離子交換502的課件知識(shí)

離子交換層析1離子交換(ionexchange)利用離子交換樹(shù)脂作為吸附劑，將溶液中的待分離組分，依據(jù)其電荷差異，依靠庫(kù)侖力吸附在樹(shù)脂上，然后利用合適的洗脫劑將吸附質(zhì)從樹(shù)脂上洗脫下來(lái)，達(dá)到分離的目的。2離子交換樹(shù)脂的構(gòu)成具有三維空間離體結(jié)構(gòu)的網(wǎng)絡(luò)骨架聯(lián)接在骨架上的活性基團(tuán)活性基團(tuán)所帶的相反電荷的活性離子（可交換離子）3樹(shù)脂的網(wǎng)絡(luò)骨架45離子交換的分類(lèi)按活性基團(tuán)分類(lèi)，可分為陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(cation

exchange)（含酸性基團(tuán)）和陰離子交換樹(shù)脂(anionexchange)（含堿性基團(tuán)）。具體又可以分為：強(qiáng)陽(yáng)、弱陽(yáng)強(qiáng)陰、弱陰67常用的離子交換樹(shù)脂強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)是-SO3H（磺酸基）和-CH2SO3H（次甲基磺酸基）；弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)有-COOH,-OCH2COOH,C6H5OH等弱酸性基團(tuán)；強(qiáng)堿性陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)為季銨基團(tuán)，如三甲胺基或二甲基-?-羥基乙基胺基；弱堿性陰離子交換樹(shù)脂：活性基團(tuán)為伯胺或仲胺，堿性較弱；8pH56789交換容量（meq/g）0.82.58.09.09.0羧酸陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在不同pH下的交換容量H＋和弱酸陽(yáng)離子樹(shù)脂的結(jié)合力很強(qiáng)，容易再生。910新型離子交換樹(shù)脂大孔離子交換樹(shù)脂大孔離子交換樹(shù)脂具有和大孔吸附劑相同的骨架結(jié)構(gòu)，在大孔吸附劑合成后（加入致孔劑），再引入化學(xué)功能基團(tuán)，便可得到大孔離子交換樹(shù)脂11大孔離子交換樹(shù)脂的優(yōu)點(diǎn)通過(guò)在合成時(shí)加入惰性致孔劑，克服了普通凝膠樹(shù)脂由于溶脹現(xiàn)象，產(chǎn)生的“暫時(shí)孔”現(xiàn)象，從而強(qiáng)化了離子交換的功能；減少了凝膠樹(shù)脂在離子交換過(guò)程中的“有機(jī)污染”現(xiàn)象（大分子不易洗脫）；可以通過(guò)致孔劑選擇調(diào)整孔徑大小、樹(shù)脂的比表面積，以適應(yīng)不同的分離要求。12和凝膠樹(shù)脂比較，大孔樹(shù)脂有以下特點(diǎn)：1。交聯(lián)度高、溶脹度小，有較好的理化穩(wěn)定性；2。有較大的孔度、孔徑和比表面，給離子交換提供良好的接觸條件，交換速度快，有較好的抗有機(jī)污染性能；其永久性孔隙在水化作用時(shí)起緩沖作用，耐脹縮不易破碎；3。流體阻力小，工藝參數(shù)比較穩(wěn)定。缺點(diǎn)：裝填密度小、體積交換量小、洗脫劑用量多，價(jià)格高，一次性投資較大等缺點(diǎn)13其它離子交換樹(shù)脂類(lèi)型兩性樹(shù)脂：同時(shí)含有酸、堿兩種基團(tuán)的樹(shù)脂；均孔型離子交換樹(shù)脂：主要是陰離子型凝膠離子交換樹(shù)脂，孔徑均勻，交換容量高、機(jī)械強(qiáng)度好；螯合樹(shù)脂：樹(shù)脂上含有具有螯合能力的基團(tuán)，既可以形成離子鍵，又可以形成配位鍵；主要用于脫除金屬離子；*多糖基離子交換樹(shù)脂：固相載體為多糖類(lèi)物質(zhì)，親水性強(qiáng)、交換空間大、對(duì)生物大分子物質(zhì)變性作用小。14離子交換纖維素和離子交換葡聚糖

親水性離子交換劑。都是由葡萄糖聚合而成的大分子物質(zhì)，在分子中帶有很多羥基，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)可引入活性離子的基團(tuán)，從而具備離子交換劑的性質(zhì)。15多糖基離子交換樹(shù)脂離子交換纖維素

樹(shù)脂骨架為纖維素，根據(jù)活性基團(tuán)的性質(zhì)可分為陽(yáng)離子交換纖維素和陰離子交換纖維素兩類(lèi) 特點(diǎn)：骨架松散、親水性強(qiáng)、表面積大、交換容量大、吸附力弱、交換和洗脫條件溫和、分辨率高常用的離子交換纖維素有：

甲基磺酸纖維素、羧甲基纖維素、二乙基氨基乙基纖維素

16CMCCationExchanger17DEAEanionexchanger18離子交換纖維素具有開(kāi)放性的支持骨架，大分子能自由地進(jìn)入和迅速地?cái)U(kuò)散，故對(duì)大分子的吸附容量較大。離子交換纖維素上交換基團(tuán)排列疏散，對(duì)大分子的吸附不是太牢固，用溫和的條件便可將其洗脫下來(lái)，因此不致引起大分子的變性，同時(shí)它有較理想的回收率。離子交換纖維素特別適用于分離那些水溶性的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多糖、酸性多糖等。192021交換體系中緩沖鹽的濃度不宜高(一般控制在0.001～0.02mol/L之間)，過(guò)高會(huì)大大減少蛋白質(zhì)的吸附量。22離子交換纖維素的解吸

升高pH值,降低pH值,增加離子強(qiáng)度

H2N-P表示蛋白質(zhì),C表示纖維素。23葡聚糖凝膠離子交換樹(shù)脂

采用淀粉或蔗糖制備。

骨架為葡聚糖凝膠sephadex，根據(jù)功能基團(tuán)的不同，亦可分為陽(yáng)離子交換和陰離子交換樹(shù)脂常用的葡聚糖凝膠離子交換樹(shù)脂：CM-sephadexC-25、DEAE-sephadexA-25等24

除了具有離子交換功能以外，兼有分子篩的功能，提高了分離的效率.優(yōu)點(diǎn)：載體親水，對(duì)生物大分子變性小，分辨率高。比纖維素樹(shù)脂交換容量大。缺點(diǎn)：洗脫液pH或離子強(qiáng)度變化時(shí)，凝膠體積變化大，影響流速。2526離子交換樹(shù)脂的性能參數(shù)交聯(lián)度交換容量表征骨架性能的參數(shù)表征活性基團(tuán)的性能參數(shù)是指交聯(lián)劑在反應(yīng)物中所占的質(zhì)量分?jǐn)?shù)交聯(lián)度大，樹(shù)脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。小慢高交聯(lián)度小，樹(shù)脂孔隙，交換反應(yīng)速度，選擇性。大快低氨基酸的分離，交聯(lián)度8%，多肽的分離2~4%每克干樹(shù)脂所能交換的物質(zhì)的量（mmol)。決定于網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中活性基團(tuán)的數(shù)目。交換容量由實(shí)驗(yàn)測(cè)得27影響離子交換選擇性的因素水合離子半徑：半徑越小，親和力越大；離子化合價(jià)：高價(jià)離子易于被吸附；溶液pH：影響交換基團(tuán)和交換離子的解離程度，但不影響交換容量；離子強(qiáng)度：越低越好；有機(jī)溶劑：不利于吸附；交聯(lián)度、膨脹度、分子篩：交聯(lián)度大，膨脹度小，篩分能力增大；交聯(lián)度小，膨脹度大，吸附量減少；樹(shù)脂與粒子間的輔助力：除靜電力以外，還有氫鍵和范德華力等輔助力；28RSO3-H++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-H+RSO3-H3+NR1COOH

RSO3-H++H3N+R1COOHRSO3-Na++H3+NR1COO-RSO3-H3+NR1COO-Na+氫型磺酸樹(shù)脂吸附丙氨酸:酸洗脫丙氨酸:鈉型磺酸樹(shù)脂吸附丙氨酸:2930離子交換操作方法樹(shù)脂預(yù)處理離子交換吸附洗脫31樹(shù)脂預(yù)處理物理處理：水洗、過(guò)篩，去雜，以獲得粒度均勻的樹(shù)脂顆粒；化學(xué)處理：轉(zhuǎn)型（氫型或鈉型）陽(yáng)離子樹(shù)脂酸—堿—酸陰離子樹(shù)脂堿—酸—堿最后以去離子水或緩沖液平衡32離子交換纖維素的處理和再生處理時(shí)間:從4h縮短為0.3-1h,浸泡用的酸堿濃度要適當(dāng)降低,使用前須用大量水浸泡，充分溶漲。然后用數(shù)十倍的(如50倍)0.5mol/L鹽酸和0.5mol/L氫氧化鈉溶液反復(fù)浸泡處理，每次換液皆須用水洗至近中性,第二步處理時(shí)按交換的需要決定平衡離子。最后以交換用緩沖液平衡備用，堿處理時(shí)，陽(yáng)離子交換纖維素膨脹很大，影響過(guò)濾或流速，解決方法：0.5mol/LNaOH+0.5mol/LNaCl.33離交操作方式靜態(tài)：操作簡(jiǎn)單、但是分批操作，交換不完全動(dòng)態(tài)：離子交換柱，操作連續(xù)、交換完全，適宜多組份分離

34洗脫方式（1）改變?nèi)芤簆H值（2）改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度35樹(shù)脂再生酸性陽(yáng)離子樹(shù)脂酸-堿-酸-緩沖溶液淋洗堿性陰離子樹(shù)脂堿-酸-堿-緩沖溶液淋洗36離子交換分離法的應(yīng)用水的凈化H+OH-陽(yáng)離子交換陰離子交換R-SO3H+M+R-SO3M+H+RN+H3OH-+X-RN+H3X-+OH-H++OH-H2O除去水中的雜質(zhì)離子去離子水3738離子交換應(yīng)用離子交換法提取蛋白質(zhì)較無(wú)機(jī)離子的離子交換平衡復(fù)雜，其吸附行為與離子間的靜電引力、氫鍵、疏水作用以及范德華力有關(guān)蛋白質(zhì)是生物大分子物質(zhì)，其擴(kuò)散行為也較無(wú)機(jī)離子復(fù)雜39SomeofthechargedregionswhichwillinfluenceionexchangeDifferentproteinshavedifferentchargesanddifferentpatternsofsurfacechargeBasisforselectivity40NH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-LowpHPositivechargeHighpHNegativechargeHydrogengainedHydrogenlostEffectofpHoncharge41-+OverallchargeonproteinNH3RCOOH+NH3RCOO+-RNH2COO-acidisoelectricpoint alkalineexcesspositivechargebalancedpositiveandnegativechargeexcessnegativechargepH310Titrationcurves42離子交換法分離氨基酸

離子交換法是利用各種氨基酸等電點(diǎn)的差異，只有當(dāng)混合氨基酸之間的等電點(diǎn)相差較大時(shí)才能較好地分開(kāi)。離子交換樹(shù)脂研究較為成熟，提取氨基酸處理量大，成本低，操作條件容易控制。離子交換法在工業(yè)應(yīng)用中已經(jīng)有很多成功的實(shí)例，如谷氨酸,苯丙氨酸,精氨酸等的分離提取。43TypicalionexchangeproteinseparationLoadingstartsLoadingends,LowsaltwashbeginsProteinabsorbancePeakofunboundproteinSaltgradient01MSaltgradientbeginsSaltgradientendsElutedpeaksofweaklybound(I),moderatelybound(II)andtightlybound(III)proteinsIIIIII44常用于蛋白質(zhì)提取分離的離子交換劑要求：良好的親水性、具有較大的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)、粒度越小分辨率越高種類(lèi)：多糖類(lèi)離子交換纖維素交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)瓊脂糖

聚乙烯醇類(lèi)Mono系列AmershamPharmacia45蛋白質(zhì)離子交換分離的基本步驟平衡上樣吸附洗脫再生46++++++-------anionexchangebeadEquilibration47Sampleapplicationandwash-----------++++++----48Elution----------------------------------++++++++++++--49Regeneration-----------------------++++++50SampleapplicationandwashElutionEquilibrationRegeneration--------------------------------------------------------------------++++++++++++++++++++++++++++++-----------51蛋白質(zhì)層析介質(zhì)的發(fā)展概況層析技術(shù)的核心是層析介質(zhì),選擇合適的層析介質(zhì)、應(yīng)用合理的工藝條件已成為蛋白質(zhì)層析技術(shù)的關(guān)鍵。52最初主要是天然高分子物質(zhì),都為多糖如纖維素、葡聚糖和非交聯(lián)的瓊脂糖凝膠,特點(diǎn)是親水性好、生物相容性高,缺點(diǎn)是質(zhì)地較軟、不耐壓、流速慢,一般稱之為軟膠(softgel)。隨著對(duì)蛋白質(zhì)分離要求的不斷提高,新型的層析介質(zhì)被不斷地開(kāi)發(fā)出來(lái),53新型的層析介質(zhì)

粒度均勻的珠狀交聯(lián)多糖。在保證了經(jīng)典多糖介質(zhì)良好的吸附性能的基礎(chǔ)上進(jìn)行交聯(lián),不但增加了強(qiáng)度,而且較窄的粒徑分布提高了分離效率。如交聯(lián)瓊脂糖凝膠,商品化的有AmershamBiosciences生產(chǎn)的SepharoseFastFlow、SepharoseHighPerformance等系列。54

人工合成的大孔聚合物。基于這類(lèi)填料的層析被稱為灌注層析.其特點(diǎn)是在介質(zhì)中除了有小的擴(kuò)散孔,還有大的穿透孔,從而大大加快傳質(zhì),增加流速。最早商業(yè)化的產(chǎn)品是PerSeptiveBiosystems公司1989年推出的Poros系列,目前還有Ciphergen公司的HyperD系列。55觸角型(tentacle)吸附劑。這類(lèi)介質(zhì)通過(guò)增長(zhǎng)間隔臂和有效官能團(tuán)來(lái)增加活性配基與蛋白質(zhì)的相互作用,從而提高效率,如Merck公司的FractogelEMD系列。56軟膠包裹在硬膠表面(softgelinarigidshell)。特點(diǎn)是結(jié)合了軟膠(如瓊脂糖)良好的吸附性能和無(wú)機(jī)材料(如硅膠)的剛性優(yōu)點(diǎn),如Ciphergen公司的Spherodex系列。57離子交換層析介質(zhì)

纖維素離子交換劑,纖維素高度的親水性能與蛋白質(zhì)有很好的相容性,缺點(diǎn):容量低、流速慢。珠狀交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)纖維素,是目前得到廣泛應(yīng)用的離子交換介質(zhì)。人工合成的剛性材料被陸續(xù)開(kāi)發(fā)。58活性基團(tuán)活性基團(tuán)的pK值決定了相應(yīng)的離子交換劑的pH工作范圍。通常通過(guò)酸堿滴定曲線來(lái)確定,對(duì)同類(lèi)型的離子交換劑來(lái)說(shuō),強(qiáng)陽(yáng)(陰)離子交換劑比弱陽(yáng)(陰)離子交換劑有更寬的工作范圍,是強(qiáng)弱介質(zhì)的一個(gè)重要區(qū)別。59活性基團(tuán)密度對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力也有影響。研究了陽(yáng)離子交換介質(zhì)活性基團(tuán)密度的增加(10～500μmol/g)對(duì)溶菌酶和細(xì)胞色素C的吸附容量的影響,結(jié)果表明,在配基密度達(dá)到一個(gè)極限值之前,蛋白質(zhì)的吸附容量隨著配基密度的增加而明顯增加;過(guò)了極限值,基本上沒(méi)有影響。60活性基團(tuán)種類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)吸附能力也有影響。一般對(duì)同類(lèi)型的離子交換劑來(lái)說(shuō),強(qiáng)陽(yáng)(陰)離子交換劑比弱陽(yáng)(陰)離子交換劑對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)合能力強(qiáng),需較強(qiáng)的鹽濃度進(jìn)行洗脫。61對(duì)于在高鹽濃度不穩(wěn)定或難溶解在高鹽濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)行離子交換層析時(shí),可以使用結(jié)合力相對(duì)較弱的弱離子交換劑。62基質(zhì)及其對(duì)分離性能的影響基質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)分離效果影響較大的是其表面性質(zhì),如親水性和內(nèi)部的孔徑分布。目前,用于蛋白質(zhì)分離的離子交換介質(zhì)一般都有較好的親水性能,內(nèi)部的孔徑分布對(duì)蛋白質(zhì)的分離影響更大,不但決定了蛋白質(zhì)分離的范圍,而且還決定了蛋白質(zhì)擴(kuò)散的速度。63和凝膠過(guò)濾介質(zhì)相比,離子交換對(duì)孔徑?jīng)]有特定的要求,一般選擇較大孔徑以利于蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散從而加快平衡、提高容量?；|(zhì)的性質(zhì)還決定了介質(zhì)的溶脹性能、耐壓性能等。64離子交換介質(zhì)性能表征離子交換介質(zhì)性能的參數(shù)很多,可以分為物理性能、化學(xué)性能和色譜性能三大類(lèi)。物理性能有粒徑、孔徑、壓降、溶脹性、流速、擴(kuò)散等,化學(xué)性能主要指交換量、介質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性等色譜性能主要有容量、分辨率、塔板高度、保留值等。65“三相純化策略”

富集(capturestep)

對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行初步純化,去除那些與目標(biāo)蛋白質(zhì)性質(zhì)差異很大的物質(zhì),如細(xì)胞的DNA、RNA等;尤其是去除那些對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)如各種蛋白酶。通常應(yīng)用的層析技術(shù)有離子交換、疏水作用、親和層析,對(duì)層析介質(zhì)的要求是流速快、載量大。66

中間純化(intermediatestep)

進(jìn)一步純化目標(biāo)蛋白,去除那些在分子大小、理化性質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)類(lèi)似的雜質(zhì),通常采用與富集時(shí)不同的層析技術(shù),對(duì)分離介質(zhì)的要求是選擇性好(分辨率高)、載量大,通常應(yīng)用顆粒較小的介質(zhì)。67精制(polishingstep)最終去除那些痕量雜質(zhì),達(dá)到產(chǎn)品的純度要求,凝膠過(guò)濾是這一步中經(jīng)常使用的層析技術(shù),對(duì)分離介質(zhì)的要求集中在高選擇性上。68蛋白質(zhì)層析介質(zhì)存在問(wèn)題目前通用型介質(zhì)大都采用瓊脂糖這類(lèi)軟基質(zhì),填料的耐壓性較差,易變形而破碎,而且不耐酸,使用壽命無(wú)法和聚合物類(lèi)型的介質(zhì)相比。69動(dòng)力學(xué)性能遠(yuǎn)不如膜分離技術(shù),尤其在大分子蛋白質(zhì)分離過(guò)程中。傳統(tǒng)層析介質(zhì)由于其內(nèi)擴(kuò)散的速度相對(duì)膜分離緩慢，因此介質(zhì)內(nèi)的功能基團(tuán)無(wú)法被充分利用,工作交換(吸附)容量有限由于蛋白質(zhì)大分子的擴(kuò)散慢,層析時(shí)間較長(zhǎng)和洗脫液體積較大,影響效率。70越來(lái)越多的人工合成或復(fù)合型的剛性材料被開(kāi)發(fā)出來(lái),提供了高流速、高選擇、高載量及可操作性的介質(zhì),是未來(lái)蛋白質(zhì)層析介質(zhì)發(fā)展的趨勢(shì)。71對(duì)策用低價(jià)、生物相容性好的基質(zhì)材料制備層析介質(zhì)。多糖類(lèi)的天然高分子材料可以作為介質(zhì)的基質(zhì),如纖維素、殼聚糖。由于價(jià)廉和生物相容性好的兩大優(yōu)點(diǎn)可以取代瓊脂糖成為蛋白質(zhì)分離的理想填料。也可將它們和其它聚合物涂層或混融制備填料基質(zhì)。72良好的致孔技術(shù)

研制多種類(lèi)的致孔劑介質(zhì)的動(dòng)力學(xué)性能取決于內(nèi)部的孔結(jié)構(gòu),只有擁有均勻的、大小合適的孔徑分布才能有好的動(dòng)力學(xué)性能,才能最大限度發(fā)揮填料的交換(吸附)作用和選擇性能。73開(kāi)發(fā)大顆粒的耐壓性能好的全合成聚合物顆粒的增大提高了流速,給大規(guī)模生產(chǎn)操作帶來(lái)極大的便利,相應(yīng)的設(shè)備投資可以大大降低,在具備良好的孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上還要保證介質(zhì)具有耐壓的性能。74離子交換樹(shù)脂在食品工業(yè)中的應(yīng)用

樹(shù)脂用于制糖工業(yè)已有30多年的歷史。蔗糖、甜菜糖、葡萄糖等在制造中都需要脫除色素。糖液中的色素種類(lèi)很多，其中多以有機(jī)陰離子或兩性離子存在，用大孔氯型強(qiáng)堿陰離子樹(shù)脂可有效