常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用級臨床醫(yī)學(xué)

常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及其應(yīng)用級臨床醫(yī)學(xué)第一頁，共二十五頁，2022年，8月28日概述(一)分子雜交與印跡技術(shù)在DNA復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過程稱為印跡技術(shù)。第二頁，共二十五頁，2022年，8月28日(二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）

PCR技術(shù)在基因診斷中已得到廣泛應(yīng)用。在應(yīng)用中，PCR常與其它技術(shù)如分子雜交，限制酶酶譜分析，單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測，限制性片段長度多態(tài)性分析，DNA序列測定等聯(lián)合應(yīng)用。（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性

單鏈構(gòu)象多態(tài)性（singlestrandconformationpolymorphism,sscp）檢測是一種基于單鏈DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法，常與PCR聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR—SSCP技術(shù)。第三頁，共二十五頁，2022年，8月28日（四）限制酶酶譜分析基因突變可能導(dǎo)致基因上某一限制酶位點的丟失或其相對位置發(fā)生改變，以此酶消化待測DNA和野生型對照DNA，通過比較二者的酶切片段的長度、數(shù)量上的差異就可判斷待測DNA的突變情況。（五）DNA序列測定

DNA序列測定是進(jìn)行基因突變檢測的最直接、最準(zhǔn)確的方法，可以確定突變的部位的突變的性質(zhì)。（六）DNA芯片技術(shù)應(yīng)用DNA芯片，可以檢測基因的結(jié)構(gòu)及其突變多態(tài)性，對基因表達(dá)的情況進(jìn)行分析。第四頁，共二十五頁，2022年，8月28日第一節(jié)分子雜交與印跡技術(shù)、探針技術(shù)

第五頁，共二十五頁，2022年，8月28日一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理第六頁，共二十五頁，2022年，8月28日在DNA變性后的復(fù)性過程中，如果將不同種類的DNA單鏈分子或RNA分子放在同一溶液中，只要兩種單鏈分子之間存在著一定程度的堿基配對關(guān)系，在適宜的條件（溫度及離子強(qiáng)度）下，就可以在不同的分子間形成雜化雙鏈(heteroduplex)。這種雜化雙鏈可以在不同的DNA與DNA之間形成，也可以在DNA和RNA分子間或者RNA與RNA分子間形成。這種現(xiàn)象稱為核酸分子雜交。核酸分子雜交(hybridization)第七頁，共二十五頁，2022年，8月28日(一)印跡技術(shù)將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過程稱為印跡技術(shù)（blotting）。第八頁，共二十五頁，2022年，8月28日分子印跡(漬)的概念。將凝膠中的DNA片段變性使其成為單鏈，然后再將一張硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜放在凝膠上，上面放上吸水紙巾，利用毛細(xì)管作用原理使DNA片段轉(zhuǎn)移到NC膜上，使之成為固相化分子。載有DNA單鏈分子的NC膜就可以在雜交液與另一種帶有標(biāo)記的DNA或RNA分子(即探針)進(jìn)行雜交，具有互補序列的RNA或DNA結(jié)合到存在于NC膜的DNA分子上，經(jīng)放射自顯影或其他檢測技術(shù)就可以顯現(xiàn)出雜交分子的區(qū)帶。由于這種技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱為印跡技術(shù)。第九頁，共二十五頁，2022年，8月28日(二)探針技術(shù)第十頁，共二十五頁，2022年，8月28日

探針(probe)

一小段用同位素、生物素或熒光染料標(biāo)標(biāo)記其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸，與固定在NC膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。因此印跡技術(shù)與探針技術(shù)往往同時使用。第十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日

分子雜交、印跡技術(shù)、探針技術(shù)實驗①②③目錄第十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用DNA印跡技術(shù)

(Southernblotting)

RNA印跡技術(shù)

(Northernblotting)

蛋白質(zhì)的印跡分析

(Westernblotting)

第十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日(一)DNA印跡技術(shù)(Southern印跡法)

DNA印跡技術(shù)是最經(jīng)典的基因分析方法，不但能檢出特異的DNA片段，而且能進(jìn)行定位和測定分子量，可用于:

基因的酶切圖譜分析、基因突變分析、基因組基因的定性及定量分析、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)等。為了紀(jì)念Southern先生，以其姓氏稱DNA印跡技術(shù)為Southernblotting(Southern印跡法)。第十四頁，共二十五頁，2022年，8月28日(二)RNA印跡技術(shù)(Northernblotting)

用于組織細(xì)胞中總RNA或mRNA的定性和定量分析。其基本原理與DNA印跡技術(shù)類似。第十五頁，共二十五頁，2022年，8月28日(三)蛋白質(zhì)的印跡分析(Westernblotting)

用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。

第十六頁，共二十五頁，2022年，8月28日三種印跡技術(shù)第十七頁，共二十五頁，2022年，8月28日放射自顯影照片目錄第十八頁，共二十五頁，2022年，8月28日第二節(jié)

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的原理與應(yīng)用第十九頁，共二十五頁，2022年，8月28日1993年美國科學(xué)家穆利斯(K.Mullis)因發(fā)明“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”法，在遺傳領(lǐng)域研究中取得突破性成就、加拿大籍英裔科學(xué)家史密斯因開創(chuàng)“寡聚核甙酸基定點誘變”方法而共同獲得諾貝爾化學(xué)獎。第二十頁，共二十五頁，2022年，8月28日問題的提出？在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴。

第二十一頁，共二十五頁，2022年，8月28日發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合酶—Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

第二十二頁，共二十五頁，2022年，8月28日一、PCR技術(shù)的工作原理PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；第二十三頁，共二十五頁，2022年，8月28日③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就