòu)建pGEX-GST為商品化融合表達(dá)載體，主要用于外源基因的可溶性融合表達(dá)。GST（谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶）為大腸桿菌宿主細(xì)胞的天然高效、可溶性表達(dá)的蛋白。以其作為融合表達(dá)“標(biāo)簽”有二點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：a)GST可以促進(jìn)二硫鍵的形成，使目的基因融合表達(dá)產(chǎn)物能正確折疊，因而常以可溶的表達(dá)產(chǎn)物存在；b)GST屬于大腸桿菌高效表達(dá)的天然產(chǎn)物，其mRNA的5‘端具有最適的結(jié)構(gòu)，有利于融合基因mRNA的翻譯，因此可大大提高融合基因表達(dá)水平。在pGEX-GST中，GST處于復(fù)合啟動(dòng)子Tac的控制之下，因此可采用IPTG誘導(dǎo)。其載體如圖2所示，圖中所示載體中還有一個(gè)特殊設(shè)計(jì)，即GST與目的蛋白的融合位點(diǎn)位PreScission蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，融合蛋白可在4℃下進(jìn)行酶切反應(yīng)，可避免其它蛋白酶類37℃那樣的高溫條件對(duì)目的產(chǎn)物的破壞。本綜合實(shí)驗(yàn)中采取的是無(wú)外源基因的載體，即只表達(dá)GST，主要用于給同學(xué)們展示與pVB220-hIL-18不同的另一種啟動(dòng)子和表達(dá)誘導(dǎo)方式（PL/PRvsTac；溫控vsIPTG誘導(dǎo)），并便于“表達(dá)進(jìn)程分析圖2pGEX-GST的物理圖譜工程菌表達(dá)篩選（1）菌種活化在無(wú)菌操作條件下，用無(wú)菌竹簽隨機(jī)挑取中等大小菌落的克隆，先在含有100ug/mL氨芐青霉素的LB平板上輕輕點(diǎn)一下，不要插入平板，隨后用帶有殘余菌體的牙簽接種含有2mLLB培養(yǎng)基（含100ug/mL氨芐青霉素）的帶塞試管，如此類推。每個(gè)學(xué)生接種1株，第1位同學(xué)負(fù)責(zé)接種對(duì)照，共接種7個(gè)轉(zhuǎn)化子單克隆，每個(gè)小組共用一個(gè)平板；將GST工程菌接種到含有2mLLB培養(yǎng)基（Amp+）的試管中。及時(shí)、準(zhǔn)確做好劃線平板與試管的對(duì)應(yīng)編號(hào)和平板編號(hào)標(biāo)記。平板和試管種分別置于37℃培養(yǎng)箱和搖床37℃，160rmp培養(yǎng)過(guò)夜。（2）IL-18工程菌表達(dá)誘導(dǎo)將前一天搖床過(guò)夜的6支試管的IL-18菌液按1%（即30ul）的接種比例分別接種到6支含有3mLLB培養(yǎng)基（含75ug/mL氨芐青霉素）的試管中，37℃搖床170rmp培養(yǎng)2.5hr，迅速轉(zhuǎn)移到42℃培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr。每個(gè)小組設(shè)一非誘導(dǎo)對(duì)照，標(biāo)記為CK1，CK1于37℃培養(yǎng)6.5hr，不做42℃表達(dá)誘導(dǎo)。培養(yǎng)完后，從試管中取300ul于EP管中，(3)IL-18工程菌表達(dá)篩選SDS（1）菌體樣品處理取-20℃凍存的培養(yǎng)物EP管，置于離心機(jī)5000g×5min離心，棄上清，菌體加入40ul2×上樣緩沖液，封口膜封好EP管，100℃水浴3min(Marker同時(shí)一樣處理)，待冷卻后10000g×10min離心，小心吸取上清，轉(zhuǎn)入另一標(biāo)記好的EP管，室溫保存?zhèn)溆茫ㄈ玳L(zhǎng)期放置，則置于4（2）SDS、配制適量的12％的分離膠：H2O3.3mL、30％膠母液4.0mL、分離膠緩沖液（pH8.8）2.5mL、10％SDS0.1mL、10％APS0.1mL、TEMED0.008mL。2、將配制好的分離膠加入制膠槽中，注意應(yīng)沿著邊緣緩慢加入，千萬(wàn)別進(jìn)氣泡。凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5cm或距梳子齒約0.5cm處。3、輕輕在分離膠溶液上覆蓋一層雙蒸水封膠，使凝膠表面變的平整，靜置47min，使凝膠聚合。凝膠聚合后，在分離膠和水層之間將會(huì)出現(xiàn)一個(gè)清晰的界面，可以微微傾斜模具，檢測(cè)凝膠是否聚合。4、除去上面的水層，再用濾紙吸盡殘留的液體。5、配制5％的濃縮膠：H2O3.4mL、30％膠母液0.83mL、濃縮膠緩沖液（pH6.8）0.63mL、10％SDS0.05mL、10％APS0.05mL、TEMED0.005mL。6、迅速將配好的濃縮膠添加到分離膠上面，并將梳子插入凝膠內(nèi)，至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊，小心避免混入氣泡。將凝膠垂直放置于室溫下，約25min凝膠聚合。7、將膠板放入電泳槽中，在上下電泳槽中添加電泳緩沖液，使凝膠的上下端均能浸泡在緩沖液中。輕輕拔出梳子，注意不要將加樣孔撕破。8、在電泳槽的泳道中分別添加蛋白Marker10ul和樣品10ul。每小組共用一膠，每膠15孔，1號(hào)孔為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，2-7號(hào)孔為自小至大編號(hào)的菌株誘導(dǎo)菌體蛋白，8號(hào)孔為非誘導(dǎo)菌體蛋白（對(duì)照CK1）。加樣時(shí)用微量移液器將樣品加入樣品孔的底部，避免帶入氣泡。9、接通電源，上槽（加樣孔端）接負(fù)極，下操接正極，恒流，起始電流20mA，待溴酚籃前沿進(jìn)入分離膠，電流增加至30mA。10、待藍(lán)色前沿跑至距電泳槽底部0.5cm時(shí)，切斷電源，從電極上拔掉電極插頭，取出玻璃板。11、帶上手套，小心移去兩玻璃之間的隔片，利用專用的鏟子輕輕撬開(kāi)玻璃板，小心從制膠板上將凝膠剝下，棄去濃縮膠。在右下角切去小片作為定位標(biāo)記。12、用清水洗膠，將分離膠放入染色液于搖床中40℃13、從染色液中將凝膠取出用水漂洗后，將膠放入脫色液中進(jìn)行擴(kuò)散脫色3次，直到背景藍(lán)色褪淡，見(jiàn)到條帶。倒掉脫色液，加入10%甘油保存至凝膠掃描分析。（4）工程菌表達(dá)篩選觀察電泳結(jié)果，找出表達(dá)量高的條帶，對(duì)應(yīng)前面在平板上的劃線，挑選高表達(dá)的菌落，接種到2mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中。接種GST工程菌到3管2mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，標(biāo)記好放到搖床中37℃1.2.1.3制備IL-18工程菌甘油種取5個(gè)EP管，按1：1（V/V）的比例加入250ul無(wú)菌的60％甘油和250ul接種的高表達(dá)的IL-18工程菌液，混勻后-80℃冰箱保存。1.2.1.4GST工程菌生長(zhǎng)曲線分析在超凈工作臺(tái)將過(guò)夜培養(yǎng)的GST工程菌種子液按5%的接種量（1mL），接入到19mLLB(Amp+)的三角瓶中。搖勻后取出1.5mL于EP管，用于0小時(shí)的OD值測(cè)定。將三角瓶置于搖床中37℃，170rpm振搖培養(yǎng)。此時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，然后每培養(yǎng)1小時(shí)將三角瓶取出置于超凈工作臺(tái)中，取樣測(cè)定其OD600值，共測(cè)定6小時(shí)。其中，前2小時(shí)每次取樣1.5mL，之后每次取樣0.5mL，用LB培養(yǎng)基稀釋至1.5ml生物量測(cè)定時(shí)，先將光分光光度計(jì)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至600nm，預(yù)熱30min，取1.5mL未接種的LB(Amp+)培養(yǎng)基于比色杯中作為空白對(duì)照，將菌液加至比色杯中進(jìn)行測(cè)定。記錄讀數(shù)。將測(cè)定的OD值填入下表：時(shí)間0h1h2h3h4h5h6hOD600以上述表格中的時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制GST工程菌的生長(zhǎng)曲線。1.2.1.5GST工程菌表達(dá)影響因素試驗(yàn)（1）誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響按5%的接種量，將3管過(guò)夜培養(yǎng)的GST工程菌種子液混在一起，分別取1mL接入到含19mLLB的三角瓶（標(biāo)記為A1-1、A1-2、A1-3）中，三角瓶中應(yīng)先加入氨芐青霉素，三支瓶分別取1.5ml測(cè)生物量(OD600,0h)，然后置于搖床中37℃，170rpm振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)至1.5h時(shí)，取出A1-1，在超凈工作臺(tái)中取出1.5mL測(cè)其生物量（OD600,誘導(dǎo)前）。然后加入2ulIPTG繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)至2.5h時(shí)，再取出A1-2，取出1.5mL測(cè)生物量，加入2ulIPTG繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)至3.5h時(shí)，取出A1-3，操作。三瓶菌體均誘導(dǎo)表達(dá)4h。分別培養(yǎng)4h后，將三角瓶從搖床取出，在超凈臺(tái)上取1ml于EP管中，-20℃凍存?zhèn)溆茫?）表達(dá)因素實(shí)驗(yàn)SDS取前一天-20℃凍存的6支樣品EP管，置于離心機(jī)5000g×5min離心，棄上清，加入40ul2×上樣緩沖液，封口膜封好EP管，100℃水浴3min(Marker同時(shí)一樣處理)，待冷卻后10000g×10min離心，小心吸取上清，轉(zhuǎn)入另一標(biāo)記好的EP管，室溫保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行SDS電泳（操作同之前）1.2.1.6表達(dá)進(jìn)程分析（1）GST工程菌表達(dá)進(jìn)程實(shí)驗(yàn)接種在超凈臺(tái)中GST平板上挑選一菌落接種于含2mLLB(Amp+)液體培養(yǎng)基中，同一菌落接種3管，置于搖床中37℃，170rpm振搖培養(yǎng)過(guò)夜（2）誘導(dǎo)表達(dá)并取樣進(jìn)行表達(dá)進(jìn)程分析從搖床中取出接種了GST工程菌的3支試管，在超凈臺(tái)上將3支試管的菌液混于一支試管中，共有6mL，取出5mL加到含100mLLB(Amp+)的三角瓶中，置于搖床中37℃，150rpm振搖培養(yǎng)。培養(yǎng)2.5h后，取出三角瓶，取1ml于EP管-20℃凍存。往三角瓶中加入100ulIPTG，誘導(dǎo)培養(yǎng)5h。此后每隔1小時(shí)取樣1ml于EP管（3）表達(dá)進(jìn)程分析SDS如前面操作。上樣量為10uL。1.2.1.7凝膠掃描分析將三次的SDS電泳膠進(jìn)行凝膠掃描。1.2.1.8發(fā)酵工藝（觀摩）1.2.2重組DNA藥物單元1.2.2.1質(zhì)粒TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的大規(guī)模制備（1）培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增500mL菌液接種于200mlLB培養(yǎng)基,用前按1：1000比例加入卡那霉素溶液（50mg/ml）,37℃（2）堿法大量提取質(zhì)粒DNA將裝在500mL三角瓶的200mL菌液轉(zhuǎn)移到離心杯中，3500rpm離心5min，棄去上清培養(yǎng)液，使細(xì)胞沉淀盡可能干燥。加入5mL冰預(yù)冷的溶液Ⅰ，重懸沉淀。向離心管中加入10mL新鮮配制的溶液Ⅱ，輕輕顛倒離心管5次。將離心管靜置5min。后向離心管中加7.5mL冰預(yù)冷的溶液Ⅲ，緩慢顛倒4-5次使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻，之后將離心管置冰上5min，12000g，離心15min，取上清。加0.9倍體積的異丙醇，冰上放置10min。12000g，離心20min，棄上清。加10mL70％乙醇，12000g離心10min，棄上清，沉淀在空氣中干燥。以8mLTE（含20μg/ml的RNaseA）溶解沉淀，37℃水浴鍋中保溫2hr后取出置于4（3）離子柱層析純化質(zhì)粒DNA①裝柱：先用1-2倍柱體積（20mL）雙蒸水洗柱。②平衡：20mL含0.02MNaCl的TE溶液平衡。③上樣：取凍存的質(zhì)粒溶液取1mL留樣用于后面的電泳，余液以TE（pH8.0）稀釋至50mL，用恒流泵泵入柱中。走紙速度為12cm/h,靈敏度為0.1A，電壓200V,A=280nm。④沖平：待樣品上完，用0.02MNaCl的TE溶液洗柱至基線。⑤洗脫：用0.3MNaCl的TE溶液洗柱至基線平衡（去處雜蛋白及其它小分子物質(zhì)），后改用1MNaCl洗柱至基線平衡（洗脫質(zhì)粒DNA），再用0.5MNaOH洗柱至基線平衡，接著用水洗至中性。在洗脫過(guò)程中用離心管收集各吸收峰，并用EP管收集峰尖留樣并標(biāo)記。⑥再生：用1.0MNaCl過(guò)柱。20%乙醇中保存。（4）瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒DNA稱取0.8g瓊脂糖于三角瓶中，用量筒量取80mLTAE倒入三角瓶。加熱溶解，待冷卻到60℃再加入5uLEB。將瓊脂糖溶液慢慢倒在插有梳子的膠膜上，厚約3mm1.2.2.2TCR質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備與分析（1）質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：包封率的測(cè)定吸取質(zhì)粒DNA2ug(10ul)+NaCl40ul=50ul=1\*GB3①10min吸取脂質(zhì)體5ul+NaCl45ul=50ul=2\*GB3②10min對(duì)照質(zhì)粒DNA2ug(10ul)＋NaCl90ul=100ul(B)10min將=2\*GB3②加入=1\*GB3①，室溫放置20min，(A)。超速離心，12000rpm10min，分別取每管上清50ul測(cè)紫外吸光度OD260值，生理鹽水50ul作為空白對(duì)照。計(jì)算包封率：包封率（%）＝（ODB－ODA）／ODB×100％（2）質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物制備：轉(zhuǎn)染用吸取質(zhì)粒DNA12ug(60ul)吸取脂質(zhì)體30ul1640培養(yǎng)基210ul將上述溶液輕輕混勻，室溫放置15min。轉(zhuǎn)染用50ul/孔，共轉(zhuǎn)6孔。1.2.2.3PBMC體外基因轉(zhuǎn)染（1）人T淋巴細(xì)胞（PBMC）由老師完成。（2）用含TCRVα12.2-Vβ7.1-EYFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人淋巴細(xì)胞取一12孔板，每孔加入1mL淋巴細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)為1×106個(gè)。共接種12孔，其中6孔用于轉(zhuǎn)染，6孔作為對(duì)照。向轉(zhuǎn)染用的6孔中加入50ul/孔的質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，混勻，放入培養(yǎng)箱中5h后每孔分別加入800ul培養(yǎng)基+200ul胎牛血清+2ulIL-2+20ul雙抗，繼續(xù)培養(yǎng)24h。（3）轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞基因表達(dá)熒光檢測(cè)將以上培養(yǎng)的12孔板培養(yǎng)48h后置于熒光顯微鏡下拍照，然后用于Bel-7402細(xì)胞共孵育，以及小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。1.2.2.3TCR體外轉(zhuǎn)染活性檢測(cè)（1）腫瘤細(xì)胞BEL-7402接種，培養(yǎng)取腫瘤細(xì)胞BEL-7402一瓶，棄去培養(yǎng)基，用移液器吸取滅菌生理鹽水2mL加入培養(yǎng)瓶中，輕輕洗滌細(xì)胞一次，棄上清。向瓶中加入1mL胰酶，蓋緊瓶蓋，室溫消化3分鐘，蓋緊蓋子在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。待細(xì)胞變圓成單個(gè)細(xì)胞后，豎起培養(yǎng)瓶，在操作臺(tái)上打開(kāi)瓶蓋，倒去胰酶液體。向瓶中加入4mL1640培養(yǎng)基，用玻璃滴管吹打，取800ul懸液于EP管中用于細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果為8.5×105個(gè)/mL。取一支離心管，加入750ul細(xì)胞懸液，600ulFBS,4650ul1640培養(yǎng)基，6ul雙抗，混勻之后將腫瘤細(xì)胞懸液接種于12孔板，1mL/孔，加6孔。將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)（2）T細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞共孵育分別吸取2孔已轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞，1800rpm,5min離心，棄上清，用1640培養(yǎng)基1ml吹打混勻，加入Bel-7402培養(yǎng)板（先吸去培養(yǎng)液，加入16401ml）中，1ml/孔，每孔補(bǔ)加10%血清和雙抗（1：1000）；再吸取2孔未轉(zhuǎn)染的T淋巴細(xì)胞，也按上面方法處理，余下2孔腫瘤細(xì)胞作為對(duì)照。將培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后置于倒置顯微鏡下進(jìn)行拍照1.2.2.4TCR轉(zhuǎn)染體內(nèi)試驗(yàn)（1）荷瘤昆明小鼠模型建立（提前一周）取8只小鼠(雌雄分開(kāi)養(yǎng))，用苦味酸標(biāo)記。1-7號(hào)腹腔注射0.3mLH22細(xì)胞液（107個(gè)cell/ml），8號(hào)腹腔注射0.3mL生理鹽水。將8只小鼠置于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，觀察小鼠的腹水生成情況。（2）轉(zhuǎn)染T細(xì)胞注射荷瘤小鼠轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞剩余4孔分別離心1800rpm,5min，分別加入0.2ml生理鹽水，腹腔注射小鼠體內(nèi)，未轉(zhuǎn)染的2孔細(xì)胞也按上述處理作為對(duì)照，其余小鼠注射0.2ml生理鹽水作為陰性對(duì)照。連續(xù)一周觀察小鼠的腹水生成情況，這期間要每天給小鼠喂食，保持小鼠飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，最后進(jìn)行拍照比較。二、結(jié)果與討論2.1重組蛋白質(zhì)單元結(jié)果與討論2.1.1圖1.1IL-18工程菌表達(dá)篩選SDS凝膠掃描圖圖1.2工程菌表達(dá)篩選BandScan分析圖泳道1-6對(duì)應(yīng)1-6號(hào)菌株，泳道7為對(duì)照菌株CK1每個(gè)泳道的上樣量為10ul，目的蛋白的分子量為28KD，由圖1.1可以看出，1-5泳道均有表達(dá)，6、7泳道沒(méi)有相應(yīng)的條帶。7號(hào)為對(duì)照組，其菌液始終在37℃下培養(yǎng)，沒(méi)有進(jìn)行42℃的誘導(dǎo)，故無(wú)目的蛋白產(chǎn)生。而6號(hào)無(wú)條帶屬于異?，F(xiàn)象，可能是轉(zhuǎn)化時(shí)只轉(zhuǎn)入了空質(zhì)粒。經(jīng)BandScan軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（圖1.2），2號(hào)菌株表達(dá)量最高（14.9%），1號(hào)菌株為12.1%，4號(hào)菌株12.3%，3號(hào)菌株7.0%，5號(hào)菌株4.6%。但是從條帶上可以看出，2號(hào)菌蛋白表達(dá)總量比較少，1號(hào)菌的表達(dá)總量相對(duì)是最好的。使用軟件我們發(fā)現(xiàn)，跑膠的質(zhì)量直接影響到軟件分析的可靠性，我們組的膠跑得不是很好，條帶不太清晰，所以軟件分析結(jié)果參考價(jià)值并不是很大。通過(guò)目測(cè)，本組選擇3號(hào)菌株作為高表達(dá)菌株保種。GST工程菌生長(zhǎng)曲線分析依據(jù)其生長(zhǎng)速率的不同，一般可把生長(zhǎng)曲線分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個(gè)時(shí)期的長(zhǎng)短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過(guò)測(cè)定微生物的生長(zhǎng)曲線，可了解各菌的生長(zhǎng)規(guī)律，對(duì)于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導(dǎo)意義。由于細(xì)菌懸液的濃度與光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度計(jì)測(cè)定菌懸液的光密度來(lái)推知菌液的濃度，并將所測(cè)的OD值與其對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長(zhǎng)曲線。表1.1GST工程菌生長(zhǎng)OD值時(shí)間0h1h2h3h4h5h6hOD6000.0800.2640.7281.2511.6381.8961.959圖1.3GST工程菌生長(zhǎng)曲線由圖1.3可看到，該生長(zhǎng)曲線呈S形，經(jīng)過(guò)了延緩期、對(duì)數(shù)期到穩(wěn)定期的趨勢(shì)。0-1h生長(zhǎng)較緩慢，從第1h開(kāi)始呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，到5h以后生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。對(duì)數(shù)中期確定第3個(gè)小時(shí)。2.1.3表達(dá)影響因素試驗(yàn)基因工程菌的培養(yǎng)一般分兩段。前期是菌體生長(zhǎng)，生長(zhǎng)到某一階段，加入誘導(dǎo)因子，誘發(fā)產(chǎn)物表達(dá)。加入誘導(dǎo)因子的時(shí)間被稱為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。對(duì)于基因工程菌一般選擇其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期作為菌體的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。如表1.2所示：如果在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期進(jìn)行誘導(dǎo)，由于菌體量較少，蛋白的表達(dá)量不高。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期進(jìn)行誘導(dǎo)，工程菌的生長(zhǎng)速度比較快，這時(shí)蛋白的積累加快，蛋白表達(dá)水平較高。而菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)期后期，由于發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)的消耗，氧氣的缺乏及代謝產(chǎn)物的積累，使菌體的生長(zhǎng)速度明顯受到抑制。在此狀態(tài)下誘導(dǎo)，表達(dá)顯然受到影響。表1.2誘導(dǎo)時(shí)機(jī)OD值1.5小時(shí)2.5小時(shí)3.5小時(shí)0小時(shí)0.0560.0500.046誘導(dǎo)前0.4660.7441.149圖1.4誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)工程菌表達(dá)SDS凝膠掃描圖1、2:培養(yǎng)1.5h后IPTG誘導(dǎo)4h3、4:培養(yǎng)2.5h后IPTG誘導(dǎo)4h5、6：培養(yǎng)3.5h后IPTG誘導(dǎo)4h每個(gè)泳道的上樣量均為10ul，圖1.4可以看出，表達(dá)量最高的是4號(hào)泳道，3號(hào)泳道的總蛋白量比4號(hào)泳道少，所以目的蛋白較少，但比例差不多。其次是1號(hào)和2號(hào)泳道，最少的是5號(hào)和6號(hào)泳道。從圖1.5可看出，2-7泳道都有目的蛋白表達(dá)，5號(hào)泳道的目的蛋白表達(dá)量最高，2號(hào)泳道的目的蛋白表達(dá)量高于6泳道。所以在GST培養(yǎng)1.5h—2.5h時(shí)對(duì)工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)得到的目的蛋白含量最高。圖1.5誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)工程菌表達(dá)的影響B(tài)andScan分析圖表達(dá)進(jìn)程試驗(yàn)誘導(dǎo)時(shí)間是指加入誘導(dǎo)劑后的培養(yǎng)時(shí)間。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，外源蛋白的表達(dá)量增加，但外源蛋白在細(xì)胞內(nèi)的積累，對(duì)重組菌產(chǎn)生毒性，合成速率下降，甚至產(chǎn)物被分解。由上述實(shí)驗(yàn)選擇了培養(yǎng)2.5小時(shí)作為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。圖1.6所示，1號(hào)泳道有少量蛋白表達(dá)（28KD），因?yàn)檫€沒(méi)有開(kāi)始誘導(dǎo)，應(yīng)該屬于本底表達(dá)；之后的泳道誘導(dǎo)時(shí)間逐漸增加，相應(yīng)的目的蛋白的條帶顏色也在加深，蛋白總的表達(dá)量也在增加，但是目的蛋白的含量未見(jiàn)明顯增加。軟件的分析也表明了這一點(diǎn)。因此，雖然誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)有助于總蛋白量的增加，但如果目的蛋白的增加不多的話，考慮到成本和經(jīng)濟(jì)效益，應(yīng)該選擇一個(gè)合適的誘導(dǎo)時(shí)間。圖1.6GST表達(dá)進(jìn)程SDS凝膠掃描圖1：培養(yǎng)2.5h的樣品2:IPTG誘導(dǎo)1h的樣品3：IPTG誘導(dǎo)2h的樣品4：IPTG誘導(dǎo)3h的樣品5：IPTG誘導(dǎo)4h的樣品6：IPTG誘導(dǎo)5h的樣品圖1.7GST表達(dá)進(jìn)程BandScan分析圖2.2重組DNA藥物單元結(jié)果與討論2.2.1質(zhì)粒陰離子交換層析純化如圖2.1所示，A1-2和A1-2-2為穿透峰，A1-3、A1-4、A1-5分別為用含0.3mol/LNaCl的TE、含1.0MNaCl的TE、1.0MNaOH的洗脫峰。上樣后用平衡緩沖液過(guò)柱后，除去大量的雜質(zhì)，產(chǎn)生穿透峰。洗脫峰A1-3是用0.3MNaCl的TE溶液洗柱產(chǎn)生的，除去與柱子結(jié)合不太緊密或者一些非特異性結(jié)合的物質(zhì)。洗脫峰A1-4是用1MNaCl洗柱產(chǎn)生的，可洗脫質(zhì)粒DNA，洗脫峰A1-5是用1.0MNaOH洗脫的，可除去與柱子結(jié)合得比較緊密的物質(zhì)。圖2.1陰離子交換純化層析圖2.2.2質(zhì)粒柱層析樣品瓊脂糖電泳分析瓊脂糖是從海藻中提取出來(lái)的一種線狀高聚物，可作為電泳支持物，適用于分離大小范圍在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的遷移率與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。觀察其遷移距離，與標(biāo)準(zhǔn)DNA片段進(jìn)行對(duì)照，就可獲知該樣品分子量大小。在質(zhì)粒抽提過(guò)程中，由于各種因素的影響，使質(zhì)粒DNA呈現(xiàn)超螺旋的共價(jià)閉合環(huán)狀、開(kāi)環(huán)狀分子、線狀分子三種不同的構(gòu)型，這三種分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開(kāi)環(huán)狀分子。用熒光染料溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）進(jìn)行檢測(cè)，溴化乙錠嵌入堿基對(duì)之間形成熒光絡(luò)合物，在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。如圖2.2所示，原樣是純化前樣品，有若干明顯的條帶，是不同構(gòu)型的質(zhì)粒和一些DNA雜質(zhì)。泳道1、2的樣品主要是一些雜蛋白，不含DNA，故無(wú)條帶；泳道3中有一條比較模糊的條帶，對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒的開(kāi)環(huán)構(gòu)型；泳道4洗脫峰為質(zhì)粒，條帶比較模糊，可能是洗脫不徹底，而泳道5中出現(xiàn)明顯的條帶，與原樣的組成相似，說(shuō)明在用1MNaCl過(guò)柱時(shí)，并不能很好的將質(zhì)粒洗脫下來(lái)，同時(shí)也解釋了泳道4中出現(xiàn)的現(xiàn)象?？梢钥紤]用更高的鹽濃度來(lái)洗脫。圖2.2質(zhì)粒柱層析樣品瓊脂糖電泳分析原樣：上柱前樣品1、2：0.02mol/LNaCl洗脫峰樣品3：0.3