乙肝診斷技術(shù)新進(jìn)展

乙肝診斷技術(shù)新進(jìn)展目前乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷中存在的問題

單獨(dú)用HBsAg作為判定是否感染乙肝病毒的指標(biāo)并非完全準(zhǔn)確

理論基礎(chǔ)：

①

HBV/HCV合并感染，抑制HBsAg表達(dá)

②144、145位等氨基酸變異國(guó)內(nèi)外ELISA試劑檢測(cè)HBsAg比較野生型

ad相差約8倍

ay相差約16倍

變異型對(duì)G145R變異及與其相關(guān)的多點(diǎn)變異的檢測(cè)能力弱,或檢不出；對(duì)T118K/P120Q，Q129R/M133T等聯(lián)合變異的檢測(cè)能力弱；對(duì)于T126N，D144A等變異國(guó)內(nèi)外試劑的檢測(cè)能力基本一致。國(guó)內(nèi)外診斷試劑對(duì)變異血清的檢測(cè)國(guó)家參考品adr血清的檢測(cè)結(jié)果含有G145R變異的血清檢測(cè)結(jié)果變異血樣目前乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷中存在的問題

單獨(dú)用HBeAg診斷活動(dòng)期乙肝并不可靠。

理論基礎(chǔ)：前C區(qū)變異為什么會(huì)出現(xiàn)HBeAg陰性HBeAg陰性是由于HBV變異造成：常見的是前核心區(qū)和核心啟動(dòng)子區(qū)的變異前核心區(qū)G1896A

突變使前核心區(qū)出現(xiàn)終止密碼，導(dǎo)致E抗原不能合成前體氨基酸異位核心啟動(dòng)子區(qū)A1762T+G1764A

突變?cè)斐尚盘?hào)RNA轉(zhuǎn)錄降低，導(dǎo)致HBeAg不能分泌，血清中檢測(cè)不到HBeAg前C區(qū)的基因突變當(dāng)乙肝病毒為逃避宿主的免疫反應(yīng)基因可發(fā)生變異。其所攜帶的HBV變異毒株大多數(shù)表現(xiàn)為：在病毒基因組前C區(qū)末端1896位發(fā)生

G–A點(diǎn)突變

TGG

TAG

恰好形成新的終止密碼子（TAG）阻斷了HBeAg的轉(zhuǎn)錄，翻譯，表達(dá)導(dǎo)致在臨床上可出HBeAg檢測(cè)為陰性。但HBV病毒仍能復(fù)制和裝配ExpressionofcoreproteinandHBeAg前C區(qū)變異前C區(qū)發(fā)夾形纖襻結(jié)構(gòu)，在1858位與1896位間，將不穩(wěn)定的T－G對(duì)變異為T－A對(duì)，使前基因組RNA結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，更有利于病毒復(fù)制，進(jìn)而導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)株。全世界HBeAg陰性的患者中有60％被檢測(cè)到前C終止密碼變異，在地中海為92％，亞太地區(qū)是50％，美國(guó)北歐為24％CumulativeeffectofCorepromotermutations

C區(qū)變異

在病毒清除期，基因組較保守的部位發(fā)生了選擇性變異，以C區(qū)中部的變異或缺失，至少可涉及4個(gè)B細(xì)胞靶位、2個(gè)細(xì)胞毒T細(xì)胞（CTL）表位和3個(gè)Th細(xì)胞表位。

C區(qū)Codon130是最重要的免疫原性區(qū)，是T、B細(xì)胞共有的表位。干擾素治療HBeAg陰性的慢性乙肝持續(xù)的反應(yīng)率較低，而在HBeAg陽(yáng)性患者干擾素療效較好，當(dāng)患者血清HBV前C基因突變株超過20％時(shí)，常預(yù)示IFN－α療效差，在慢性HBV感染過程中，前C1896變異毒株逐漸累積成為優(yōu)勢(shì)毒株，因此，臨床應(yīng)用干擾素治療越早越好

X基因的變異

X基因是病毒復(fù)制的重要調(diào)節(jié)區(qū)，是轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄和正鏈合成的起點(diǎn)，也是多種細(xì)胞因子結(jié)合點(diǎn)，此區(qū)變異影響到病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制：核心蛋白的啟動(dòng)子（BCP）慢性乙型肝炎：BCP變異是多點(diǎn)和復(fù)合，主要是1762（A－T）、1764（G－A）的雙變異，BCP區(qū)是富含AT區(qū)域，具有肝臟富含因子的獨(dú)立結(jié)合點(diǎn)，變異的BCP可改變這種結(jié)合，降低前C的RNA轉(zhuǎn)錄，最終使HBeAg表達(dá)減少，平均降低70％。暴發(fā)型肝炎患者CP1638位（T－C）、1673位（C－T）、1727位（A－T）、1730位（C－G）變異出現(xiàn)較多

S基因變異

乙肝疫苗免疫HBsAg(+)，“a”決定簇變異株，其中145位的甘氨酸替代了精氨酸，這是由于HBV逃避宿主的免疫壓力選擇性結(jié)果，有時(shí)這種變異株在母體內(nèi)為少數(shù)，而在疫苗免疫后的小兒卻成為優(yōu)勢(shì)株肝移植后應(yīng)用單克隆抗體或高效價(jià)HBsAg治療后也可出現(xiàn)145位的甘氨酸－精氨酸HBsAg變異。還有在HBsAg－、DNA＋患者中發(fā)現(xiàn)124位半胱氨酸缺失，導(dǎo)致HbsAg的分泌障礙，而使免疫學(xué)標(biāo)志出現(xiàn)HBsAg－。乙肝病毒臨床與變異慢性感染HBeAg（＋）期，病毒高滴度，但臨床常無加重

隨著感染持續(xù)，出現(xiàn)了HBeAg(－)前C變異株，并逐漸累積，此時(shí)血清學(xué)仍可為HBeAg(＋)，但血清中已可同時(shí)檢測(cè)野毒株和變異株，其中野毒株逐步被清除，臨床上常伴肝炎發(fā)作；隨著前C1896變異株選擇優(yōu)勢(shì)的發(fā)展，血清學(xué)可轉(zhuǎn)換為HBeAg(-)，但在血清中仍可檢測(cè)到HBeAg分泌的野毒株，在臨床上既可表現(xiàn)為病情加重，也可表現(xiàn)為病情緩解；若選擇的結(jié)果進(jìn)入均一eAg不表達(dá)的變異株，則ALT可輕微升高，但病情可無明顯加重。目前乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷中存在的問題

DNA復(fù)制程度的大小并不代表肝臟實(shí)際損害的程度（莊輝院士）,DNA不能準(zhǔn)確的判斷愈后，轉(zhuǎn)陰后可能反彈。

附：DNA與ALT的關(guān)系DNA與ALT的關(guān)系首都醫(yī)科大學(xué)閔福援

39例急性乙肝患者血清HBV-DNA與ALT間的動(dòng)態(tài)變化時(shí)間（周）例數(shù)HBV-DNA陽(yáng)性例數(shù)（%）ALT大于40U/L例數(shù)（%）1-53935（90%）30（76%）6-103525（71%）9（25%）11-30217（33%）2（10%）

不同病程的HBV-DNA與ALT相比差異有顯著性。目前乙型肝炎實(shí)驗(yàn)室診斷中存在的問題

單獨(dú)DNA檢測(cè)并不能準(zhǔn)確反映乙肝病毒的復(fù)制情況，部分活動(dòng)期乙肝患者DNA檢測(cè)結(jié)果呈陰性?？陀^評(píng)價(jià)乙肝病毒DNA檢測(cè)

在臨床診斷中的意義

擴(kuò)增乙肝C基因區(qū)上270bp基因片段，以2n

指數(shù)，將HBV-DNA分子片斷擴(kuò)增1×107～108倍同一位患者抽血檢查HBV-DNA，其定量數(shù)值每天都在變化，即便是患者不進(jìn)行任何治療，定量檢測(cè)到的數(shù)值都在時(shí)刻變化之中。同一份血清標(biāo)本在不同的時(shí)間檢測(cè)，或在不同的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，其數(shù)值都會(huì)有所不同。以這種時(shí)刻都在自然變化著的數(shù)值用來說明療效，是不確切的。HBV-DNA定量檢測(cè)所用儀器設(shè)備、試劑品質(zhì)不同，標(biāo)準(zhǔn)曲線以及標(biāo)準(zhǔn)熒光等各不相同，得出的數(shù)值左右漂浮，偏差大，得出的檢測(cè)值范圍也不相同

DNA載量---隨時(shí)變化的不穩(wěn)定數(shù)值：可能是治療效應(yīng)，也可能是自然變化或檢驗(yàn)偏差。DNA載量正常值和異常值范圍難以統(tǒng)一PCR-血清標(biāo)本的處理目的基因的得率：①處理標(biāo)本過程中目的基因的得率問題，在一定范圍內(nèi)還可以提高PCR法的特異性。②不同的抽提方法，DNA得率不同;

因此，如果沒有統(tǒng)一的血清標(biāo)本處理方法，那么基因定量檢測(cè)的準(zhǔn)確性如何得到保證呢？這個(gè)問題在作PCR定量時(shí)顯得尤為突出。

定量PCR法的原理是把“反應(yīng)管”中的目的基因指數(shù)級(jí)地?cái)U(kuò)增到一定水平，再通過產(chǎn)物雜交，并與設(shè)定的內(nèi)參照對(duì)比，推算“反應(yīng)管”內(nèi)的目的基因含量，并不等于原待測(cè)標(biāo)本內(nèi)的真正含量，因此血清標(biāo)本處理過程種的目的基因的丟失及丟失量均無法計(jì)算。由于基因突變所致PCR法假陰性的問題慢活肝，血清HBVDNA檢測(cè)陰性？

PCR引物設(shè)計(jì)原則：篩選出陽(yáng)性率“最高”的一對(duì)引物從整體上看，PCR的漏檢率可能很低，但漏檢如果發(fā)生在某一個(gè)具體病人則是100%。第一，我們有沒有更積極的措施，最大限度地減少假陰性？第二，臨床醫(yī)生是否對(duì)DNA檢測(cè)技術(shù)的局限性有足夠認(rèn)識(shí)？是不是僅憑一張檢驗(yàn)報(bào)告的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，作出HBV感染是與否的判斷？基因檢測(cè)和免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)具有互補(bǔ)性

基因檢測(cè)判斷病原體的有無和量的多少

機(jī)體作出了何種反應(yīng)？程度如何？反應(yīng)的結(jié)果如何？preS1對(duì)乙肝診斷的獨(dú)特作用1、preS1作為嗜肝侵蝕性的標(biāo)志與HBsAg同時(shí)檢測(cè)；結(jié)果相互印證，診斷乙肝更準(zhǔn)確。夾心法測(cè)PreS1抗原PreS1PreS2HBsAgpreS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用2、解決HBeAg漏檢帶來的誤診，提供判斷病毒復(fù)制的可靠指標(biāo)。HBsAg

(＋)組preS1抗原和HBeAg的關(guān)系試驗(yàn)單位HBsAg

(＋)HBeAg(+)Pre-S1(+)A247例86（34.8％）157（63.6％）B245例77（31.4％）145（59.2％）C328例115（35.1％）217（66.1%）合計(jì)820例278（33.9%）519（63.3％）前S1抗原與E系統(tǒng)的關(guān)系HBeAg合計(jì)+-PreS1+330197527-89300389合計(jì)419497916PreS1陽(yáng)性組中HBeAg陽(yáng)性率62.6%;HBeAg陰性組中PreS1陽(yáng)性率39.6%;前S1抗原與E系統(tǒng)以及DNA的關(guān)系PreS1抗原（＋）HBV-DNA（＋）HBeAg+83.97%(1226/1460)86.70%(554/639)_48.54%(1099/2265)60.69%(315/519)前S1抗原與E系統(tǒng)以及DNA的關(guān)系PreS1抗原（＋）HBeAg（＋）HBV-DNA+84.9%(653/769)58.6%(450/769)_9.5%(37/389)12.1%(47/389)preS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用3、彌補(bǔ)乙肝DNA檢測(cè)的假陰性

在已經(jīng)開展DNA檢測(cè)的單位，如果DNA陰性的病例，建議加查PreS1,這時(shí)如果再有ALT陽(yáng)性，高度懷疑肝炎活動(dòng)期。Expressionof3co-terminalenvelopeproteinsofHBVpreS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用安徽阜陽(yáng)肝病研究所張金良

---313例慢性肝炎患者PreS1抗原和DNA檢測(cè)數(shù)據(jù)比較血清免疫標(biāo)志物模式例數(shù)HBV-PreS1陽(yáng)性例數(shù)（%）HBV-DNA陽(yáng)性例數(shù)（%）HBsAg+HBeAb+HBcAb+14078（55.71%）41（29.29%）HBsAg+HBcAb+173118（68.21%）79（45.66%）preS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用

4、preS1與肝損傷直接相關(guān)，判斷治療效果比DNA更準(zhǔn)確。preS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用首都醫(yī)科大學(xué)閔福援

39例急性乙肝患者血清HBV-DNA與ALT間的動(dòng)態(tài)變化時(shí)間（周）例數(shù)HBV-DNA陽(yáng)性例數(shù)（%）PreS1陽(yáng)性陽(yáng)性例數(shù)（%）ALT大于40U/L例數(shù)（%）1-53935（90%）26（67%）30（76%）6-103525（71%）11（31%）9（25%）11-30217（33%）3（14%）2（10%）不同病程的HBV-DNA與ALT相比差異有顯著性，而PreS1抗原與ALT相比無顯著差異，PreS1抗原可以判斷治療效果。PreS1先于DNA轉(zhuǎn)陰提示預(yù)后良好。

5、PreS1抗原在AHB病程中先于HBV-DNA轉(zhuǎn)陰，較早預(yù)示病情好轉(zhuǎn)，可用于判斷預(yù)后，比DNA更有意義。preS1對(duì)乙肝臨床診斷的獨(dú)特作用診斷用基因工程抗體分子的制備基因工程抗體的優(yōu)勢(shì)抗體分子超變區(qū)點(diǎn)突變

--------使得抗體活性高于天然分子抗體，從而提高試劑的敏感度。抗體分子恒定區(qū)改造

-------避免人抗鼠抗體的干擾，有效提高了試劑的特異性。傳統(tǒng)preS1診斷試劑存在的問題傳統(tǒng)preS1診斷試劑抗體位點(diǎn)不全，影響檢出率。與DNA檢測(cè)結(jié)果符合率較低一步法的試劑敏感度低，影響對(duì)乙肝的正確診斷。威高生物preS1診斷試劑的特點(diǎn)獨(dú)家采用基因工程抗體新技術(shù)。準(zhǔn)確度高，真正發(fā)揮PreS1的診斷優(yōu)勢(shì)。提高乙肝診斷的準(zhǔn)確性，維護(hù)醫(yī)生和檢驗(yàn)師的良好聲譽(yù)。傳統(tǒng)preS1試劑

威高新一代preS1試劑項(xiàng)目傳統(tǒng)preS1診斷試劑威高基因工程抗體preS1診斷試劑核心技術(shù)單克隆抗體基因工程抗體HBeAg陰性PreS1陽(yáng)性率20~40%50~60%與DNA符合率60~70%80~95%對(duì)比總結(jié)傳統(tǒng)preS1試劑

威高新一代preS1試劑血清例數(shù)傳統(tǒng)preS1試劑威高preS1試劑乙肝DNA53陰性陽(yáng)性陽(yáng)性2陰性陽(yáng)性陰性性能對(duì)比研究不同質(zhì)量preS1試劑

對(duì)乙肝診斷的準(zhǔn)確性影響很大模式例數(shù)DNA陽(yáng)性率某preS1試劑（兩步法）某preS1試劑（一步法）HBsAg+HBeAg+7197.2%70.4%31.0%HBsAg+HBeAg-15657.1%39.1%16%華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院彭靜《臨床檢驗(yàn)雜志》2006年第3期檢驗(yàn)兩對(duì)半為何還要查Pre-S1？

1．前S1抗原出現(xiàn)在急性乙型肝炎感染的早期，在轉(zhuǎn)氨酶升高前即可查出，提示可作為早期診斷乙肝病毒感染的指標(biāo)。

2．急性乙型肝炎患者前S1抗原陰轉(zhuǎn)越早，預(yù)后越好，是病毒清除的最早跡象。反之，前S1抗原持續(xù)陽(yáng)性，將發(fā)展至慢性肝炎。（比HBeAg陰轉(zhuǎn)、HBsAb陽(yáng)轉(zhuǎn)指標(biāo)提示要早）。

3．HBeAg（-）慢性乙型肝炎約占慢性乙肝的30%-50%，檢測(cè)前S1抗原，提示病毒在機(jī)體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制，此類患者更容易演變?yōu)楦斡不蚋伟?。加查前S1抗原，彌補(bǔ)了因HBeAg缺失造成的診斷和治療困難。

4．在HBV無癥狀攜帶者中，有一定比例的HBeAb（+）者，加查前S1抗原（+）提示病毒在體內(nèi)還較活躍。病毒并沒有清除，肝臟還有潛在的病理?yè)p傷的可能。

5．抗病毒治療乙型肝炎，加查前S1抗原可作為治療前的患者篩查和治療后的療效判斷，尤其對(duì)HBeAb（+）的慢性肝炎患者抗病毒治療的排查也起到重要作用。

所以檢驗(yàn)兩對(duì)半，加查前S1抗原可在急性肝炎，慢性肝炎，HBV無癥狀攜帶者和抗病毒治療乙型肝炎診療過程中起到十分重要的作用。

為什么檢測(cè)HBV-DNA還要檢測(cè)前S1抗原？

1．在病毒感染機(jī)體的整個(gè)周期中，前S1蛋白的獨(dú)特功能，使其能夠較充分的反應(yīng)機(jī)體的體液免疫狀況，直至病程的轉(zhuǎn)歸過程,如早期診斷，急性肝炎前S1抗原陰轉(zhuǎn)是病毒清除的最早跡象，反之疾病將發(fā)展至慢性肝炎等臨床診斷以及前S1抗原陰轉(zhuǎn)，前S1抗體出現(xiàn)等免疫學(xué)反應(yīng)）這是單一測(cè)定HBV-DNA所不能做到的。

2．免疫測(cè)定技術(shù)因其有效、直接、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，已經(jīng)在臨床診斷應(yīng)用上