實(shí)驗(yàn)三病原細(xì)菌的鑒定與藥物敏感性(大)

1實(shí)驗(yàn)三

病原細(xì)菌的分離、鑒定與毒力分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?．掌握無(wú)菌操作條件下致病菌的分離方法與程序；2．了解細(xì)菌鑒定的方法，熟悉細(xì)菌常用的生理生化反應(yīng)及原理。2二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1.平板劃線法分離病原細(xì)菌；2．病原細(xì)菌的形態(tài)與生理生化鑒定； 3．病原細(xì)菌的人工感染（課外選作實(shí)驗(yàn)）。3三、主要儀器及試材顯微鏡，解剖鏡，解剖用具，包括解剖盤、解剖刀、解剖針、大小手術(shù)剪、大小鑷子，培養(yǎng)皿、載玻片、蓋玻片、紗布等。蒸餾水、魚用生理鹽水，70%的乙醇、BHI培養(yǎng)基、生化管等。人工感染嗜水氣單胞菌的魚，未知病原菌感染的魚（剪掉部分背鰭或腹鰭作為標(biāo)記)。4四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（一）病原細(xì)菌的分離1．無(wú)菌操作打開(kāi)病魚的腹腔：2．細(xì)菌劃線接種：3．培養(yǎng)與觀察：（二）病原細(xì)菌的革蘭氏染色分別取嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和個(gè)人分離的未知菌株進(jìn)行革蘭氏染色，記錄結(jié)果。5四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（三）病原細(xì)菌的生理生化鑒定分別測(cè)定分離菌和嗜水氣單胞菌的12種生化指標(biāo)：氧化酶，吲哚實(shí)驗(yàn)，VP，H2S，鳥氨酸脫羧酶，精氨酸雙水解酶性，七葉苷，賴氨酸脫羧酶，山梨醇，蔗糖，纖維二糖，明膠。取生化管于距離內(nèi)容物上方2cm處用砂輪割開(kāi)，迅速于酒精燈火焰消毒，然后接種菌株，以封口膜或液體石蠟封口，置35℃孵育，依據(jù)說(shuō)明書進(jìn)行。6四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（四）病原細(xì)菌的毒力分析1．實(shí)驗(yàn)魚：實(shí)驗(yàn)環(huán)境下暫養(yǎng)7-10天。每組不少于50條，設(shè)不少于3個(gè)平行重復(fù)。2．菌懸液制備：液體培養(yǎng)基增殖，用無(wú)菌生理鹽水懸浮。經(jīng)計(jì)數(shù)后采用等對(duì)數(shù)間距設(shè)計(jì)約5個(gè)感染劑量進(jìn)行感染試驗(yàn)。對(duì)照組以無(wú)菌生理鹽水。3．注射方法：感染前實(shí)驗(yàn)魚用MS-222麻醉，用濕毛巾裹住魚體頭部。（1）腹腔注射：腹鰭基部無(wú)鱗片處。（2）肌肉注射：背鰭前端與側(cè)線之間的中部區(qū)域。7四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（四）藥物敏感性實(shí)驗(yàn)（一）紙片擴(kuò)散法

1.原理：含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種測(cè)試菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后便不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度，細(xì)菌的生長(zhǎng)被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映測(cè)試菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，即抑菌圈愈大，藥物敏感性越強(qiáng)。8四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2.實(shí)驗(yàn)操作

1）倒平板

2）菌懸液制備：挑取斜面中菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到1*107cfu/mL。以玻璃刮鏟將0.1mL細(xì)菌懸液均勻涂布于平皿培養(yǎng)基表面；

3）貼片：將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏片貼到平皿培養(yǎng)基表面。為了使藥敏片與培養(yǎng)基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下藥敏片。為了能準(zhǔn)確觀察結(jié)果，要求藥敏片能有規(guī)律的分布于平皿培養(yǎng)基上（在平皿中均勻貼四片）；

4）培養(yǎng)：28℃溫箱中培養(yǎng)24h，記錄結(jié)果；9四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟結(jié)果觀察：抑菌圈直徑大小與藥物濃度、細(xì)菌濃度有直接關(guān)系，觀察抑菌圈的有無(wú)。若有抑菌圈，則測(cè)量抑菌圈直徑；若無(wú)抑菌圈，則說(shuō)明該菌對(duì)此藥具有耐藥性。

抑菌圈直徑≥15mm高度敏感抑菌圈直徑10-15mm中度敏感抑菌圈直徑≤10mm低度敏感無(wú)抑菌圈不敏感或耐藥氟：75μg/mL；恩：5μg/mL磺：300μg/mL；青：10IU/mL10標(biāo)記分區(qū)底部觀磺氟靑嗯12四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟（二）肉湯試管稀釋法

1.原理：以肉湯液體培養(yǎng)基將抗生素作不同濃度的稀釋，然后接入待檢菌，定量測(cè)定抗菌藥物對(duì)被測(cè)菌的最低抑菌濃度（MIC）。

2.實(shí)驗(yàn)操作

1）菌液準(zhǔn)備：挑取金黃色葡萄球菌斜面中的菌苔于少量生理鹽水中制成細(xì)菌懸液，將菌液濃度調(diào)到1*107cfu/mL備用；13四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟2）抗菌藥物稀釋（硫酸慶大霉素注射液）：配制藥物原液濃度為8萬(wàn)IU/mL（80mg/mL），0.45μm濾器除菌。

①準(zhǔn)備11支2mL無(wú)菌EP管編號(hào)0~10排好，在0號(hào)管和1號(hào)管中加1.8mL無(wú)菌生理鹽水，2~10號(hào)管加1mL；②吸取0.2mL藥原液加入第一支EP管中混勻，從第一支試管中吸取0.2mL加入第二支EP管混勻，然后吸取1mL加入第三支混勻…以此類推，直到第十一支；③取12支滅過(guò)菌的玻璃試管編號(hào)1-12排好，各加入1.8mL滅過(guò)菌的培養(yǎng)液，然后從編號(hào)相對(duì)應(yīng)的EP管中吸取稀釋過(guò)的藥液再做10倍比稀釋。14四、實(shí)驗(yàn)方法與步驟3）接種：每只試管中加入0.1ml的菌液；4）培養(yǎng)：置37℃溫箱，培養(yǎng)24h；5）結(jié)果觀察：肉眼觀察，以不出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥對(duì)測(cè)試菌的MIC。根據(jù)結(jié)果換算出最小抑菌濃度（μg/mL）。8000800400200100502512.56.253.12

1.560.78無(wú)菌生理鹽水1.8mL0.2mL抗生素8萬(wàn)/mL下排培養(yǎng)液每管1.8mL對(duì)應(yīng)加0.2mL8040201052.51.250.60.3

0.1500.816五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

分離、接種時(shí)嚴(yán)格按照無(wú)菌操作要求進(jìn)行。

革蘭氏染色過(guò)程中涂片務(wù)求均勻，切忌過(guò)厚，染色過(guò)程中不可使染液干涸。藥敏實(shí)驗(yàn)，在貼片時(shí)用無(wú)菌鑷子輕輕觸壓藥物紙片，使之與培養(yǎng)基充分接觸，貼片后不能再更改紙片位置；鑷取藥物紙片時(shí)一旦掉到培養(yǎng)基表面，則繼續(xù)保持其位置，切勿鑷起重新放置，以防不同抗生素交叉影響。17六、實(shí)驗(yàn)安排1-4節(jié)(1)配培養(yǎng)基（固體、液體分裝），包培養(yǎng)皿（10包），配制生理鹽水，滅菌（4瓶）；(2)完成細(xì)菌染色、觀察和生化指標(biāo)測(cè)定；4-8節(jié)(1)倒平板接種貼紙；(2)藥液稀釋接種；（3）第二天早上看結(jié)果。18七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）1．記錄菌落特征、細(xì)菌形態(tài)、染色結(jié)果和生理生化結(jié)果（30分）。2，據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征和生化指標(biāo)初步鑒定分離自患病