臨床輸血學檢驗(技術)：5白細胞抗原系統(tǒng)檢測

第四章白細胞抗原檢測技術P74臨床血液教研室第一節(jié)HLA檢測技術P781、血清學方法2、細胞學方法3、分子生物學方法HLA檢測技術由抗原檢測等位基因檢測HLA分型技術的應用器官和造血干細胞移植供受者組織相容性配型血小板輸注前的配型疾病相關實驗性診斷法醫(yī)鑒定和親子鑒定等。一、血清學分型方法血清學分型方法是用一系列已知的抗HLA抗原的標準分型血清來檢測未知淋巴細胞表面的HLA抗原型別。需要HLA抗體作為分型試劑采用微量淋巴細胞毒試驗測定HLA-A、B、C位點上的等位基因。1.微量淋巴細胞毒實驗P74

1964年，Terasaki建立微量淋巴細胞毒實驗仍是目前HLA抗原鑒定的標準方法條件：有活力的T,B淋巴細胞

HLA分型標準血清（大部分是IgG）原理待檢淋巴細胞膜表面若具有特異HLA抗原，可與HLA特異性抗體結合形成抗原抗體復合物，在補體介導下發(fā)生細胞毒反應而被殺傷。加入適當?shù)娜玖希ㄈ缡锛t）后，被殺傷的淋巴細胞膜通透性增加，染料進入細胞內，細胞著色；若淋巴細胞不帶有HLA抗原，抗原抗體未結合，則細胞膜完整，染料不能使細胞著色。在倒置顯微鏡下估計著色細胞的百分比來判斷抗原、抗體反應的強度。方法評價與注意事項

1．血清學分型技術可以檢測HLA-I類抗原，但此技術用于檢測HLA-II類抗原難度較大，主要因為：（1）HLA-II類抗原在未激活的T細胞上不表達，需分離純化B淋巴細胞。（2）HLA-II類抗原多態(tài)性由雙等位基因構成，很難準確判定相應等位基因產物的抗原特異性。2．HLA標準分型抗血清試劑的質量是試驗的關鍵。（1）HLA抗血清應使用單克隆抗血清。（2）抗體效價要適宜。（3）抗血清種類應覆蓋本民族、本地區(qū)80%以上的HLA抗原。3.淋巴細胞：高活性，純度應大于90%4.試驗應在20～25℃的室溫條件下進行，才能獲得最佳的反應效果。5.補體來源一般采用多只健康家兔血清混合。由于兔補體（兔血清）中無天然細胞毒抗體，不會引起假陽性反應。6．加入染料之后須加入甲醛，甲醛固定能使活細胞具有更大的折光性，易于與死細胞區(qū)別。7．每塊反應板應設立陰性對照（陰性對照血清一般采有AB型男性、無受血史者血清）和陽性對照（陽性對照孔中加入抗人淋巴細胞球蛋白），在陰性對照結果為陰性、陽性對照結果為陽性反應時，判讀結果才可靠。8．HLA血清學分型技術雖經典，但存在標本血淋巴細胞高活力和純度難以保證，HLA抗血清試劑存在交叉反應、弱反應及額外反應等眾多因素，導致HLA血清學分型錯誤率較高，目前血清學方法已逐漸被基因分型技術所取代。二、HLA細胞學分型技術P77對HLA-D抗原特異性進行分型，曾利用該技術鑒定了多個HLA-D、HLA-DP抗原。但由于該分型技術細胞來源困難、操作繁瑣、試驗流程長，不適合常規(guī)檢測，而且該方法指定抗原偏差較大，故該分型技術已逐漸被淘汰。三、HLA的基因分型技術自1996年，以DNA為基礎的HLA的基因分型技術日趨成熟，并逐漸取代血清學方法和細胞學方法。成為最準確的分型技術。HLA基因分型檢測是檢測個體HLA座位上的等位基因序列情況HLA血清學技術和細胞分型技術是檢測HLA座位上的抗原情況特點：精確，可靠，重復性好。歧義結果低分辨分型：*后第2位（抗原分解物水平分型）高分辨分型：*后第4－8位（等位基因水平分型）HLA的基因分型方法的種類1、基于HLA基因序列不同為基礎;2、基于HLA等位基因在PAGE中不同的構象而設計。1.基于HLA基因序列不同為基礎

PCR-SBT（PCR-直接測序分型）PCR-SSO（PCR序列特異性寡核苷酸探針）PCR-RFLP（PCR限制性片段長度多態(tài)性）PCR-SSP（PCR序列特異性引物）基因芯片技術Qiagen/OlerupSSP低分辨試劑

Qiagen/OlerupSSP高分辨試劑采用美國OneLambda公司PCR-SSP

ABDRDQ配型試劑盒腎移植供受者雙方進行HLA基因分型Qiagen/OlerupSBT測序分型試劑

2.基于HLA等位基因在PAGE中不同構象而設計PCR指紋技術PCR-SSCP：PCR單鏈構象多態(tài)性RSCA：參比鏈介導的構象分析HLA分子生物學檢測方法評價

HLA基因分型法與血清學及細胞學分型方法比較，具有分辨率高、錯誤率少、樣本需要量少、樣本可長期保存、分型試劑可大量制備且來源不受限制、試驗結果精確、可靠、重復性好等優(yōu)點。HLA高分辨分型中歧義結果

HLA具有極為復雜的多基因性和高度多態(tài)性。隨著HLA等位基因的增多，同一位點不同等位基因之間的堿基差異序列較少，導致大量等位基因堿基序列高度同源，基因檢測時可得到歧義的分型結果，不能明確指定某一基因型，特別是在高分辨率分型時。HLA抗原可引起免疫應答產生HLA抗體。HLA抗體在臨床上具有重要意義，可誘發(fā)移植的超急性排斥反應、發(fā)熱性非溶血性輸血反應、血小板輸注無效等。第二節(jié)HLA抗體檢測群體反應性抗體（PRA）群體反應性抗體（panelreactiveantibody，PRA）是指器官移植受者體內存在的抗HLA抗體。也可因妊娠、反復輸血等而產生，與移植物排斥反應及受者存活率密切相關。PRA測定是篩選各種組織器官移植致敏受者和了解患者術后體內抗體水平簡便易行的方法。PRA抗體檢測方法1、補體依賴的淋巴細胞毒方法2、ELISA3、流式細胞術1.補體依賴的淋巴細胞毒方法－CDC適用：HLA-I，II類抗體，包括IgG，IgM包括：淋巴細胞毒交叉配合試驗

OneLambda細胞板方法特點：靈敏度低，只能檢測補體結合的抗體，不能檢測非補體依賴的抗體，不能區(qū)分HLA特異性抗體和非特異性抗體。腎移植前－群體反應性抗體PRA檢測

淋巴細胞毒試驗原理：將病人的血清與數(shù)十份含不同HLA抗原的淋巴細胞作細胞毒抗體測定來系統(tǒng)了解移植前患者的抗體水平，判斷移植的可能性及與供者有陽性交叉的百分比。

結果判斷：通常將PRA值分為非致敏（＜10%），輕度致敏（10%-50%），高致敏（＞50%）。

2.ELASA方法特點：更敏感，特異性好，可檢測HLA特異性抗體，可檢測補體依賴或者非依賴的HLA抗體，可定量。應用：微量ELASA篩選HLA-I，II類抗體3流式細胞術普通流式細胞術免疫磁珠流式細胞儀：基于FCM和免疫標記技術的結合，以微球磁珠為靶細胞。Luminex100/200－液相芯片

Luminex檢測技術用于HLA抗體檢測原理：以包被抗原的微球作為靶細胞，每種微球包被一種抗原，多種微球可以在同一體系內反應。當加入待檢血清與微球在室溫下孵育時，若待檢血清中存在HLA