藥物代謝課件

藥物代謝大綱藥物代謝反應(yīng)簡介影響藥物代謝的因素代謝穩(wěn)定性代謝產(chǎn)物的鑒定代謝途徑鑒定CYP450的抑制及誘導肝清除率的預測藥物代謝反應(yīng)簡介

Introductionofdrugmetabolismreaction藥物代謝反應(yīng)的分類一相代謝二相代謝一相代謝反應(yīng)氧化反應(yīng)（CYP450催化）芳香族羥化（Aromatichydroxylation）脂肪族羥化（Aliphatichydroxylation）環(huán)氧化（Epoxdation）脫烷基（Dealkylation）氧化脫氨基（Oxidativedeamination）氮氧化（N-Oxidative）硫氧化（S-Oxidative）脫鹵素（Dehalogenation）氧化反應(yīng)（非CYP450催化）醇脫氫（Alcoholdehydrogenase）醛氧化（Aldehydeoxidatiion）黃嘌呤氧化（Xanthineoxidase）胺氧化（Amineoxidase）芳香化（Aromatase）還原反應(yīng)偶氮化合物，硝基化合物環(huán)氧化合物雜環(huán)化合物，鹵代烴水解反應(yīng)酯水解氨基化合物水解酰胺水解其他一相代謝反應(yīng)水合一相反應(yīng)概述大部分情況下代謝產(chǎn)物含有具有化學反應(yīng)性的官能團，例如：-OH，-NH2，-SH，-COOH等為進一步的二相代謝做準備二相代謝反應(yīng)與糖結(jié)合同葡萄糖醛酸結(jié)合同酚，醇及羧酸結(jié)合（O-Glucuronides）同胺，酰胺及磺胺結(jié)合（N-Glucuronides）同其他糖類結(jié)合葡萄糖（主要在昆蟲中）木糖核糖磺酸化主要底物為酚類輔助因子為PAPS甲基化主要底物為內(nèi)源性物質(zhì)輔助因子為SAM乙?；饕孜餅榉枷惆罚前份o助因子為乙酰輔酶A同氨基酸結(jié)合同谷胱甘肽結(jié)合同脂肪酸結(jié)合二相反應(yīng)概述需要富能/活化中間體（輔因子/活化的藥物）產(chǎn)物水溶性大一般為藥物的解毒步驟影響藥物代謝的因素

Factorsaffectdrugmetabolism藥物代謝受許多因素的影響內(nèi)因（種屬，基因，年齡，性別，激素及疾?。┩庖颍嬍常h(huán)境，合并用藥）影響代謝的內(nèi)部因素種屬不同種屬中的代謝速度不同不同種屬中的代謝途徑不同基因不同品系動物間的差異CYP2D6的多態(tài)性快代謝及慢代謝型的代謝速率有差異不同人群中的分布比例具有差異年齡新生及幼年階段代謝酶發(fā)育不完全老年階段代謝酶活性下降一相代謝情況復雜二相代謝酶一般在胚胎期缺失或者活性低，出生后活性逐漸加強，在生命早期達到成年水平，并在老年階段變化不大。激素水平/性別疾病狀態(tài)肝臟疾病肝硬化，病毒性肝炎，肝癌：代謝能力下降酒精肝：代謝能力上升非肝臟疾病激素相關(guān)疾?。杭卓?，糖尿病等影響代謝的外部因素營養(yǎng)物質(zhì)蛋白質(zhì)攝入不足導致一相代謝能力下降二相代謝能力變化復雜脂肪攝入不足導致代謝能力下降補充不飽和脂肪酸能提高代謝能力高脂飲食對不同組織的影響不同碳水化合物對代謝影響不大饑餓導致部分酶活性上升，部分下降總體來說上述物質(zhì)對代謝能力有很大的影響，但結(jié)果預測很難非營養(yǎng)物質(zhì)環(huán)境因素重金屬（鉛）大鼠慢性暴露：對代謝能力影響不大大鼠急性暴露：代謝能力下降環(huán)境污染物（多氯聯(lián)苯）誘導代謝能力殺蟲劑（滅蚊靈，開蓬）代謝穩(wěn)定性Metabolicstability概述代謝穩(wěn)定性在具有代謝活性的實驗體系中原型藥隨時間所減少的百分比實驗體系肝微粒體，S9，肝細胞檢測方法HPLC,LC/MSMS實驗體系肝微粒體不含胞漿酶，eg單胺氧化酶，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶需要輔助因子，egNADPH，UDPGA多用于高通量篩選肝細胞原代肝細胞，凍存肝細胞包含所有酶活性，無需添加輔助因子多用于定性研究S9包含了微粒體酶及胞漿酶但不具備細胞結(jié)構(gòu)S9/微粒體的制備S9的制備流程緩沖液：1.15%KClin0.05MTris-HCl(pH7.4)斷頭處理動物，取肝臟加入緩沖液（4倍濕重），制備肝勻漿9,000g離心30min，取上清肝微粒體的制備流程S9105,000g離心1小時棄去上清液沉淀用0.1M

蔗糖在懸浮微粒體/S9孵育體系體系組成終濃度緩沖液系統(tǒng)PBS,Tris(pH=7.4)微粒體0.1-1mg/mL輔助因子NADPH/UDPGA底物37oC條件下孵育肝細胞培養(yǎng)體系體系組成終濃度培養(yǎng)液CedraCompleteMedia肝細胞1-2*106cell/mL輔助因子N/A底物37oC，相對濕度95%，CO25%條件下孵育同時進行對照組的孵育不含藥物（空白對照）不含S9/微粒體/肝細胞（考察化學穩(wěn)定性）含代謝過程已知的藥物（考察酶活性）樣品檢測樣品前處理孵育/培養(yǎng)結(jié)束后加入含內(nèi)標的終止液，離心，取上清進樣分析樣品分析原型藥（主要關(guān)注點）代謝物示例參數(shù)的計算T1/2底物濃度固定，測定不同時間點原型藥的濃度對數(shù)化后回歸求得CLint不同底物濃度，測定同一時間點代謝產(chǎn)物的濃度CLint=Vmax/Km注意事項系統(tǒng)中有機溶劑的濃度避免使用有機溶劑甲醇乙腈<2%;DMSO<0.4%NADPH生成系統(tǒng)/待測藥物的穩(wěn)定性現(xiàn)配現(xiàn)用緩沖液的pH值保存后需再次測定pH確保肝微粒體均一加入前充分渦旋代謝產(chǎn)物鑒定Metaboliteprofiling實驗流程樣品孵育S9，肝微粒體樣品處理SPE，PP,LLE代謝產(chǎn)物的測定/鑒定HPLC,LC/MSMS,NMRS9孵育體系組成組成終濃度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADP0.5mMS94mg/mL孵育體系的總體積一般為5mL加入少量（5-50uL）藥物溶液啟動反應(yīng)藥物的終濃度在1-10ug/mL或1-10uM在各時間點取出部分樣品，加入等量冰乙腈終止反應(yīng)。該體系主要產(chǎn)生一相代謝產(chǎn)物微粒體孵育體系組成組成終濃度Tris-HCl50mMMgCl25mMGlucose-6-phosphate5mMNADPH/UDPGA0.5mM肝微粒體4mg/mL輔助因子為NADPH主要生成一相代謝產(chǎn)物輔助因子為UDPGA長時間孵育可生產(chǎn)葡萄糖醛酸結(jié)合產(chǎn)物代謝產(chǎn)物鑒定的樣品處理直接沉淀蛋白有機溶劑萃取乙酸乙酯，二氯甲烷固相萃取代謝產(chǎn)物的鑒定HPLC法推定結(jié)構(gòu)梯度洗脫檢測原型藥及代謝產(chǎn)物收集流份MS/HMR結(jié)構(gòu)鑒定放射性標記后可進行對原型藥及代謝產(chǎn)物進行初步的定量分析LC/MSMS法推定結(jié)構(gòu)檢測總離子流圖MSn鑒定結(jié)構(gòu)TOF鑒定結(jié)構(gòu)注意事項混合人肝微粒酶活性有較大差異除緩沖液外的其他組成應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用雄性大鼠S9/微粒體中CYP450的活性大于雌性大鼠對于每批S9/肝微粒體應(yīng)有對照藥物組來證明其活性根據(jù)藥物溶解性選擇溶劑緩沖液>甲醇>DMSO通過加入有機溶劑，并保存在-20oC條件下來迅速中止反應(yīng)許多情況下S9優(yōu)于微粒體便于制備，總活性較強無需添加NADPH能夠生成乙?；x產(chǎn)物代謝途徑鑒定Metabolicpathwayidentification概述了解藥物代謝途徑的重要意義尤其對于通過單一酶進行代謝消除的藥物影響藥物的安全性和有效性指導個體化的給藥劑量避免合并用藥時可能發(fā)生的不良反應(yīng)超過60%的藥物的代謝是由CYP450催化的一相氧化反應(yīng)葡萄糖醛酸化反應(yīng)是最主要的二相反應(yīng)CYP450代謝途徑鑒定CYP450簡介主要存在于肝臟的微粒體中,故也稱為肝微粒體酶（也有肝外分布）因其還原型與一氧化碳的復合物（P450-CO）在450nm處有一強吸收峰,故而得名細胞色素P450在人體中至少有53個分屬于18個家族的CYP450基因其中CYP1，CYP2及CYP3家族為主要參與外源性物質(zhì)代謝肝中各主要亞型的比例CYP450酶的特點幾乎能夠代謝所有結(jié)構(gòu)的藥物同一藥物能夠被多個亞型所代謝與一般酶相比，反應(yīng)速率較慢鑒定代謝途徑的方法抑制劑法（化學抑制劑/抗體）純酶法（重組酶）相關(guān)回歸法抑制劑法實驗流程酶動力學試驗加入特異性抑制劑進行共孵育考察有無抑制劑存在時反應(yīng)活性的差異CYP450各主要亞型的抑制劑其中2C19及2E1的抑制劑特異性不強，推薦使用抗體注意事項酶動力學試驗中確保底物消耗小于10%底物濃度的選擇（Km附近）抑制劑的選擇（高特異性）抑制劑的濃度（有效前提下盡量低）研究示例19份HLM中2C9抗體對X藥代謝活性的影響純酶法實驗流程獲得商業(yè)化供應(yīng)的各亞型的純酶各亞型的純酶重進行孵育觀察不同亞型的純酶中底物的剩余率所得的Km需要同HLM中的Km進行比較rCYP>HLM：體內(nèi)可能無貢獻rCYP<HLM：低濃度時的主要代謝亞型回歸分析法實驗流程進行待測藥物的孵育進行探針藥物的孵育將同一份孵育體系中探針藥物與待測藥物的反應(yīng)速率進行回歸也可以將藥物代謝產(chǎn)物生成速率同特定CYP450亞型在肝臟中的含量/mRNA水平等進行回歸基本原理是基于不同CYP450亞型在個體間表達的差異研究示例注意事項必須了解酶動力學過程單一酶催化：底物濃度應(yīng)該能夠達到Vmax多個酶催化：底物濃度接近生理濃度肝微粒體的篩選去除對于各亞型探藥有相關(guān)性的肝微粒體所有用于相關(guān)性回歸的肝微粒體中各亞型探藥的R2<0.3用于回歸分析的肝微粒體數(shù)量至少10個，最好20個相關(guān)系數(shù)良好，但在Y軸有較大的正截距說明有其他酶參與代謝CYP1A2及2D6均能催化該反應(yīng)，對該反應(yīng)的活性同CYP1A2探藥反應(yīng)活性進行回歸分析。UGT代謝途徑鑒定UGT簡介是體內(nèi)最主要的二相代謝酶主要功能包括：結(jié)合一些內(nèi)源性物質(zhì)（膽紅素，固醇類物質(zhì)）結(jié)合一些藥物及其一相代謝產(chǎn)物人肝中UGTs各亞型代謝藥物的比在人肝中UGT1A1、1A4、1A6、1A9和2B7為最主要的UGT亞型上述五種亞型催化了90%以上藥物的葡萄糖醛酸化代謝鑒定代謝途徑的方法孵育體系組成終濃度Tris/PBS50-100mMUDPGA5mMMgCl25mM微粒體/重組酶0.5-1mg/mL水解酶抑制劑可選孵育條件的優(yōu)化孵育過程中底物消耗不得超過10%在確保反應(yīng)呈線性的條件下（時間，蛋白濃度），取最低的底物濃度體外孵育條件下UGTs的穩(wěn)定性強于CYP450避免使用較高的蛋白濃度采用Saccharolactone(2–10mM)抑制水解反應(yīng)采用Alamethicin增加底物接觸酶活性位點的幾率維持pH在生理范圍（7.0-7.5）確保UDPGA，MgCl2處于飽和狀態(tài)代謝產(chǎn)物的確認水解酶孵育后測定堿水解（acyl-glucuronides）酸水解（N-glucuronides）重組酶法鑒定代謝途徑rUGTs活性篩選對所有亞型進行孵育使用2個底物濃度（Km及10*Km）當有超過1個亞型表現(xiàn)出活性時需要結(jié)合其在肝臟中的相對豐度來判斷哪個是主要亞型mRNA：2B4>1A3>1A4>2B15>1A6>2B7>2B17>1A9>1A1酶動力學比較分析參加比較的亞型：具有最強活性-10%最強活性rUGT>HLM(親和力低)：體內(nèi)無貢獻rUGT<HLM(親和力高)：低濃度時的主要代謝亞型（臨床相關(guān)）回歸法鑒定代謝途徑不同HLM中各UGT亞型表達有差異將待測藥物與探針藥物的反應(yīng)活性進行回歸分析具有最高相關(guān)性的亞型即為代謝該藥物的主要亞型底物濃度設(shè)在混合肝微粒體中的Km值附近孵育條件下下表抑制劑法鑒定代謝途徑化學抑制劑法到目前為止關(guān)于其制劑作用的特異性均未經(jīng)過系統(tǒng)的評價需要在HLM及rUGT中同時進行試驗特異性的抑制作用在HLM及單個rUGT中的抑制作用相等非特異性的抑制作用有多個rUGT中的抑制作用相同，或者其它rUGT亞型表現(xiàn)出比應(yīng)該出現(xiàn)抑制作用的亞型的抑制作用還要強免疫抑制法理論上可行目前沒有商業(yè)化的抗體供應(yīng)CYP450的抑制及誘導Inhibition&inductionofCYP450CYP450抑制作用研究合并用藥導致藥物相互作用發(fā)生率增加對CYP450的抑制是造成DDI的主要原因抑制可能導致藥物中毒基本流程選擇探針藥體現(xiàn)各亞型的活性酶動力學實驗抑制作用實驗（共孵育）測定代謝產(chǎn)物的濃度數(shù)據(jù)分析主要CYP450亞型的探針藥酶動力學試驗不同肝微粒體及試驗體系中同一探針藥的Km會有較大的差異故需要針對特定的試驗體系進行酶動力學研究測定相同時間點不同底物濃度下特異性代謝產(chǎn)物的濃度計算反應(yīng)速率用米曼氏方程對底物濃度及反應(yīng)速率進行擬合（GraphPad），求算Km抑制作用試驗試驗分組空白對照物（不含探針藥/NADPH）陰性對照組（不含受試物，100%活性）陽性對照組（含已知抑制劑）受試物組（含不同濃度的受試物/探針藥）受試物的抑制作用可以通過測定其IC50或者是Ki來進行評價IC50實驗中探針藥的濃度一般設(shè)在Km值附近代謝產(chǎn)物的測定采用LC/MSMS測定代謝產(chǎn)物的濃度數(shù)據(jù)分析計算各組中相對于陰性對照組的剩余反應(yīng)活性將剩余反應(yīng)活性同受試物濃度進行非線性擬合計算IC50（GraphPad）將剩余反應(yīng)活性同受試物濃度及探針藥濃度進行非線性擬合計算Ki（GraphPad）很可能（likely）/高風險（highrisk）Ki<1μM或I/Ki>1可能（possible）/中風險（mediumrisk）1μM<Ki<50μM或0.1<I/Ki<1不太可能（unlikely）/低風險（lowrisk）Ki>50μM或I/Ki<0.1不同類型的抑制作用可逆性抑制直接競爭酶的活性位點酶活性能夠在抑制劑耗盡后完全恢復不可逆性抑制不可逆的同酶的活性位點結(jié)合需要合成新酶后活性才能恢復可逆性抑制Competitiveinhibition抑制劑同游離態(tài)酶結(jié)合Noncompetitiveinhibition抑制劑同游離態(tài)酶/底物酶復合物結(jié)合Uncompetitiveinhibition抑制劑同底物酶復合物結(jié)合CompetitiveinhibitionNoncompetitiveinhibitionUncompetitiveinhibition不可逆抑制Nonspecificaffinitylabels（非特異性親和）一般來說具有親電性，能夠同具有親核性的蛋白組成共價鍵Quiescentaffinitylabels（靜態(tài)親和）具有弱親電性，同時具有能夠同酶進行可逆性結(jié)合的Mechanism-BasedInactivation（自殺性抑制劑）本身不具備活性，其產(chǎn)物可以作為affinitylabels，過渡狀態(tài)的類似物，親和力極高的可逆性抑制劑反應(yīng)機制的區(qū)別單步反應(yīng)：Nonspecificaffinitylabels雙步反應(yīng)：QuiescentaffinitylabelsMechanism-BasedInactivation選擇性/成藥性Affinitylabels類普遍缺乏選擇性不僅與酶發(fā)生作用，也同各類蛋白發(fā)生作用選擇性：Quiescentaffinitylabels>NonspecificaffinitylabelsMechanism-BasedInactivation有很強的選擇性CYP450誘導作用研究誘導可能導致藥物失效需要有完整的細胞結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)誘導一般采用肝細胞作為實驗體系反映在基因表達，蛋白表達及酶活性水平基本流程肝臟灌流分離肝細胞細胞培養(yǎng)及處理細胞收獲肝臟灌流通過門靜脈進行灌流使用醫(yī)用粘合劑封閉肝表面的其余血管由低到高增加灌流速度（100-500mL/min）用加氧的PB-1灌流10-20min在PB-2中加入膠原酶用加氧的PB-2灌流10-20min緩慢降低灌流速度將消化后的肝臟放置在滅菌容器中分離肝細胞（無菌操作）在消化后的肝臟中加入DMEM+，浸沒75-100%的組織用無菌手術(shù)器械撕碎外膜以釋放肝細胞過濾并分裝，室溫下40-60g離心3min棄去上清，加入DMEM+再懸浮沉淀以8:1:1的比例稀釋（PBS:0.04%Trypanblue:稀釋細胞液肝細胞計數(shù)加入等滲的細胞分離液至其終濃度為15-25%，倒置數(shù)次以混勻室溫下40-60g離心5min棄去上清，加入DMEM+再懸浮沉淀肝細胞計數(shù)肝細胞的培養(yǎng)及處理（無菌操作）用DMEM+將肝細胞稀釋至1-2*106/mL每孔加入3mL，放置2-3h使其貼壁（37度）移除未貼壁的細胞（出去培養(yǎng)液）加入3mLMCM+(含0.2-0.3mg/mLMatrigel)繼續(xù)進行孵育（37度，95%/5%空氣/CO2）在12-24h內(nèi)更換MCM+(不含

Matrigel)每日換液（MCM+）培養(yǎng)2-3天后，若細胞表現(xiàn)出近似正常的形態(tài)學即可用于誘導試驗加入含有受試物的MCM+每日換液連續(xù)2-3天細胞收獲（無需無菌操作）在處理結(jié)束后收獲細胞棄去培養(yǎng)液，用PBS沖洗（每孔0.25-1mL）去除剩余的PBS所得細胞可以制備微粒體/S9測定mRNA，測定酶活性注意事項封閉所有肝臟的切口以提高灌流效果為提高細胞培養(yǎng)的存活率及貼壁，孔中需要包被有膠原層DMSO為常用溶劑，但其會誘導3A4；體系中其濃度應(yīng)控制在0.1%之內(nèi)NME的CYP各亞型的體外代謝信息NME不被代謝或沒有主要的代謝途徑NME被代謝，有主要代謝途徑NME是誘導劑或抑制劑，或者沒有體外資料NME不是誘導劑或抑制劑用可能的抑制劑或誘導劑進行體內(nèi)研究用可能的底物進行體內(nèi)研究有沒有有沒有用可能合用的抑制劑或誘導劑進行研究用可能合用的底物（尤其是治療系數(shù)窄的）進行研究有有沒有沒有調(diào)整劑量調(diào)整劑量預測肝清除率Predictionofhepaticclearance目的意義尋找口服生物利用度好/半衰期長的藥物在新藥開發(fā)的早期通過體外實驗及動物實驗預測人體中的CL，降低研發(fā)成本同半衰期的關(guān)系對于血管外給藥二室模型的藥物同生物利用度的關(guān)系總清除率同藥物的清除及生物利用度直接相關(guān)總清除率為各器官清除率的總和CLtotal=CLhepatic+CLrenal+…對于完全由肝臟代謝的藥物CLtotal=CLhepatic肝清除率直接決定了肝臟利用度（FH）QH為肝臟血流速度F:生物利用度Fabs:吸收部分FG:腸道利用度研發(fā)階段一般致力于尋找低CLH的藥物此類藥物的生物利用度較好，半衰期較長根據(jù)藥物在肝臟的分布情況，有不同的數(shù)學模型來描述CLHWellstirredmodel藥物在肝臟中分布的無限均勻Paralleltubemodel藥物在肝臟中僅分布在非常有限的區(qū)域Dispers