本科畢業(yè)答辯PPT

學(xué)生姓名：胡云杰專業(yè)班級：生科1102班指導(dǎo)教師：曹小勇

2015屆學(xué)士學(xué)位論文答辯報告材料與方法摘要

一二引言

結(jié)果與分析討論三四五摘要1★目的

本研究以西洋參成熟種胚為材料，評價麥草畏對體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響，確定麥草畏在西洋參體細(xì)胞胚胎發(fā)生中的作用，為西洋參快繁積累相關(guān)資料。★方法

以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加(0.05-2)mg/L麥草畏，0.5mg/L2,4-D以及0.5mg/L2,4-D+0.5mg/L麥草畏組成八組培養(yǎng)基，對西洋參成熟種胚進(jìn)行離體培養(yǎng)。★結(jié)果

材料培養(yǎng)40天后，在MS培養(yǎng)基上未形成愈傷組織及胚狀體；在附加不同濃度麥草畏的培養(yǎng)基上，都能誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體，其中1mg/L麥草畏的效果最佳，愈傷率為94.34%，胚狀體發(fā)生率為56.60%；在添加0.5mg/L2,4-D的培養(yǎng)基上愈傷組織和胚狀體發(fā)生率均為100%；在添加0.5mg/L麥草畏和0.5mg/L2,4-D的混合培養(yǎng)基上，愈傷組織和胚狀體發(fā)生率分別為95%,80%。

★結(jié)論麥草畏可以誘導(dǎo)西洋參成熟種胚形成愈傷組織和胚狀體，其中1mg/L麥草畏的誘導(dǎo)效果最佳，但是效果不及2,4-D，在與2,4-D混合使用時對比2,4-D單獨使用的效果，也有所降低。

西洋參（Americanginseng）又名花旗參、美國參，系五加科人參屬多年生草本植物，原產(chǎn)于美國和加拿大。它含有多種生理活性物質(zhì)，如西洋參皂苷、多糖、黃酮類、揮發(fā)油、微量元素等，其中屬西洋參皂苷的生理活性最為顯著。西洋參還具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)驚、安神促智、抗心律失常、抗休克、保護(hù)心肌、防血管硬塞、降血脂、增強機體免疫功能、抗應(yīng)激、抗腫瘤、保肝的藥理作用。我國自1975年10月開始有計劃地引種西洋參，目前已形成了四大生態(tài)氣候栽培區(qū)：東北栽培區(qū)、華北栽培區(qū)、華中栽培區(qū)和康滇栽培區(qū)。隸屬于華中栽培區(qū)的陜西漢中地區(qū)從1978年引種栽培，獲得成功。西洋參生長緩慢,對生長環(huán)境要求嚴(yán)格，栽培技術(shù)復(fù)雜，存在種胚后熟現(xiàn)象，在自然狀態(tài)下需要長達(dá)20-22個月才能打破休眠，常規(guī)育種方法很難滿足生產(chǎn)上的需求。到目前為止人們在西洋參的組織培養(yǎng)及體細(xì)胞胚胎發(fā)生方面已經(jīng)做了較為深入和系統(tǒng)的研究，但至今尚未確立穩(wěn)定的西洋參快速繁殖體系。如果與常規(guī)育種方法相結(jié)合，通過離體培養(yǎng)技術(shù)，建立體細(xì)胞胚胎發(fā)生的無性繁殖系，在細(xì)胞和組織水平上進(jìn)行抗病等抗性育種，就可以縮短育種年限，加快育種進(jìn)程。引言2

材料與方法33.1材料本實驗的研究材料為西洋參成熟種胚。于2014年11月初，經(jīng)留壩縣科技局中藥辦協(xié)助，從陜西省漢中市留壩縣西洋參種植基地購得。經(jīng)過沙藏層積處理，大部分種子已經(jīng)出現(xiàn)裂口。SW-CJ-IF超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)、YXQ-IL-50高壓蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SR-1607C型電磁爐（尚明堂電器有限公司）、FA-2004N型電子天平、NikonSM2800體視顯微鏡、NikonE600顯微鏡、SONYdsc-h3數(shù)碼相機、培養(yǎng)架、冷藏冷凍箱等。酒精燈、錐形瓶、容量瓶、量筒、燒杯、玻璃棒、移液管、膠頭滴管、pH試紙、封口膜、廣口瓶、鑷子、解剖刀、解剖針、培養(yǎng)皿、陶瓷杯、稱量瓶、濾紙等。瓊脂、蔗糖、2,4-D、麥草畏、有機物、Fe鹽、大量元素、微量元素、純凈水、NaOH（1.0mol/L）、HCl（1.0mol/L）、0.1%的升汞溶液、75%的酒精等3.2實驗儀器、用具及試劑3.3方法3.3.1種子消毒在沙藏的容器中選取飽滿已經(jīng)裂口的種子，剝?nèi)シN皮后，取實驗材料置于紗網(wǎng)袋用洗滌劑清洗，自來水流水沖洗2個小時。帶入超凈工作臺，75%酒精處理10s，再用0.1%升汞處理8min，進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水漂洗4次，快速分裝到無菌培養(yǎng)皿中。3.3.2培養(yǎng)基本實驗以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基,添加3％蔗糖、0.6％瓊脂，附加不同種類的植物激素（表1.1），pH值為5.8，在121.0℃、1.1kg/cm2的高溫高壓下滅菌20min。3.3.3接種將上述準(zhǔn)備好的種子切取其種胚，分別接種到八種培養(yǎng)基上，每瓶接種3-4個外植體。置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)。3.3.4培養(yǎng)條件溫度：25±1℃；光培養(yǎng)：光照強度1000～1500Lux，16h/d。3.3.5觀察與記錄定期觀察，并做好數(shù)據(jù)統(tǒng)計。7天、10天、20天、40天時，對接種情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)有愈傷組織或胚狀體形成時，進(jìn)行計數(shù)并做好記錄。3.3.6實驗參數(shù)的計算方法愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)∕接種外植體數(shù)×100%胚狀體發(fā)生率=產(chǎn)生胚狀體的外植體數(shù)∕接種外植體數(shù)×100%結(jié)果與分析4

接種后7天觀察發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基中大部分子葉開始膨大、變綠，胚軸也有所增粗，并且發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中有少量成熟種胚發(fā)生污染，其主要原因為滅菌不徹底和接種時細(xì)菌污染。10天后觀察，發(fā)現(xiàn)各培養(yǎng)基中成熟種胚胚軸開始伸長，長出胚芽，并伴有少量褐化現(xiàn)象，但不明顯。除了麥草畏濃度0.05mg/L和0.1mg/L的培養(yǎng)基上未發(fā)現(xiàn)愈傷外，其他濃度的培養(yǎng)基上均有一定量的種胚在子葉邊緣和胚軸基部開始出愈。20天后2,4-D培養(yǎng)基中90%種胚出愈，麥草畏濃度（0.5-2）mg/L培養(yǎng)基中出愈率進(jìn)一步提高，0.05mg/L和0.1mg/L培養(yǎng)基中仍未發(fā)現(xiàn)出愈。40天后觀察，愈傷組織上有胚狀體形成，且愈傷組織變大，質(zhì)地變得疏松，胚狀體變得明顯，每個外植體上的胚狀體數(shù)量增多。并且有觀察到胚狀體的兩種發(fā)生方式：①直接在外植體上發(fā)生；②先產(chǎn)生愈傷組織，愈傷組織再分化形成（圖f、g）。40天后西洋參成熟種胚愈傷組織和胚狀體的形成情況統(tǒng)計表（表2.1）。

表2.140天西洋參成熟種胚的愈傷組織和胚狀體發(fā)生情況

在未添加任何激素的1號MS空白培養(yǎng)基中，接種7d后，均可見子葉展開，膨大變綠，胚軸有所增粗。40天后，可見子葉卷曲衰老，胚軸胚根均有所伸長，且出現(xiàn)大量褐化現(xiàn)象。隨后繼續(xù)觀察，最終未能發(fā)現(xiàn)愈傷組織及胚狀體出現(xiàn)。(圖a)在添加0.5mg/L2,4-D的培養(yǎng)基中，7d后外植體開始萌動，子葉膨大變綠，邊緣卷曲，胚軸增粗。10d左右在胚軸基部以及子葉邊緣附近產(chǎn)生愈傷組織。培養(yǎng)30天后，整片子葉及胚軸基部都有愈傷組織生成，愈傷組織質(zhì)地緊密，色澤鮮艷，生長旺盛。同時出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，但和1號培養(yǎng)基相比程度較輕。培養(yǎng)40天后，所有外植體均已愈傷化，且愈傷組織大多呈疏松狀，部分愈傷組織表面有點狀白色突起出現(xiàn)，經(jīng)顯微觀察，認(rèn)為是胚狀體的早期形態(tài)(圖b）。繼續(xù)培養(yǎng)有胚狀體的發(fā)生，發(fā)生率可達(dá)100%。在添加麥草畏的培養(yǎng)基中，接種7d后，均可見到并攏的子葉開始分開，膨大增厚變綠，胚軸增粗。14天后，胚芽萌發(fā)，胚軸胚芽開始伸長。20天前后，胚芽進(jìn)一步伸長，并且出現(xiàn)少量褐化現(xiàn)象，但不明顯(圖c)。在2mg/L麥草畏的培養(yǎng)基上，在成熟種胚的子葉節(jié)及子葉邊緣處最先觀察到有明顯的淺黃色愈傷組織形成，且質(zhì)地緊密（圖d）。40天前后，大部分外植體均已愈傷化。在子葉接觸培養(yǎng)基的部位最易觀察到愈傷組織，且在子葉的不同部位，還可見一種白色致密膨大突起，這種白色膨大突起可能就是楊振堂等提出的白色致密型的愈傷組織，完整種胚中形成的愈傷組織多為此種致密型愈傷(圖e)。繼續(xù)培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)部分愈傷組織表面出現(xiàn)肉眼可見的胚狀體，有的成簇狀，也有的單個存在（圖f、g）。總的來看，麥草畏在西洋參成熟種胚愈傷組織和胚狀體的發(fā)生方面有著與2,4-D相似的效果，不同濃度的麥草畏，最終均能不同程度的誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體。在一定濃度范圍內(nèi)，愈傷率和胚狀體發(fā)生率隨激素濃度的升高而增大，1mg/L時達(dá)到最大,愈傷率為94.34%、胚狀體發(fā)生率56.60%。在此之后隨激素濃度的升高而減小。在添加0.5mg/L麥草畏+0.5mg/L2,4—D的混合培養(yǎng)基中，成熟種胚的萌發(fā)最快，效果最好。20天后可見，子葉明顯膨大變綠且增厚，胚芽明顯伸長。而且，愈傷組織和胚狀體的發(fā)生也是最早的，在20天前后，就可觀察到，部分外植體的子葉在接觸培養(yǎng)基的部位有少量愈傷組織和早期的胚狀體發(fā)生。（圖h）40天后，大部分外植體均愈傷化，且愈傷明顯，胚狀體明顯，愈傷率為95%、胚狀體發(fā)生率80%。理論意義和應(yīng)用價值2參考文獻(xiàn)[1]GiustiMM,WrolstadRE.Acylatedanthocyaninsfromediblesourcesandtheirapplicationsinfoodsystem[J].BiochemicalEngineeringjournal,2003,4:217-225.[2]于東,陳桂新,方忠祥.花青苷提取、分離純化及鑒定的研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,33(3):127-133.[3]孫建霞,張燕,孫志健等.花青苷的資源分布以及定性定量分析方法研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2009,30(5):263-268.[4]劉鄰渭,食品化學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1998,116-121.[5]盧其能,楊清.馬鈴薯花色苷研究進(jìn)展[J].北方園藝,2007(9):54-57.[6]龐志申.花色苷研究概況[J].北京農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,18(5):37-42.[7]JansenG,FlammeW.Colouredpotatoes(SolanumtuberosumL.)-anthccyanincontentandtuberquality[J].GeneticReourcesandCropEvolution,2006,53:1321-1331.[8]BrownCR,WrolstadR,DurstR,eta1,Breedingstudiesinpotatoescontaininghighconcentrationsofanthocyanins.AirierJofPotatoRes,2003,80:241-250.[9]Castaneda-OvandoA,Pacheco-HernandezMD,Paez-HernandezM,etal.Chemicalstudiesofanthocyanins:Areview[J].FoodChemistry,2009,113(4):859-871.[10]王杉,鄧澤元,曹樹穩(wěn).紫薯色素的研究進(jìn)展[J].糧油食品科技,2004,12(2);45-46.[11][12]房巖強,劉建壘,劉聰?shù)?紫色馬鈴薯花色苷的提取及性質(zhì)研究[J]中國糧油學(xué)報,2009,24,(8):130-137[13]楊玲,劉利軍,蒙春梅.紫羅蘭馬鈴薯花青素的提取及穩(wěn)定性研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(6):250-256.[14]姜莉,李志華,張正茂等.馬鈴薯紫色素的提取及穩(wěn)定性研究[J].食品工技,2009,30(6):265-270.[15]李作平,霍長虹.大孔吸附樹脂在水溶性天然藥物化學(xué)成分提取分離中的應(yīng)用.河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報.2002,23(2):121-123.[16]李伯庭,王湘,李小進(jìn).大孔吸附樹脂在天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用[J].中草藥,1990,2(8),42-44．[17]OuShiyi,LuoYanlin,XueFeng.Seperationandpurificationofferulicacidinalkaline-hydrolysatefromsugarcanebagassebyactivatedcharcoaladsorption/anionmacroporousresinexchangechromatography[J].FoodEngineering,2006,7(4);1298～1304.[18]朱洪梅,韓永斌,顧振新等.大孔樹脂對紫甘薯色素的吸附與解吸特性研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,006,22(5);153-156.[19]BrownCR,WrolstadR,DurstReta1,Breedingstudiesinpotatoescontaininghighconcentrationsofanthocyanins.[J].PotatoRes.80:241-249.[20]HayashiK,MoriM,KnoxYMeta1,Antiinfluenzavirusactivityofared-fleshedpotatoanthocyanin.FoodScienceandTechnologyResearch[J].2003,9(3):242-244.[21]HanKH,HashimotoN,HashimotoMeta1,RedpotatoextractprotectsfromD-galactosamine-inducedliverinjuryinrats.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry[J].2007,70(9):2285-2288.[22]張超,馬越,趙曉燕,等.高效液相色譜-質(zhì)譜法測定紫色馬鈴薯花色苷組成[J].食品工業(yè)科技,2011,33(7):417-422.[23]Rodriguez-SaonaLE,GiustiMM,WrolstadRE.Anthocyaninpigmentcompositionofred-fleshedpotatoes[J].JournalofFoodScience,1998,63(3):458-465[24]FossenT,stedalDO,SlimestadR,etal.AnthocyaninsfromaNorwegianpotatocultivar［J］.FoodChemistry,2003,81:433-437.二、主要研究內(nèi)容和實驗方案主要研究內(nèi)容1（1）紫色馬鈴薯花青苷提取工藝研究

①紫色馬鈴薯花青苷含量的測定；②料液比、乙醇濃度、Ph、提取時間及提取溫度的確定；③紫色馬鈴薯花青苷提取的工藝的優(yōu)化；（2）紫色馬鈴薯花青苷純化工藝研究①最佳大孔樹脂比較篩選；②靜態(tài)吸附和洗脫優(yōu)化；③動態(tài)吸附和洗脫優(yōu)化；（3）紫色馬鈴薯花青苷組分定性及定量量研究①樣品前處理方法研究；②質(zhì)譜條件的優(yōu)化；③色譜條件的優(yōu)化；④花青苷組分分析；⑤花青苷含量分析；2擬解決的關(guān)鍵問題及創(chuàng)新之處2（1）擬解決的關(guān)鍵問題①紫色馬鈴薯花青苷最佳提取條件的確定；②紫色馬鈴薯花青苷的分離純化工藝參數(shù)的確定；③紫色馬鈴薯花青苷分析檢測方法的建立；④紫色馬鈴薯花青苷中組分及含量的分析；（2）創(chuàng)新之處①通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗，對我國紫色馬鈴薯品種“黑金剛”花青苷提取純化工藝條件優(yōu)化，獲得制備高純度紫色馬鈴薯花青苷的最佳提取純化工藝參數(shù)。

②首次應(yīng)用超高效液相—三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對我國紫色馬鈴薯花青苷組分定性定量分析研究。技術(shù)路線3提取、離心馬鈴薯清洗、切片、干燥、粉碎浸膏薯粉薯粉花青苷提取液純品馬鈴薯花青苷單組分含量待測樣純化、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、真空干燥濃縮溶解uplc檢測加工原料圖1紫色馬鈴薯花青苷提取純化及組分研究技術(shù)路線圖2擬采用的方法和手段處4（1）紫色馬鈴薯花青苷的提取工藝研究采用酸性乙醇回流提取法對紫色馬鈴薯進(jìn)行花青苷類物質(zhì)的提取，以得率為響應(yīng)值，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到紫色馬鈴薯花青苷提取的最佳工藝參數(shù)（2）紫色馬鈴薯花青苷純化工藝研究對五種大孔樹脂進(jìn)行試驗篩選，選擇較優(yōu)大孔樹脂對紫色馬鈴薯花青苷分別靜態(tài)吸附解吸附和動態(tài)吸附解吸附條件研究，確定最佳純化工藝條件。（3）紫色馬鈴薯花青苷組分定性定量研究對紫色馬鈴薯花青苷提取液干燥濃縮，用6%甲酸水溶液溶解定容于25ml容量瓶，0.4um水系濾膜過濾后進(jìn)樣，綜合色譜保留時間，質(zhì)譜分析以及相關(guān)參考文獻(xiàn)對花青苷組分和含量進(jìn)行分析鑒定。實驗方案5（1）紫色馬鈴薯花青苷提取工藝技術(shù)研究①料液比、乙醇濃度、PH及提取溫度、提取時間的確定：根據(jù)花青苷得率確定最佳提取工藝。

②響應(yīng)面試驗：根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用響應(yīng)面法，優(yōu)化花青苷提取工藝參數(shù)。③驗證試驗：對響應(yīng)面實驗的結(jié)果進(jìn)行驗證，確定紫色馬鈴薯花青苷最佳工藝參數(shù)。①大孔樹脂的篩選和預(yù)處理對花青苷的性質(zhì)、樹脂的極性、比表面積、平均孔徑及生產(chǎn)經(jīng)驗等多方面加以考察，預(yù)篩選了D101、HDP100A、HDP450A、NK-9、AB-85種樹脂并進(jìn)行比較篩選實驗，選擇分離效果最好實驗用的樹脂。②靜態(tài)吸附、解吸附研究量取一定量預(yù)處理后的優(yōu)選樹脂于三角瓶中，加入一定花青苷溶液，充分?jǐn)嚢杳扛粢欢〞r間測量色素液吸光值，分別考察花青苷溶液液濃度、PH對吸附的影響。量取一定量吸附飽和的優(yōu)選樹脂于三角瓶中，加入一定量的酸性乙醇溶液液，充分?jǐn)嚢杳扛粢欢〞r間測量花色溶苷液吸光值，分別考察乙醇濃度/PH對解吸附的影響。③動態(tài)態(tài)吸附、解吸附研究量取一定量預(yù)處理后的優(yōu)選樹裝濕法裝柱，將花青苷溶液以一定流速通過柱，每10ml收集一次，測定其吸光值，考察不同吸附流速對吸附的影響；再用酸性乙醇溶液以不同流速洗脫，每2ml收集一次，測定其吸光值，考察不同洗脫流速對洗脫的影響。④純化效果測定選用1cm比色皿,在紫外-可見分光光度計上在其最大吸波長收處的測ABS值,以公式E=AR/m計算出色價，并進(jìn)行純化效果比較。（2）紫色馬鈴薯花青苷純化工藝研究（3）紫色馬鈴薯花青苷的組成成分分析

①紫色馬鈴薯花青苷定性分析：采用UPLC/MS-MS對紫色馬鈴薯花青苷提取液進(jìn)行全掃描分析,對圖中的主要峰進(jìn)行質(zhì)譜分析得到含有不同質(zhì)核比的準(zhǔn)分子離子峰。根據(jù)準(zhǔn)分子離子峰的質(zhì)譜分析分別對這些準(zhǔn)分子離子進(jìn)行子離子掃描，并對得到的子離子碎片進(jìn)行分析，,綜合色譜保留時間，質(zhì)譜分析以及相關(guān)研究對花青苷組分和含量進(jìn)行分析鑒定。

②紫色馬鈴薯花青苷定量分析：以牽?；ㄋ?3-