講動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術

第四篇

生物制品生產(chǎn)

第8講

動物細胞生物制藥第2節(jié)

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術1896192019872006為什么進行動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)1962年開始動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)嘗試，目前已經(jīng)成為生物制藥的重要支撐技術。本講主要內(nèi)容1.適合大規(guī)模培養(yǎng)的細胞株2.動物細胞培養(yǎng)的生物反應器3.微載體及其培養(yǎng)特點4.動物細胞培養(yǎng)的影響因素與培養(yǎng)工藝

本講關鍵問題1.了解動物細胞轉化方法2.了解適合動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應器3.重點掌握微載體培養(yǎng)技術4.了解動物細胞培養(yǎng)的影響因素及灌注培養(yǎng)工藝第一部分細胞株與生物反應器

一

適合大規(guī)模培養(yǎng)的細胞株（一）細胞系(Cell

line)

是由原代培養(yǎng)經(jīng)傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細

胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群

體。第一次傳代培養(yǎng)后的細胞即稱之為細胞系。不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細胞系(Finite

cell

line)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細胞系

(Infinite

cell

line)。（二）細胞株(Cell

strain)是指從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離

培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細

胞群，稱細胞株。細胞株的建立需要從細胞系群體中分離出一個細胞，并使其在體外繁殖成為新細胞群體。毛細管法------形成單個細胞克隆的細胞群體有限稀釋法（三）適合工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株根據(jù)不同的分類標準，可以分為：1.原代細胞、傳代細胞2.有限細胞系、無限細胞系（不具有接觸抑制現(xiàn)象；理想的藥物生產(chǎn)細胞）3.二倍體細胞、異倍體細胞4.融合細胞、轉化細胞、基因工程細胞5.貼壁型、非貼壁型1.原代細胞雞胚細胞、原代兔腎細胞或鼠腎細胞、血液淋巴細胞1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎組織細胞生產(chǎn)

脊髓灰質滅活疫苗，開創(chuàng)了動物細胞培養(yǎng)進行生物

制藥的先河。具有需要大量動物組織、成本高、費時費力等缺點。藥物篩選、藥理研究。2.傳代細胞二倍體細胞：具有正常細胞的特點：二倍體染色體、

具有貼壁和接觸抑制特性、無致瘤性。

有限細胞

系（傳代次數(shù)一般都不超過50代）。WI-38：

1961年Wister

38研究所從女性高加索人的

正常胚肺組織中獲得的一株人2倍體細胞系WI-38。

培增時間24h；貼壁生長；第一批獲得批準用于生

產(chǎn)的二倍體細胞有對病毒敏感，第一個用于疫苗

（脊髓灰質滅活疫苗）生產(chǎn)。MRC-5：二倍體，成纖維，生長比WI-38快。3.轉化細胞轉化細胞：正常細胞由于受到病毒或其他促癌因子

的誘導而變成了具有癌細胞屬性的細胞。特點如

下：無限增殖能力密度抑制喪失血清依賴性降低形態(tài)學改變：可懸浮生長核型改變：非整倍體細胞膜功能改變：運輸能力增加、對化學致癌物抵抗力增加

致瘤性轉化細胞一般具有永生性，但是永生性不一定成瘤。

一般轉化細胞并不致瘤。致瘤性評價：接種到動物體內(nèi)，發(fā)展形成腫瘤結

節(jié)，為生瘤陽性。隨著對腫瘤發(fā)生機制等研究的深入，轉化細胞于20

世紀80年代獲得批準用于生產(chǎn)。

轉化方法（1）細胞自轉化細胞體外培養(yǎng)時，由于環(huán)境因子因素的影響，有時會發(fā)

生自發(fā)轉化，由原來的二倍體核型變成多倍體/異倍

體核型，而獲得永生化，失去接觸抑制，可無限繁殖

傳代。可能的因素包括：血清質量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污

染等，均有可能失去正常細胞特性，而發(fā)生遺傳變異

甚至發(fā)生轉化。因此為了維持二倍體細胞的正常細胞

特性，防止遺傳變異和轉化，應盡量早期凍存和減少

傳代。（2）人工誘發(fā)轉化1）誘發(fā)采用誘導劑使正常細胞發(fā)生轉化。物理因素：如放射線、溫度、電磁波、藥物等化學因素：如甲基膽蒽、土醌80、7，12-二

甲基苯醌

（DMBA）、3-甲基膽蒽、甲基甲磺醌（MMS）、乙基

亞硝基脲（ENC），甲基硝基亞硝基胍類化合物

（MNNG）等。生物因素：如毒素、黃曲

霉毒素、病毒SV40、EB病毒、多發(fā)瘤病毒、逆轉錄病毒等。2）細胞系篩選誘變劑（致癌物）處理后的細胞群中進入轉化發(fā)展階段

的細胞僅是一小部分（大約5%），這些細胞稱為癌前

細胞。癌前細胞由于失去了接觸抑制，加上生長繁殖速度變快

，在局部癌前細胞的數(shù)量增多而堆積，最后形成了明

顯

可見的“轉化灶”。“轉化灶”進行克隆分離和純化后，

繼續(xù)擴大培養(yǎng)，

即可形成穩(wěn)定的傳代細胞系。比二倍體減少1條(2n-1)或幾條染色體的細胞稱亞二倍體

常用細胞株CHO細胞(Chinese

hamster

ovary

cell)：從中國倉鼠卵巢

分離的細胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長，也

可以懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能

力。CHO細胞能表達糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活

劑(Tissue

plasminogen

activator，tPA)、促紅細胞生

成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原

（Hepatitis

B

virus

surface

antigen,

HBsAg）、粒

細胞集落刺激因子（Granulocyte

colony

stimulating

factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。BHK-21細胞（Baby

hamster

kidney

cell）：是1961年英國從幼地鼠的腎臟分離的細胞。成纖維樣，異倍體。常用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白(例如重組凝血因子VIII)。Vero細胞（Vero

cell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞之一。

（4）融合細胞雜交瘤細胞：脾臟B細胞與骨髓瘤細胞的融合細胞。無血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長。抗體藥物生產(chǎn)。二

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)（一）定義動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)（cell

large-

scale

culture）：是指在人工條

件下（設定pH、溫度、溶氧等）

高密度大量增值的技術。培養(yǎng)流程：組織—消化—原代培養(yǎng)—傳代培養(yǎng)

（細胞系與細胞株）—小規(guī)模培

養(yǎng)（轉瓶等）—大規(guī)模培養(yǎng)（生

物反應器）—產(chǎn)品（二）轉管/瓶培養(yǎng)系統(tǒng)

轉瓶培養(yǎng)是在轉管培養(yǎng)基礎上為擴大培養(yǎng)量而改進的。轉瓶或轉管固定在旋轉支架上，傾斜角度一般為5o-10o。細胞貼附在轉瓶或轉管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉而流動，細胞交替接觸營養(yǎng)和空氣，利于細胞吸收營養(yǎng)、進行氣體交換。（三）動物細胞生物反應器培養(yǎng)

除了以人工誘變?yōu)槟康牡呐囵B(yǎng)外，用于動物細胞培養(yǎng)的生物反應器的設計原則應該是盡量模擬培養(yǎng)物在生物體內(nèi)的生長環(huán)境。

由于動物細胞生長的特殊性，如貼壁、脆弱等，與微生物細胞培養(yǎng)不同，需要特別注意反應器結構設計以及特殊載體的選擇。問題：1.如何設計生物反應器，降低動物細胞培養(yǎng)的剪切力損傷？2.如何滿足細胞貼壁要求又能充分利用反應器空間體積？

1.動物細胞培養(yǎng)的生物反應器機械攪拌式：漿葉改造充氣攪拌式：需要改造微載體培養(yǎng)：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培養(yǎng)中空纖維式：解決貼壁、營養(yǎng)氣體有效吸收交換、

連續(xù)灌注培養(yǎng)

氣泡用絲網(wǎng)隔開，不與細胞直接接觸。反應器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力，以滿足細胞生長的要求?；\式鼓氣生物反應器這種類型的生物反應器攪拌速度一般都非低，盡量減少剪切力對細胞的影響。機械攪拌結合鼓氣的生物反應器一次性培養(yǎng)袋在線分析技術中空纖維是一種細微的管狀結構，管壁為極薄的半透膜。主體是由微孔中空纖維管束制成的中空絲，纖維束由外殼包裹，因此可分為中空內(nèi)腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進出口。新鮮培養(yǎng)液從中空內(nèi)腔導入。氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地擴散至殼體內(nèi)部。中空纖維生物反應器柱式中空纖維生物反應器板框式中心灌流式特點模擬細胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài)。

既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。細胞如果是附壁性的，則附著在纖維外殼表面，在培養(yǎng)結束后用胰蛋白酶消化液將其消化沖出；若是非附壁性的，應采用微濾材料將其截留在反應器內(nèi)而讓培養(yǎng)液排出。優(yōu)點：無剪切力影響，高密度培養(yǎng)，傳質效率高。缺點：容易堵塞，價錢昂貴。小結1.動物細胞生物制藥常用的細胞株2.動物細胞培養(yǎng)的生物反應器：傳統(tǒng)反應器改造、

中空纖維反應器補充文獻：第二部分微載體培養(yǎng)與動物細胞培養(yǎng)影響因素（一）微載體培養(yǎng)技術微載體（Microcarrier）：是直徑60-250μm的適用

于貼壁依賴型細胞生長的微粒。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。1967年，維茨爾（Van

Wezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。微載體系統(tǒng)將傳統(tǒng)的一維平面貼附擴展為三維立

體貼附，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制。

同時，微載體使利用生物反應器進行動物細胞

大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能滿足動物細胞的貼

壁要求，又能充分利用生物反應器的內(nèi)部空間。微載體特點1.好的生物相容性：無毒無害，有好的黏附性，一般帶正電荷2.大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一3.良好的傳質性能4.強的機械性能：重復利用、保護細胞5.好的熱穩(wěn)定性：高壓滅菌

制備微載體的材料1.人工合成聚合物聚甲基丙烯酸-2

羥乙酯（PHEMA）、聚苯乙烯（PS）、聚丙烯酰胺、聚氨酯泡沫、葡聚糖、低聚合度聚乙烯醇等。2.天然聚合物及其衍生物明膠、膠原、纖維素、甲殼質及其衍生物、海藻酸鹽功能材料2004，35卷，增刊微載體分類1.實心微載體優(yōu)點：易于細胞在表面貼壁，機械強度高，容易接種操作缺點：細胞濃度低；細胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響；細胞易老化脫落。2.多孔微載體優(yōu)點：比表面積更大，使細胞免受機械損傷，得到的細胞濃度高，可降低血清用量，可以采用高的攪拌速度和通氣量缺點：容易產(chǎn)生營養(yǎng)傳遞障礙，積聚代謝副產(chǎn)物。

（1）微載體培養(yǎng)微載體培養(yǎng)動物細胞經(jīng)黏附貼壁、生長和擴展成單層

三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微

載體表面的貼附是關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載

體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概

率和親和性，也與培養(yǎng)基組成、攪拌等相關。

影響貼壁的因素貼壁主要是靠靜電引力和范德華力。取決于細胞與

微載體表面理化性質和微載體接觸概率有關。電荷：一般細胞在進入生理pH值時，表面帶負電荷。

若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞

貼壁速度。培養(yǎng)基組分：添加血清有助于細胞貼壁。提供促接觸和伸展因子。攪拌：不能僅依靠大的攪拌速率保證接觸概率。在

貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停；數(shù)小時后，

待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉

速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，

最大速度75r/min。其它因素：培養(yǎng)基偏酸或偏堿、微載體不潔等不利條件都不利于細胞貼壁。一種微載體產(chǎn)品（Fibra-Cel）人胚腎細胞HEK293人上皮細胞——SoloHill微載體上的生長微載體對細胞生長具有顯著的影響問題：微載體培養(yǎng)如何收獲細胞？接種細胞傳代呢？胰蛋白酶消化將貼滿細胞的微載體與新鮮微載體混合，實現(xiàn)細

胞因隨機碰撞而實現(xiàn)轉移貼附在新載體表面的技

術。優(yōu)點：（1）避免了細胞收獲與微載體再生過程，方便、高效。（2）防止細胞調(diào)亡：通過定期更換微載體也能為細

胞的分裂生長提供了新的生長空間，在長期培養(yǎng)

過程中保持細胞活力，延長了細胞壽命，提高了

細胞分泌物的產(chǎn)量。球傳球(bead

to

bead)技術優(yōu)點1.模擬了體內(nèi)三維生長環(huán)境，減輕了接觸抑制，可以多層生長。2.很好地解決了生物反應器的空間分布問題，單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高；培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積和空間?。粍趧訌姸刃?；放大容易，使大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞成為可能。3.把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點；可以稍加改造利用傳統(tǒng)生物反應器。4.接種與收獲方便；可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)，培養(yǎng)基利用率較高。（二）動物細胞培養(yǎng)的影響因素1.細胞凋亡（1）有毒物質或抑制因子產(chǎn)生氨：來自培養(yǎng)基+代謝，積聚影響細胞生長。乳酸：來自細胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑制糖酵解，能量產(chǎn)生減少，抑制細胞生長。甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產(chǎn)物，對細胞有潛在的損傷作用。（2）營養(yǎng)成分耗盡如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中