胰臟中胰島素的分離提取背景知識

項目一：豬胰臟中胰島素的提取1.1胰臟中胰島素的分離提取背景知識

1.1.1胰島素結(jié)構(gòu)及來源1.1.2胰島素分類1.1.3胰島素重大研究發(fā)展歷程1.1.4胰島素性質(zhì)胰島素是一種蛋白質(zhì)類激素，體內(nèi)胰島素是由胰島β細(xì)胞分泌的。胰島素是由胰島β細(xì)胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的激動而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素的一級結(jié)構(gòu)

由51個氨基酸殘基組成

分兩條鏈：A鏈：21個氨基酸殘基

B鏈：30個氨基酸殘基含三個二硫鏈：一個A鏈內(nèi)的二硫鍵兩個鏈間二硫鍵1.1.1胰島素結(jié)構(gòu)及來源表：一些哺乳動物胰島素一級結(jié)構(gòu)的差異名稱A8

A9A10B30與人的差異數(shù)活性人蘇氨酸絲氨酸異亮氨酸蘇氨酸-

豬--

丙氨酸1

抹香鯨--

丙氨酸1

馬-甘氨酸

丙氨酸2↓象-甘氨酸纈氨酸

2↓牛丙氨酸-纈氨酸丙氨酸3↓在各種動物的胰臟中，胰島素的含量有些差異，牛、豬、馬、羊新鮮胰臟組織中分別含有胰島素2.5、3.0、1.5、10U/g。同一種動物不同發(fā)育階段，其含量也有較大差別。目前開發(fā)應(yīng)用的胰島素品種很多，有多種分類方法。胰島素制劑可根據(jù)胰島素來源、制備工藝、作用時間長短等來進(jìn)行分類。1、按來源分類：豬胰島素、牛胰島素、人胰島素2、根據(jù)制備工藝分類：提取胰島素、半合成胰島素、生物合成人胰島素及人胰島素類似物（長秀霖、速秀霖）3、按純度分類：普通胰島素（結(jié)晶胰島素）、單峰胰島素及單組分胰島素（高純度胰島素）。4、按起效時間分類：速效胰島素、中效胰島素、長效胰島素及混合胰島素。5、根據(jù)制劑性狀分類：溶液型和混懸腥。6、根據(jù)給藥裝置分類：注射式和非注射式。1.1.2胰島素分類可植入閉環(huán)式泵由于更接近正常人體的胰島素分泌并能克服開環(huán)式泵需24h體外隨身攜帶等缺點，已成為該制劑的研發(fā)方向，其關(guān)鍵是如何突破血糖傳感器生物兼容性等技術(shù)關(guān)鍵要使口服藥成為現(xiàn)實的關(guān)鍵在于制備過程中如何保持其生理活性，穩(wěn)定胰島素的構(gòu)型，如何減少胰島素分子多聚體的形成，促進(jìn)胰島素在小腸的吸收，如何減輕消化酶對胰島素的破壞作用，以及如何選擇有機(jī)溶劑從而減少胃腸道的毒副作用。1788年人們就發(fā)現(xiàn)了糖尿病的產(chǎn)生于胰功能的破壞有密切關(guān)系；1922年起，開始將胰臟中獲得的胰島素應(yīng)用于臨床；1926年首次從動物胰臟中提取到胰島素結(jié)晶。是第一個有生物活性的蛋白質(zhì)結(jié)晶；1955年闡明胰島素序列的一級結(jié)構(gòu)；1965年9月17日，中國首次完整人工合成了結(jié)晶牛胰島素；1970年用X衍射方法闡明了空間構(gòu)型，為人工合成蛋白質(zhì)、探索生命奧秘做出了重大貢獻(xiàn)；1982年世界上第一個生物技術(shù)醫(yī)藥產(chǎn)品——DNA重組人胰島素上市，也是第一個基因工程藥物產(chǎn)品。1.1.3胰島素重大研究發(fā)展歷程1)用基因工程大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)分別發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素(humaninsulin,hI)的A、B鏈,然后經(jīng)化學(xué)再氧化法,使兩條鏈在一定條件下重新形成二硫鍵,得到hI。這一方法缺點較多,目前已較少使用。2)用基因工程E.coli發(fā)酵生產(chǎn)人胰島素原(humanproinsulin,hPI),后經(jīng)加工形成hI。E.coli系統(tǒng)表達(dá)量高,但缺點是不利于表達(dá)hI這樣的小蛋白,產(chǎn)物易降解,故常采用融和蛋白形式將hPI連接在一個較大的蛋白質(zhì)后,表達(dá)產(chǎn)物需經(jīng)過一系列復(fù)雜的后加工才能形成有活性的hI;3)通過基因工程酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)hPI,經(jīng)后加工形成hI。酵母系統(tǒng)下游后加工比細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)簡單,但缺點是生產(chǎn)慢,生產(chǎn)周期長,且重組蛋白分泌量少(1～50mg/L),產(chǎn)量低。

目前,國際上生產(chǎn)醫(yī)用重組人胰島素(recombinanthumaninsulin,rhI)的方法主要有3種:1.1.4胰島素性質(zhì)胰島素為白色或類白色粉末結(jié)晶。由于精制方法不同，在顯微鏡下觀察，可分兩種形態(tài)，一種為不規(guī)則細(xì)微顆粒，稱“無定型”，另一種為扁斜型六面體。牛胰島素分子量為5733，豬胰島素分子量為5761，人胰島素分子量為5781。胰島素等電點為5.30-5.35,。因蛋白質(zhì)等電點隨溶液的離子強度及離子性質(zhì)不同而有所變化，因此在生產(chǎn)實踐中分離，精制或結(jié)晶時采用的等電點并不一定正好是此值。胰島素在pH為4.5-6.5范圍內(nèi)，幾乎不溶水，在室溫下溶解度為10μg/mL；易溶于稀酸或稀堿溶液；在80%以下乙醇或丙酮中溶解；在90%以上乙醇或80%以上丙酮中難溶；在乙醚中不溶。胰島素具有蛋白質(zhì)的各種特殊反應(yīng)：高濃度的鹽（如飽和氯化鈉、半飽和硫酸銨溶液）可使其沉淀析出，也能被蛋白質(zhì)沉淀劑和三氯醋酸等沉淀，并有茚三酮、雙縮脲等蛋白質(zhì)的顯色反應(yīng)。胰島素能被胰島酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白水解酶水解而失活。因胰島素通常只能注射給藥。即使這樣，在血液和組織中也能被水解，所以藥物作用時間較短。當(dāng)與魚精蛋白或珠蛋白形成復(fù)合物或制成難溶解的結(jié)晶，即能延長藥效。

美國基因工程技術(shù)公司，簡稱基因泰克，是由風(fēng)險投資家RobertA.Swanson和生物化學(xué)家HerbertBoyer博士于1976創(chuàng)立的生物技術(shù)公司，被認(rèn)為是生物技術(shù)行業(yè)的創(chuàng)始者。創(chuàng)始人Boyer博士，是DNA重組技術(shù)先驅(qū)者。1973年，Boyer和同事StanleyCohen用限制酶從DNA分子剪下需要的片段連接到質(zhì)粒上。1977年，公司制造出荷爾蒙生長抑制素；1978年，公司合成了人類胰島素。1980年，基因工程技術(shù)公司上市，一個小時內(nèi)每股從35美元劇漲至88美元，公司的身價因此激增至3500萬美元。這一事件是股市漲幅最大的案例之一。1982年，第一種DNA重