無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚的免疫機制與效果研究,漁業(yè)論文_第1頁
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文檔簡介

無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚的免疫機制與效果研究,漁業(yè)論文無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)又稱B群鏈球菌(groupBstreptococci,GBS),在自然界,也是一種重要的水產(chǎn)動物致病菌。魚類無乳鏈球菌病的流行與爆發(fā)在很多國家均有報道,給羅非魚養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。近年來,魚類無乳鏈球菌病在我們國家的發(fā)生率呈上升趨勢,十分是位于我們國家南部的廣東、廣西和海南等地爆發(fā)嚴(yán)重。當(dāng)前,對于羅非魚鏈球菌病的防治方式方法多樣,華而不實使用疫苗免疫是最重要的方式方法之一。因而,我們國家正大力發(fā)展羅非魚無乳鏈球菌病疫苗的研究,并獲得一定進展。本試驗利用自行研制的無乳鏈球菌口服疫苗免疫羅非魚,應(yīng)用HE染色方式方法觀察腸絨毛形態(tài)構(gòu)造、杯狀細胞以及上皮內(nèi)淋巴細胞的分布和數(shù)量,討論該疫苗的免疫機制及不同免疫劑量的免疫效果,以期為該疫苗的深切進入研究和推廣應(yīng)用積累資料。1、材料與方式方法1.1材料試驗用羅非魚由廣西水產(chǎn)研究所國家級羅非魚良種場提供,體重為100g10g,體長為15cm2cm;無乳鏈球菌GX035弱毒苗由廣西水產(chǎn)研究所魚類病害防治實驗室提供。1.2方式方法1.2.1飼養(yǎng)管理羅非魚飼養(yǎng)于室內(nèi)水箱中(規(guī)格:70cm50cm40cm),各組水質(zhì)均為脫氯自來水,全天供氧。試驗期間水溫保持在27℃~29℃,每周換水2/3。天天飼喂2次(8:00和16:00),日投飼率為2%~3%。1.2.2試驗分組與處理選用體重為100g10g,體長為15cm2cm的健康羅非魚共125尾,隨機分為5個試驗組,每組25尾魚。免疫前馴養(yǎng)2周。試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組為免疫組,分別投喂劑量為1.0106、1.0107、1.0108、1.0109CFU/mL的口服型無乳鏈球菌GX035弱毒苗(每100g飼料用100mL相應(yīng)濃度的菌懸液拌勻后在50℃烘箱中烘干),試驗Ⅴ組為空白對照組,投喂未添加疫苗的飼料,根據(jù)2.5g/尾進行投喂。1.2.3組織切片制備免疫接種15d后,從各組中隨機抽取1尾(共5尾)羅非魚進行解剖,迅速取出前腸、中腸和后腸分別制樣。前腸在胃后端至腸道的第一個彎曲之間取材,中腸在腸道的第一個彎曲至最后一個彎曲之間取材,后腸在腸道最后一個彎曲至肛門之間取材,各腸段長度約1cm。將腸段浸入pH7.2~7.4的磷酸鹽緩沖液中沖洗腸道內(nèi)容物,使用Bouin固定液固定各腸段后,制作石蠟切片,HE染色,顯微鏡觀察。1.2.4各指標(biāo)的形態(tài)觀察和測量參照黃玉章等提供的方式方法,每段腸道選取5張染色效果較好的切片于400倍鏡下對下面指標(biāo)進行觀察:腸絨毛、各腸段肌層厚度、杯狀細胞、上皮內(nèi)淋巴細胞,并應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)(Superimageverson6.0.1.2)對其進行拍照和測量。1.2.5攻毒試驗免疫20d后,所有魚(各組均為20尾)均根據(jù)1.67107CFU/尾的劑量腹腔注射感染無乳鏈球菌,記錄攻毒后10d內(nèi)各組魚的死亡數(shù),并計算相對免疫保衛(wèi)率(RPS)。1.2.6數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件的單因素方差分析進行生物學(xué)統(tǒng)計。結(jié)果用平均值標(biāo)準(zhǔn)差表示。P0.05為差異顯著,P0.01為差異極顯著,P0.05為差異不顯著。2、結(jié)果2.1羅非魚腸絨毛長度的變化各試驗組不同腸段的腸絨毛長度均呈現(xiàn)前腸最長,中腸次之,后腸最短的規(guī)律。免疫組與對照組不同腸段腸絨毛長度相比,差異均不顯著(P0.05)(表1)。2.2羅非魚腸道肌層厚度的變化各試驗組不同腸段的肌層厚度均呈現(xiàn)前腸最薄,中腸次之,后腸最厚的規(guī)律。免疫組與對照組相比擬,前腸肌層厚度:免疫Ⅰ組與對照組相比有增厚,但差異不顯著(P0.05),免疫Ⅱ組~Ⅳ組較對照組增加20.96%、20.09%、31.51%,差異極顯著(P0.01);中腸肌層厚度:免疫Ⅰ組與對照組相比有縮短,但差異不顯著(P0.05),免疫Ⅱ組~Ⅳ組較對照組均有增加趨勢,華而不實免疫Ⅳ組較對照組增加17.01%,差異極顯著(P0.01);后腸肌層厚度:各免疫組較對照組均增厚,華而不實免疫Ⅱ組增加10.95%,差異顯著(P0.05),免疫Ⅳ組增加19.41%,差異極顯著(P0.01)(表2)。2.3羅非魚腸道黏膜的形態(tài)構(gòu)造觀察腸黏膜層具有環(huán)形皺襞、腸絨毛和小腸腺,黏膜上皮由柱狀細胞、杯狀細胞和內(nèi)分泌細胞等組成。400倍鏡下觀察,各組腸段腸黏膜都較完好,層次分明。腸絨毛排列整潔,腸黏膜上皮細胞形狀規(guī)則,排列嚴(yán)密,染色鮮明。各免疫組腸絨毛頂端稍有脫落,固有層中軸稍有增寬(圖1)。2.4對杯狀細胞分布及數(shù)量的影響羅非魚腸道組織經(jīng)HE染色后,顯微鏡下觀察杯狀細胞呈藍色或空泡狀。各腸段上皮均有杯狀細胞分布,散在分布于柱狀細胞之間,其頂部胞質(zhì)因大量糖原顆粒擁塞而膨脹,底部纖細,呈高腳杯狀。HE染色后,其頂部多糖成分因水解而呈現(xiàn)空泡狀(圖1)。免疫后各免疫組腸道內(nèi),呈藍色的杯狀細胞數(shù)量均比對照組有所減少,差異極顯著(P0.01)(表3)。2.5對上皮內(nèi)淋巴細胞分布及數(shù)量的影響對照組腸道上皮內(nèi)淋巴細胞多數(shù)位于上皮細胞基膜附近,少量見于上皮游離面,各免疫組腸道上皮淋巴細胞的分布則有所不同,上皮游離面的淋巴細胞增加,而且在固有層的分布亦增加,出現(xiàn)聚集現(xiàn)象(圖1)。各免疫組前腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量與對照組相比擬,差異均不顯著(P0.05);免疫各組中腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量與對照組相比擬均顯著增加,華而不實免疫Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組分別比對照組增加31.97%、31.51%、42.43%,差異極顯著(P0.01),免疫Ⅲ組增加19.66%,差異顯著(P0.05);免疫各組后腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量與對照組相比擬也均顯著增加,華而不實免疫Ⅰ組(1.0106CFU/mL)、免疫Ⅱ組(1.0107CFU/mL)和免疫Ⅳ組(1.0109CFU/mL)分別比對照組增加34.82%、33.21%、38.32%,差異極顯著(P0.01),免疫Ⅲ組(1.0108CFU/mL)比對照組增加27.09%,差異顯著(P0.05)(表4)。2.6攻毒后的保衛(wèi)效果試驗Ⅰ~Ⅳ組的相對保衛(wèi)率分別為16.67%、27.78%、55.56%和66.67%,Ⅳ組相對保衛(wèi)率最高(表5)3、討論腸上皮內(nèi)淋巴細胞是一群特殊的淋巴細胞,主要見于腸絨毛上皮細胞間,是機體免疫系統(tǒng)中與外來抗原以及微生物最先接觸的免疫細胞,介入腸道黏膜免疫反響,處于免疫防御的第一線。腸黏膜上皮與腸腔大量微生物、食物抗原接觸后,可通過調(diào)節(jié)腸上皮內(nèi)淋巴細胞以預(yù)防腸腔致病微生物侵襲和對無害抗原產(chǎn)生耐受。因而,腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量的變化在一定程度上反映腸道局部黏膜免疫反響狀況。黃春蘭等研究表示清楚,口服免疫ISCOMs疫苗一定時間后能夠刺激腸上皮內(nèi)淋巴細胞增殖,且不同腸段的變化規(guī)律不同;前、中腸變化趨勢類似,均表現(xiàn)為先下降后上升,華而不實免疫后14d腸上皮內(nèi)淋巴細胞與對照組相比總體呈下降趨勢,21d后數(shù)量開場上升,而后腸上皮淋巴細胞在免疫后7d小幅上升后持續(xù)降低,21d后到達試驗期間最低值。研究結(jié)果表示清楚,免疫后15d,中、后腸上皮內(nèi)淋巴細胞與對照組相比總體呈上升趨勢,且免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL效果最明顯;而前腸上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量與對照組相比差異均不顯著。表示清楚口服疫苗后,疫苗直接進入腸道,可激活上皮內(nèi)淋巴細胞。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量變化規(guī)律不同,不同濃度的疫苗免疫后產(chǎn)生的效果不同,免疫后15d,免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量增殖最多,效果最明顯。不同腸道上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量變化呈現(xiàn)不同規(guī)律,分析原因可能是前、中、后腸的生理構(gòu)造不同,進而免疫功能有所區(qū)別,但不同腸道上皮內(nèi)淋巴細胞數(shù)量變化的詳細規(guī)律以及對魚體免疫功能的影響還需進一步深切進入研究析。黏液細胞是黏液分泌的生理基礎(chǔ),它是魚類上皮中的一種腺體細胞,廣泛分布在皮膚、鰓、消化道等部位。這類細胞分泌的黏液除了具有機械性屏障、化學(xué)屏障,調(diào)節(jié)浸透壓、潤滑等作用外,黏液中含有的黏多糖、糖蛋白、免疫球蛋白及各種水解性酶類等非特異性的免疫活性物質(zhì),可抵抗病原微生物入侵,進而保衛(wèi)魚體不受細菌、病毒等的損害。杯狀細胞是典型的黏液細胞,主要分布于消化道和呼吸道黏膜的上皮內(nèi)。正常情況下,底部狹窄構(gòu)成長柄狀附著于基膜上,頂部充滿分泌顆粒而膨大,呈高腳杯狀,經(jīng)HE染色后為藍色或空泡狀。杯狀細胞是腸道黏膜免疫應(yīng)答的重要成員,其數(shù)量及形態(tài)的變化在一定程度上反映腸道的局部免疫狀況。本試驗結(jié)果表示清楚,各免疫組腸道內(nèi),呈藍色的杯狀細胞數(shù)量均比對照組有所減少,差異極顯著(P0.01),但呈空泡狀的杯狀細胞明顯增加,且主要分布于腸絨毛底部或上部。表示清楚經(jīng)口服免疫后,杯狀細胞呈現(xiàn)活潑踴躍的分泌狀態(tài),無乳鏈球菌弱毒苗在一定程度上能加強腸道杯狀細胞的合成分泌功能。除此之外,良好的腸道黏膜形態(tài)構(gòu)造對保持魚類的健康及維持正常生產(chǎn)性能具有重要意義。研究結(jié)果表示清楚,各免疫組腸黏膜都較完好,但均發(fā)現(xiàn)腸絨毛頂端稍有脫落,固有層中軸稍有增寬的現(xiàn)象,表示清楚弱毒苗免疫后,羅非魚相關(guān)免疫反響被激活,腸道會發(fā)生稍微的炎癥反響,出現(xiàn)腸道組織構(gòu)造稍微損傷等現(xiàn)象。賴翔等研究證明,飼糧添加蘇氨酸能在一定程度上減緩PRV弱毒苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)激帶來的斷奶仔豬生長性能下降和腸道損傷;一些研究證明,黃芪多糖、低聚木糖、木聚糖酶等飼料添加劑可促進魚的生長發(fā)育,促進受損腸黏膜細胞的修復(fù);因而在使用無乳鏈球菌弱毒苗免疫時,可在飼養(yǎng)經(jīng)過中適當(dāng)配合使用飼料添加劑,以改善弱毒苗的不良影響。組織學(xué)觀察表示清楚,無乳鏈球菌口服弱毒疫苗可刺激腸道上皮內(nèi)淋巴細胞活化增殖,促進腸道杯狀細胞的合成及分泌功能等,華而不實以免疫Ⅳ組1.0109CFU/mL變化最為明顯;同時攻毒感染試驗結(jié)果顯示,免疫組的羅非魚因不同免疫

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