酶的作用機制

主要內容酶的活性部位影響酶催化效率的有關因素酶催化反應機制的實例酶活性的調節(jié)機制同工酶第一頁，共六十一頁。9.1、酶的活性部位（一）基本概念：酶的活性中心是指結合底物和將底物轉化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是相隔很遠的氨基酸殘基形成的三維實體。酶的活性中心包括兩個功能部位：結合部位和催化部位。1．結合部位（Bindingsite）酶分子中與底物結合的部位或區(qū)域一般稱為結合部位。此部位決定酶的專一性。2．催化部位（catalyticsite）酶分子中促使底物發(fā)生化學變化的部位稱為催化部位。此部位決定酶所催化反應的性質。第二頁，共六十一頁。（二）酶活性部位的特點1.活性中心只占酶分子總體積的很小一部分，往往只占整個酶分子體積的1%-2%。2.酶的活性部位是一個三維實體，具有三維空間結構。3.酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補的，而是在酶和底物的結合過程中，底物分子或酶分子、有時是兩者的構象同時發(fā)生了一定的變化后才互補的，此時催化基團的位置正好處在所催化底物鍵的斷裂和即將生成鍵的適當位置，這個動態(tài)辨認過程稱為誘導契合（induced-fit）.第三頁，共六十一頁。第四頁，共六十一頁。4.酶的活性部位位于酶分子表面的一個裂隙（crevice）內.裂隙內是一個相當疏水的環(huán)境，從而有利于同底物的結合。5.底物靠次級鍵較弱的力與酶結合。6.酶的活性部位具有柔性和可運動性第五頁，共六十一頁。（三）研究酶活性部位的主要方法酶分子側鏈基團的化學修飾法

1.非特異性共價修飾2.特異性共價修飾（DFP）3.親和標記（底物類似物，具有活潑的化學基團）X- 射線晶體衍射法：定點誘變法第六頁，共六十一頁。DFP的作用二異丙基氟磷酸第七頁，共六十一頁。9.2、影響酶催化效率的有關因素（一）底物和酶的鄰近效應（approximation）與定向效應（orientation）在酶促反應中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應叫做鄰近效應。定向效應：當專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導酶分子構象發(fā)生改變，使酶活性中心的相關基團和底物的反應基團正確定向排列，同時使反應基團之間的分子軌道以正確方向嚴格定位，使酶促反應易于進行。以上兩種效應使酶具有高效率和專一性特點。第八頁，共六十一頁。咪唑催化對-硝基苯酚乙酸酯的水解反應第九頁，共六十一頁。實驗結果表明，分子內咪唑基參與的水解反應速度比相應的分子間反應速度大24倍。說明咪唑基與酯基的相對位置對水解反應速度具有很大的影響。第十頁，共六十一頁。軌道定向(orbital-steering)假說示意圖第十一頁，共六十一頁。（二）底物的形變（distortion）酶-底物復合物形成時，酶分子構象發(fā)生變化，底物分子也常常受到酶的作用而發(fā)生變化，甚至使底物分子發(fā)生扭曲變形，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，有助于過度態(tài)的中間產(chǎn)物形成,從而降低了反應的活化能。第十二頁，共六十一頁。誘導契合模型與底物的形變第十三頁，共六十一頁。（三）酸堿催化（acid-basecatalysis）酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質子酸提供部分質子,或是通過質子堿接受部分質子的作用，達到降低反應活化能的過程。酸-堿催化是催化有機反應的最普遍有效的催化劑第十四頁，共六十一頁。廣義酸基團廣義堿基團（質子供體）（質子受體）酶分子中可作為酸堿催化的功能基團第十五頁，共六十一頁。影響酸堿催化反應的因素包括酸堿強度及質子傳遞的速率。His咪唑基的解離常數(shù)約6.0，咪唑基解離下來的質子濃度與水中的[H+]相近，在中性條件下，一半以酸形式存在，一半以堿形式存在;同時，咪唑基接受質子和供出質子的速率十分迅速，半衰期小于10-10秒。所以，His是酶中最有效最活潑的一個催化功能基團。第十六頁，共六十一頁。（四）共價催化（covalentcatalysis）催化劑通過與底物形成反應活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應活化能降低，從而提高反應速度的過程，稱為共價催化。酶中參與共價催化的基團主要包括以下親核基團：His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羥基等；親電子基團：H+、Mg2+、Mn2+、Fe3+某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。

第十七頁，共六十一頁。(五)金屬離子的催化作用１.需要金屬的酶分類：

（1）金屬酶－metalloenzyme:含緊密結合的金屬離子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+

（2）金屬-激活酶（metal-activatedenzyme）:含松散結合的金屬離子，如Na+K+Mg2+Ca2+2.金屬離子的催化作用：通過結合底物為反應定向。通過可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調節(jié)氧化還原反應。通過靜電穩(wěn)定或屏蔽靜電荷。第十八頁，共六十一頁。9.3、酶催化反應機制的實例（一）溶菌酶溶菌酶的生物學功能是催化某些細胞壁多糖的水解。X射線晶體結構分析法和競爭性抑制劑揭示了酶的活性部位。鍵張力導致與酶結合的底物特定位置的糖苷鍵穩(wěn)定性降低。溶菌酶催化機制是一個廣義的酸堿催化，Glu35和Asp52在催化過程中起了重要作用。Next第十九頁，共六十一頁。溶菌酶是一種葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之間的糖苷鍵，但不能水解NAGC1和NAMC4之間的β（1-4）糖苷鍵。Back第二十頁，共六十一頁。X射線晶體分析法揭示了溶菌酶的三維結構活性部位？第二十一頁，共六十一頁。(NAG)3是研究溶菌酶活性部位的良好競爭性抑制劑60000(NAG-NAM)330000(NAG)64000(NAG)58(NAG)41(NAG)30(NAG)2相對水解速率底物圖像分析表明，(NAG)3僅僅占據(jù)了半個狹縫，酶的最小底物應該是(NAG)6第二十二頁，共六十一頁。Back第二十三頁，共六十一頁。第4個糖殘基D環(huán)因空間原因必須由正常的椅式變形為能量較高的半椅式構象。因此糖苷鍵的穩(wěn)定性降低，鍵容易從此斷裂。Back第二十四頁，共六十一頁。H218O溶液中酶促水解底物(NAG)6的實驗證明酶切位點在D糖基的C1和E殘基的糖苷鍵的O之間。第二十五頁，共六十一頁。Glu35的-COOH提供一個H+到D與E之間的糖苷鍵O原子上。糖苷鍵斷開，形成正碳離子過渡態(tài)中間產(chǎn)物。Asp52對中間產(chǎn)物有穩(wěn)定作用。EF離開酶分子。正碳離子中間體與溶劑中的OH-反應，ABCD離開。同時Glu35質子化。Back第二十六頁，共六十一頁。（二）絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族的所有成員在其活性部位都含有Ser殘基，并且催化機制也相似。具有消化作用的絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。胰凝乳蛋白酶機制的動力學特征分?；兔擋；瘍刹?。Ser195的異常反應性與催化三聯(lián)體有關。絲氨酸蛋白酶的催化機制提供了一種典型的酸堿催化和共價催化的例子。第二十七頁，共六十一頁。絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶枯草桿菌蛋白酶凝血酶彈性蛋白酶纖溶酶組織纖溶酶原激活劑Back第二十八頁，共六十一頁。三種消化酶在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中通過胰蛋白酶水解除去部分肽鏈，轉變成活性酶形式。第二十九頁，共六十一頁。3個極性殘基：His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三聯(lián)體。第三十頁，共六十一頁。胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的底物結合口袋決定了各自的專一性。Back第三十一頁，共六十一頁。胰凝乳蛋白酶機制可以通過人工合成底物——簡單的有機酯進行研究。第三十二頁，共六十一頁。胰凝乳蛋白酶同乙酸－p－硝基苯酯反應的動力學曲線第三十三頁，共六十一頁。胰凝乳蛋白酶的機制分兩個階段：

第一步是乙酰復合體的形成，稱為?；饔谩５诙绞且阴秃象w通過水解再生為游離的酶，稱為脫酰作用。Back第三十四頁，共六十一頁。胰凝乳蛋白酶中的催化三聯(lián)體。Back第三十五頁，共六十一頁。絲氨酸蛋白酶的催化機制第三十六頁，共六十一頁。胰蛋白酶的催化機制Back第三十七頁，共六十一頁。9.4、酶活性的調控機制酶活性的調節(jié)可以通過改變其結構而使其催化活性發(fā)生改變，也可以通過改變其含量來改變其催化活性，還可以通過以不同形式的酶在不同組織中的分布差異來調節(jié)代謝活動。第三十八頁，共六十一頁。（一）酶結構的調節(jié)通過對現(xiàn)有酶分子結構的影響來改變酶的催化活性。這是一種快速調節(jié)方式。別構調控酶原激活共價調控Next第三十九頁，共六十一頁。別構調控酶分子的非催化部位與某些化合物非共價結合后發(fā)生構象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的別構調節(jié)（allostericregulation）。具有這種調節(jié)作用的酶稱為別構酶（allosericenzyme）。凡能使酶分子發(fā)生別構作用的物質稱為效應物（effector）或別構劑。因別構導致酶活性增加的物質稱為正效應物（positiveeffector）或別構激活劑，反之稱為負效應物（negativeeffector）或別構抑制劑。第四十頁，共六十一頁。當別構酶的一個亞基與其配體（底物或別構劑）結合后，能夠通過改變相鄰亞基的構象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應就稱為別構酶的協(xié)同效應。別構劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關鍵酶進行調節(jié)，常見的為負反饋調節(jié)。ABCDPE1E2E3En第四十一頁，共六十一頁。別構酶的基本性質別構酶一般是寡聚酶，通過次級鍵由多亞基構成。因別構酶有協(xié)同效應，故其[S]對v的動力學曲線不符合米氏方程。效應物可分為K型和V型兩種類型。別構酶經(jīng)加熱或化學試劑處理，可引起別構酶解離，失去調節(jié)活性，稱為脫敏作用。第四十二頁，共六十一頁。多亞基調節(jié)亞基催化亞基協(xié)同效應別構激活劑別構抑制劑正協(xié)同負協(xié)同Back第四十三頁，共六十一頁。別構酶的動力學[S]對v的動力學曲線不是雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負協(xié)同），兩者均不符合米氏方程。2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]V第四十四頁，共六十一頁。飽和比值（Rs）可用來鑒別不同的協(xié)同作用以及協(xié)同的程度。典型的米氏類型的酶Rs=81具有正協(xié)同效應的別構酶Rs<81，Rs正協(xié)同效應具有負協(xié)同效應的別構酶Rs>81，Rs負協(xié)同效應第四十五頁，共六十一頁。意義：在很小的濃度（底物、調節(jié)物）范圍內嚴格控制酶活力，因此是生物代謝中許多代謝途徑的關鍵酶。別構激活別構抑制V0[S]底物敏感區(qū)2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]VBack第四十六頁，共六十一頁。K型效應物和V型效應物BackK型V型第四十七頁，共六十一頁。別構模型齊變模型（WMC）別構酶的所有亞基，或全部呈堅固緊密的，不利于結合底物的“T”狀態(tài)，或者全部是松散的，有利于結合底物的"R"狀態(tài)，這兩種狀態(tài)間的轉變對于每個亞基都是同時的，齊步發(fā)生的。"T"狀態(tài)中亞基的排列是對稱的，變成"R"狀態(tài)后亞基的排列仍然是對稱的。適于解釋由底物調節(jié)的效應第四十八頁，共六十一頁。序變模型（KNF）酶分子中的亞基結合小分子物質（底物或調節(jié)物）后，亞基構象逐個地依次變化，因此亞基有各種可能的構象狀態(tài)。

非底物調節(jié)的效應用序變模式說明較好。Back第四十九頁，共六十一頁。酶原的激活處于無活性狀態(tài)的酶的前體物質就稱為酶原。酶原在一定條件下轉化為有活性的酶的過程稱為酶原的激活。酶原的激活過程通常伴有酶蛋白一級結構的改變。酶原分子一級結構的改變導致了酶原分子空間結構的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉變?yōu)橛谢钚缘拿?。舉例：消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活，凝血機制。第五十頁，共六十一頁。第五十一頁，共六十一頁。Back第五十二頁，共六十一頁。共價調控酶蛋白分子中的某些基團可以在其他酶的催化下發(fā)生共價修飾，從而導致酶活性的改變，稱為共價修飾調