GB/T 22917-2008豬水泡病病毒熒光RT-PCR檢測(cè)方法

犐犆犛１１．２２０

犅４１

中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)

犌犅／犜２２９１７—２００８

豬水泡病病毒熒光犚犜犘犆犚檢測(cè)方法

犘狉狅狋狅犮狅犾狅犳犳犾狌狅狉狅犵犲狀犻犮犚犜犘犆犚犳狅狉狊狑犻狀犲狏犲狊犻犮狌犾犪狉犱犻狊犲犪狊犲狏犻狉狌狊

２００８１２３１發(fā)布２００９０５０１實(shí)施

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局

發(fā)布

中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)

書

犌犅／犜２２９１７—２００８

前言

本標(biāo)準(zhǔn)參考了世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（ＯＩＥ）《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)（哺乳動(dòng)物、禽鳥與蜜蜂）》

（第５版）。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄Ａ為規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中華人民共和國(guó)深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局、中華人民共和國(guó)云南出入境檢驗(yàn)檢

疫局。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：花群義、盧體康、呂建強(qiáng)、阮周曦、楊云慶、周曉黎、楊素、董俊、陳書琨。

Ⅰ

書

犌犅／犜２２９１７—２００８

豬水泡病病毒熒光犚犜犘犆犚檢測(cè)方法

１范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬水泡病病毒熒光ＲＴＰＣＲ檢測(cè)的操作方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物及其產(chǎn)品中豬水泡病病毒的檢測(cè)。

２縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

２．１熒光犚犜犘犆犚

熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)。

２．２犆狋值

每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

２．３犚犖犃

核糖核酸。

２．４犇犈犘犆

焦碳酸磷酯。

２．５犘犅犛

磷酸鹽緩沖鹽水，配方見附錄Ａ。

２．６犜犪狇酶

犜犪狇ＤＮＡ聚合酶。

２．７犛犞犇犞

豬水泡病病毒。

３原理

根據(jù)豬水泡病病毒的基因特定序列，合成一對(duì)特異性引物和一條特異性的熒光雙標(biāo)記探針。引物

和探針通過嚴(yán)格的設(shè)計(jì)和篩選，涵蓋已報(bào)道的所有豬水泡病病毒的毒株。熒光探針的５′端標(biāo)記ＦＡＭ

熒光素，３′端標(biāo)記ＴＡＭＲＡ熒光素，它在近距離內(nèi)能吸收５′端報(bào)告熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光信號(hào)。擴(kuò)增時(shí)，

由于犜犪狇酶的５′→３′的外切活性，在延伸到熒光探針時(shí)，將其切斷，兩基團(tuán)分離，淬滅作用消失，熒光信

號(hào)產(chǎn)生。因此，可以通過檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)核酸模板進(jìn)行檢測(cè)。

４材料與試劑

４．１儀器與器材

４．１．１熒光ＲＴＰＣＲ檢測(cè)儀。

４．１．２高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（離心速度１２０００ｒ／ｍｉｎ以上）。

４．１．３臺(tái)式離心機(jī)或手掌式離心機(jī)（離心速度３０００ｒ／ｍｉｎ）。

４．１．４混勻器。

４．１．５冰箱（２℃～８℃和－２０℃兩種）。

４．１．６微量可調(diào)移液器（５μＬ，１０μＬ，１００μＬ，１０００μＬ）及配套帶濾芯吸頭。

４．１．７１．５ｍＬ、０．５ｍＬ硅化Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管：將Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管和滴頭浸泡于含有０．１％