第六章儀器分析熒光分析法

第6章熒光分析法用熒光抗體染色之原生動(dòng)物澳大利亞科學(xué)家最新發(fā)現(xiàn)，一種叫“螳螂蝦”的海里動(dòng)物通過(guò)發(fā)出色彩鮮艷的熒光來(lái)恐嚇警告敵對(duì)者或者吸引性配偶，

主要內(nèi)容基本原理1熒光分光光度計(jì)2分析方法3概述熒光：物質(zhì)分子吸收光子能量被激發(fā)后從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)時(shí)所發(fā)射出的光。熒光分析法特點(diǎn)：靈敏度高，比UV-Vis的靈敏度高得多；選擇性好；應(yīng)用不廣泛，主要是因?yàn)槟馨l(fā)熒光的物質(zhì)不具普遍性。熒光分析法：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置和強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和物質(zhì)含量測(cè)定的方法。概述分子和原子均可產(chǎn)生熒光：X射線熒光分析法——原子受X射線激發(fā)原子熒光分析法——原子特征譜線激發(fā)熒光分析法——紫外-可見(jiàn)光激發(fā)概述基態(tài)分子吸收一定能量后，躍遷至激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)分子以輻射躍遷形式將其能量釋放返回基態(tài)時(shí)，便產(chǎn)生分子發(fā)射光譜。依據(jù)激發(fā)的模式不同，分子發(fā)光分為光致發(fā)光（按激發(fā)的類型又可分為熒光和磷光兩種）、熱致發(fā)光、場(chǎng)致發(fā)光和化學(xué)發(fā)光等。光致發(fā)光：分子、原子吸收光輻射時(shí)被激發(fā)，然后再發(fā)射出與吸收的波長(zhǎng)相同或更長(zhǎng)光的現(xiàn)象。

按分子激發(fā)態(tài)的類型劃分時(shí)，由第一激發(fā)單重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷而伴隨的發(fā)光現(xiàn)象稱為熒光。

由最低的電子激發(fā)三重態(tài)所產(chǎn)生的輻射躍遷，其發(fā)光現(xiàn)象稱為磷光。概述1.1基本原理（1）分子中電子的激發(fā)過(guò)程

在每個(gè)電子能級(jí)上，都存在振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。1.基本原理

基態(tài)(S0)→激發(fā)態(tài)(S1、S2、激發(fā)態(tài)振動(dòng)能級(jí))：吸收特定頻率的輻射；量子化；躍遷一次到位。

激發(fā)態(tài)→基態(tài)：多種途徑和方式；速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。1.基本原理在光致激發(fā)和電激發(fā)光的過(guò)程中，分子中的價(jià)電子可以處在不同的自旋狀態(tài)，可用電子自旋狀態(tài)的多重性來(lái)描述。多重性(multiplicy,M)：電子自旋的狀態(tài)單重態(tài)(singletstate,Sn)：分子中所有電子自旋都相反，自旋配對(duì)的電子態(tài)(M=1)三重態(tài)(tripletstate,Tn)：分子中電子對(duì)的電子自旋平行的電子態(tài)(M=3)1.基本原理電子激發(fā)態(tài)的多重性：M=2S+1

S為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和(0或1)；大多數(shù)有機(jī)分子的基態(tài)處于單重態(tài)（Pauli不相容原理）。

1.基本原理分立軌道上的平行自旋比成對(duì)自旋穩(wěn)定(洪特規(guī)則)，三重態(tài)能級(jí)比相應(yīng)單重態(tài)能級(jí)低。S0→S1、S2允許躍遷；S0→T1

禁阻躍遷；通過(guò)其他途徑進(jìn)入；進(jìn)入的幾率??；1.基本原理1.基本原理（2）分子熒光的產(chǎn)生

處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，通常以輻射躍遷方式或無(wú)輻射躍遷方式去活化過(guò)程返回至基態(tài)。輻射躍遷方式熒光發(fā)射：處于第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)的分子以輻射躍遷的形式返回基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)（S1→S0躍遷）時(shí)，產(chǎn)生熒光。磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)（T1

→S0躍遷）。1.基本原理振動(dòng)弛豫：同一電子能級(jí)內(nèi)以熱能量交換形式由高振動(dòng)能級(jí)至低相鄰振動(dòng)能級(jí)間的躍遷。內(nèi)轉(zhuǎn)換：能量差較小的激發(fā)態(tài)之間，部分能量重疊，激發(fā)態(tài)由高電子能級(jí)轉(zhuǎn)移至低電子能級(jí)的無(wú)輻射能級(jí)交換。外轉(zhuǎn)換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產(chǎn)生相互作用而轉(zhuǎn)移能量的非輻射躍遷；外轉(zhuǎn)換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。體系間跨越：不同多重態(tài),有重疊的振動(dòng)能級(jí)間的非輻射躍遷。無(wú)輻射躍遷方式1.基本原理1.基本原理

電子處于激發(fā)態(tài)是不穩(wěn)定狀態(tài)，返回基態(tài)時(shí)，通過(guò)輻射躍遷(發(fā)光)和無(wú)輻射躍遷等方式失去能量；

激發(fā)態(tài)停留時(shí)間短、返回速度快的途徑，發(fā)生的幾率大，發(fā)光強(qiáng)度相對(duì)大；1.基本原理輻射躍遷熒光延遲熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)移外轉(zhuǎn)移系間跨越振動(dòng)弛預(yù)無(wú)輻射躍遷傳遞途徑1.基本原理（3）熒光和磷光的區(qū)別發(fā)光機(jī)制發(fā)光時(shí)間發(fā)光波長(zhǎng)應(yīng)用面熒光單重態(tài)單重態(tài)10-8-10-14s能量大，波長(zhǎng)較短廣泛磷光三重態(tài)單重態(tài)10-4-10s能量小，波長(zhǎng)較長(zhǎng)采用液氮在冷凍條件下檢測(cè)1.2熒光光譜的類型和特征1）激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何因熒光化合物都具有兩種特征光譜：

激發(fā)光譜和發(fā)射光譜1.基本原理熒光激發(fā)光譜（激發(fā)光譜）

通過(guò)測(cè)量熒光體的發(fā)光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜，它反映了不同激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率。激發(fā)光譜可供鑒別熒光物質(zhì)，在進(jìn)行熒光測(cè)定時(shí)供選擇適宜的激發(fā)波長(zhǎng)。1.基本原理熒光發(fā)射光譜

又稱熒光光譜，如果激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過(guò)發(fā)射單色器后，照射于檢測(cè)器上，掃描發(fā)射單色器并檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，然后通過(guò)記錄儀記錄熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的的關(guān)系曲線，所得到的譜圖。熒光光譜表示在所發(fā)射的熒光中各種波長(zhǎng)組分的相對(duì)強(qiáng)度。熒光光譜可供鑒別熒光物質(zhì)，并作為在熒光測(cè)定時(shí)選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng)或?yàn)V光片的根據(jù)。1.基本原理激發(fā)λ、ε熒光λ圖形激發(fā)光譜變不變F~λex圖發(fā)射光譜不變變F~λem圖激發(fā)光譜：反應(yīng)了不同激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)熒光的相對(duì)效率；發(fā)射光譜：反應(yīng)了不同發(fā)射波長(zhǎng)激發(fā)熒光的相對(duì)效率。1.基本原理2）熒光光譜特征①Stokes位移在溶液中，分子熒光的發(fā)射相對(duì)于吸收位移到較長(zhǎng)的波長(zhǎng)，稱為Stokes位移。這是由于受激分子通過(guò)振動(dòng)弛豫而失去轉(zhuǎn)動(dòng)能，也由于溶液中溶劑分子與受激分子的碰撞，也會(huì)有能量的損失。因此，在激發(fā)和發(fā)射之間產(chǎn)生了能量損失。1.基本原理②熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

因?yàn)榉肿游樟瞬煌芰康墓庾涌梢杂苫鶓B(tài)激發(fā)到幾個(gè)不同的電子激發(fā)態(tài)，而具有幾個(gè)吸收帶。在熒光發(fā)射時(shí)，不論用哪一個(gè)波長(zhǎng)的光輻射激發(fā)，電子都從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能層返回到基態(tài)，所以熒光發(fā)射光譜只有一個(gè)發(fā)射帶，與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。1.基本原理③熒光光譜與激發(fā)光譜的鏡像關(guān)系通常熒光發(fā)射光譜和它的吸收光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。吸收光譜是物質(zhì)分子由基態(tài)激發(fā)至第一電子激發(fā)態(tài)的各振動(dòng)能層形成的。其形狀決定于第一電子激發(fā)態(tài)中各振動(dòng)能層的分布情況。1.基本原理1.基本原理1.3影響熒光強(qiáng)度的因素（1）熒光效率與熒光產(chǎn)生的條件1）熒光壽命當(dāng)激發(fā)停止后,分子的熒光強(qiáng)度降到激發(fā)時(shí)最大強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間稱為熒光壽命，常用f表示。一般熒光物質(zhì)的εmax為103~105，所以熒光壽命常為10-10~10-8s,利用分子熒光壽命的差別，可以進(jìn)行熒光混合物的分析。1.基本原理2）熒光效率激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用f表示：f(0~1)，f大的有熒光發(fā)射1.基本原理①?gòu)?qiáng)紫外-可見(jiàn)吸收②一定的熒光效率

π→π*躍遷強(qiáng)吸收帶

n→π*躍遷弱吸收帶存在共軛的π→π*躍遷，f高，熒光強(qiáng)度大。3）產(chǎn)生熒光的必備條件1.基本原理①共軛效應(yīng)提高共軛度利于增加熒光效率并產(chǎn)生紅移。絕大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，因?yàn)榉枷悱h(huán)或雜環(huán)分子具有長(zhǎng)共軛的π→π*躍遷。π電子共軛程度越大，熒光強(qiáng)度（熒光效率）越大，而熒光波長(zhǎng)也長(zhǎng)移。

（2）影響熒光強(qiáng)度的結(jié)構(gòu)因素1.基本原理②分子的剛性與共平面性在同樣的長(zhǎng)共軛分子中，分子的剛性和共平面性越大，熒光率越大，并且熒光波長(zhǎng)產(chǎn)生長(zhǎng)移。多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。1.基本原理1.基本原理③取代基效應(yīng)取代基的性質(zhì)對(duì)熒光體的熒光特性和強(qiáng)度均有強(qiáng)烈影響。苯環(huán)上的取代基會(huì)引起最大吸收波長(zhǎng)的位移及相應(yīng)熒光峰的改變。通常給電子基團(tuán)，如-NH2、-OH、-OCH3、-NHCH3

和-N(CH3)2

等，使熒光增強(qiáng)。因?yàn)楫a(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團(tuán)，如－Cl、－Br、－I、-NHCOCH3、－NO2

和－COOH，使熒光減弱。具有剛性結(jié)構(gòu)的分子容易產(chǎn)生熒光。1.基本原理（3）影響熒光強(qiáng)度的外部因素①溫度溫度升高，熒光物質(zhì)的熒光效率和熒光強(qiáng)度下降。

其中一個(gè)原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)分子接受額外熱能時(shí)，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)換為基態(tài)的振動(dòng)能量，隨后迅速振動(dòng)弛豫而喪失振動(dòng)能量。另一個(gè)原因是碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活幾率增加。1.基本原理溶劑極性增大，熒光波長(zhǎng)隨著而長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。這是因?yàn)樵跇O性溶劑中，ππ*躍遷所需的能量差△E小，而且躍遷幾率增加，從而使紫外吸收波長(zhǎng)和熒光波長(zhǎng)均長(zhǎng)移，強(qiáng)度也增強(qiáng)。②溶劑1.基本原理溶劑粘度減小，熒光強(qiáng)度減弱。溶劑粘度減小時(shí)，可以增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無(wú)輻射躍遷增加而熒光減弱。故熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。由于溫度對(duì)溶劑的粘度有影響，一般是溫度上升，溶劑粘度變小，因此溫度上升，熒光強(qiáng)度下降。②溶劑1.基本原理③pH值的影響帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物的熒光與溶液的pH有關(guān)。具有酸性或堿性基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，在不同pH值時(shí)，其結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，因而熒光強(qiáng)度將發(fā)生改變；對(duì)無(wú)機(jī)熒光物質(zhì)，因pH值會(huì)影響其穩(wěn)定性，因而也可使其熒光強(qiáng)度發(fā)生改變。

對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑形成的發(fā)光鏊合物，一方面pH會(huì)影響鏊合物的形成，另一方面還會(huì)影響鏊合物的組成，因而影響它們的熒光性質(zhì)。1.基本原理④

熒光熄滅劑的影響熒光熄滅是指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。引起熒光熄滅的物質(zhì)稱為熒光熄滅劑。常見(jiàn)的熒光熄滅劑有鹵素離子、重金屬離子、氧分子、硝基化合物、重氮化合物、羰基化合物、羧基化合物。1.基本原理在濃度較高的熒光物質(zhì)溶液中，單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自熄滅現(xiàn)象。i.碰撞猝滅有些熒光物質(zhì)分子在溶液濃度較高時(shí)會(huì)形成二聚體或多聚體，使它們的吸收光譜發(fā)生變化，也引起溶液熒光強(qiáng)度的降低或消失。ii.靜態(tài)息滅1.基本原理小部分光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。⑤

散射光的干擾瑞利光：光子和物質(zhì)發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，只是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。拉曼光：光子和物質(zhì)發(fā)生非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量。從而發(fā)射出比入射光稍長(zhǎng)或稍短的光。1.基本原理散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光，與熒光波長(zhǎng)接近，對(duì)測(cè)定的干擾大，必須采取措施消除。拉曼光的干擾主要來(lái)自溶劑，當(dāng)溶劑的拉曼光與被測(cè)物質(zhì)的熒光光譜相重疊時(shí)，應(yīng)更換溶劑或改變激發(fā)光波長(zhǎng)。1.基本原理2.1熒光分光光度計(jì)由光源、單色器、液槽、檢測(cè)器和信號(hào)顯示記錄器五部分組成。（1）激發(fā)光源氙燈光源：波長(zhǎng)范圍250~800nm連續(xù)光譜。是應(yīng)用最廣泛的光源。高壓汞燈光源：光譜略呈帶狀常用熒光分析光源：

氙燈，高壓汞燈。2.熒光分光光度計(jì)（2）單色器（3）樣品池選擇激發(fā)光波長(zhǎng)的第一單色器選擇發(fā)射光(測(cè)量)波長(zhǎng)的第二單色器低熒光的玻璃或石英方形適用于90°測(cè)量（4）檢測(cè)器（5）讀出裝置光電倍增管2.熒光分光光度計(jì)

(1)靈敏度校正

(2)波長(zhǎng)校正

(3)激發(fā)光譜和熒光光譜的校正

2.熒光分光光度計(jì)2.2儀器的校正3.1熒光強(qiáng)度與物質(zhì)濃度的關(guān)系F

∝

（I0－I）F:熒光強(qiáng)度

Io:入射光強(qiáng)度

I：出射光強(qiáng)度F

=K′（I0－I）根據(jù)比爾定律：I=I0×10－cl低濃度時(shí)，（cl≤0.05）F=Kc3.分析方法3.2定量分析方法①

標(biāo)準(zhǔn)曲線法用已知的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)和試樣同樣的處理后，配成一系列標(biāo)液。測(cè)定標(biāo)液的熒光強(qiáng)度，用熒光強(qiáng)度對(duì)標(biāo)液濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)試液的熒光強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。3.分析方法②

比例法純物質(zhì)：cs、FS

FS－F0=Kcs試液：

cx、Fx

FX－F0=Kc